Introducción

Clásicamente se consideró que los coronavirus eran patógenos leves para los seres humanos, responsables de resfríos comunes e infecciones respiratorias leves en pacientes sin compromiso inmunológico. Sin embargo, la aparición de enfermedades zoonóticas altamente patogénicas causadas por coronavirus, como síndrome respiratorio agudo grave (Severe Acute Respiratory Syndrome [SARS]), síndrome respiratorio de Medio Oriente (Middle East Respiratory Syndrome [MERS] y, más recientemente, SARS-CoV-2, ha generado y sigue generando desafíos importantísimos en el ámbito de salud pública.

Los coronavirus se transmiten esencialmente por gotitas de secreciones respiratorias; sin embargo, al igual que para SARS y MERS se ha detectado ARN de SARS-CoV-2 en heces de pacientes con enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19 por su sigla en inglés) y en portadores asintomáticos. La duración de la eliminación viral varía de un paciente a otro, de 14 a 21 días en promedio; asimismo la magnitud de la eliminación es sumamente variable, de 10² a 10⁸ copias de ARN por gramo.

Los virus infecciosos que se eliminan por materia fecal y orina pueden cultivarse en células Vero E6; además se ha comprobado infección por SARS-CoV-2 en células epiteliales gástricas, duodenales y rectales, un fenómeno que sugiere que la eliminación de virus por el tracto gastrointestinal podría representar otra forma de transmisión (fecal-oral). Sin embargo, por el momento el papel epidemiológico de esta vía de transmisión no se ha determinado.

La monitorización de aguas residuales permite conocer las actividades de los habitantes, mediante la detección de sustancias químicas o biológicas que reflejan el consumo de drogas ilícitas, uso o abuso de productos farmacéuticos, contaminación del agua y aparición de genes de resistencia a los agentes antimicrobianos. Asimismo, en el contexto del programa global de erradicación, la monitorización de aguas residuales ha sido útil para la detección de material genético de virus entéricos, virus de hepatitis E, una zoonosis emergente, y poliovirus. Diversos estudios realizados recientemente en distintas regiones del mundo confirmaron la presencia de ARN de SARS-CoV-2 en aguas residuales, motivo por el cual se ha sugerido que la vigilancia epidemiológica de las aguas residuales ayudaría a conocer, de forma precoz y no invasiva, el estado y la tendencia de la infección por SARS-CoV-2, de modo de implementar las medidas correspondientes por parte de las autoridades sanitarias.  En el escenario actual de pandemia de COVID-19, la vigilancia ambiental de aguas residuales podría utilizarse como estrategia para coordinar la finalización gradual de las cuarentenas.

En el presente estudio se comunica por primera vez la detección de ARN de SARS-CoV2 en muestras de aguas residuales no tratadas en España, recogidas en 6 estaciones depuradoras de aguas residuales (EDAR) diferentes en Murcia, la zona con la prevalencia más baja de COVID-19 en España. Se confirma la eficacia de los tratamientos terciarios implementados por las EDAR contra SARS-CoV-2. La vigilancia epidemiológica en una zona con un número bajo de casos diagnosticados de COVID-19 pone de manifiesto la necesidad de crear e implementar modelos avanzados de epidemiología de aguas residuales (EAR).

Materiales y métodos

Se tomaron muestras de aguas afluentes y efluentes con tratamiento secundario y terciario de 6 EDAR localizadas en las principales ciudades de la Región de Murcia, España. Entre 12 de marzo y 14 de abril se recogieron 42 muestras de afluentes, y 18 y 12 muestras de efluentes con tratamiento secundario y terciario, respectivamente, para investigar la presencia de ARN de SARS-CoV-2. En todos los casos se tomaron entre 500 y 1000 ml de aguda en recipientes estériles, por la mañana (de 7:00 am a 12:00 am). Las muestras se mantuvieron refrigeradas; el proceso de concentración se llevó a cabo en el transcurso de 24 horas. Se analizaron submuestras de 200 ml.

Según el método estándar ISO 15216-1, 2017, para el proceso de evaluación del protocolo de concentración del agua se utilizó el virus de la diarrea epidémica porcina (porcine epidemic diarrea virus [PEDV]), cepa CV777, un virus con envoltura que pertenece a la familia Coronaviridae, género Alphacoronavirus, y el mengovirus (MgV) vMC0, un virus sin envoltura, perteneciente a la familia Picornaviridae. Para la concentración del agua se aplicó precipitación y adsorción con hidróxido de aluminio, un método previamente descripto para la concentración de virus entéricos en aguas residuales. Para la detección de ARN viral se utilizaron equipos de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real por transcripción inversa (RT-qPCR por su sigla en inglés). En el caso de SARS-CoV-2 se utilizó el panel de ensayos de RT-qPCR validado por los CDC de los Estados Unidos, aptos para la detección de tres regiones del gen de la nucleocápside (N) del virus.

Resultados y discusión

El método de precipitación-adsorción con hidróxido de aluminio se probó mediante el agregado de MgV y PEDV en afluentes y efluentes; en promedio, el primero se recuperó en el 11% y 6.2% de afluentes y efluentes, respectivamente, mientras que PEDV se recuperó en 11% y 3.3% en promedio, en el mismo orden. No se encontraron diferencias significativas entre los índices de recuperación en aguas afluentes, un hallazgo que sugiere que un virus sin envoltura podría ser usado como control del proceso para la detección de coronavirus. Por el contrario, se observaron diferencias importantes en los índices de recuperación de PEDV y MgV en muestras de efluentes. Los resultados coincidieron con los índices de recuperación de MgV, referidos para la concentración de virus entéricos en muestras de agua tratadas con el mismo método a base de aluminio, y más altos que el 1% aplicado como control de calidad al agua embotellada según las pautas ISO 15216-l: 2017.

La filtración a través del dispositivo centrífugo Centricon® Plus-70 de 10 kDa permitió recuperar con éxito SARS-CoV-2 de aguas residuales, con índices de recuperación de fagos ARN F-específicos de 73%. Sin embargo, la concentración por membrana electropositiva deberá ser analizada meticulosamente, debido al índice de recuperación de SARS-CoV-2 en aguas residuales de 1%. Se deben establecer límites rigurosos de detección, pero la necesidad de disponer de laboratorios con nivel de bioseguridad BSL3 es la principal limitación para los estudios.

Títulos de SARS-CoV-2 en aguas residuales y efluentes

Las muestras tomadas en octubre de 2019, antes de que las autoridades locales y nacionales comunicaran el primer caso de COVID-19, fueron negativas con las tres RT-qPCR utilizadas, de modo que se descartan reacciones falsas positivas. En cambio, el 83% de las muestras de afluentes y el 11% de las muestras con tratamiento secundario fueron positivas para SARS-CoV-2 con, al menos, uno de los tres tipos de ensayos. Ninguno de los efluentes con tratamiento terciario resultó positivo para SARS-CoV-2. En promedio, los títulos de SARS-CoV-2 fueron de 5.1 a 5.5 log₁₀ copias genómicas (gc)/l; en Massachusetts y Francia se refirieron títulos de 4 y de 5 a más de 6 log₁₀ gc/l, respectivamente.

En concordancia con lo referido con anterioridad, se observaron resultados discrepantes entre los ensayos de RT-qPCR para la detección de N1, N2 y N3, probablemente por diferencias en la sensibilidad de las distintas pruebas. Es posible que se logren estimaciones más sensibles de la carga de SARS-CoV-2 por RT-qPCR digital, un procedimiento apto para la cuantificación de muestras con cargas virales bajas, como se refirió para norovirus en aguas residuales y para SARS-CoV-2 en muestras clínicas. Se destaca, sin embargo, que este procedimiento podría no ser la opción más rentable en términos de vigilancia epidemiológica.

Asimismo, si bien la detección de ARN de SARS-CoV-2 en aguas residuales es útil en términos de EAR, los riesgos para la salud de los seres humanos en relación con la infectividad de las partículas virales y la posible transmisión fecal-oral deberán ser confirmados en estudios futuros. De hecho, en un ensayo previo, el riesgo fue insignificante, ya que las partículas virales de SARS-CoV-2, a pesar de estar presentes en números elevados de copias, no pudieron cultivarse. Sólo en un estudio se aislaron virus viables en muestra de heces; en otro estudio, los intentos  no fueron exitosos.

La posible transmisión de SARS-CoV-2 por aguas residuales no ha sido comprobada y parece poco probable por la escasa estabilidad de SARS-CoV-2 viable en esta fuente. Asimismo, la elevada sensibilidad de los coronavirus que afectan a los seres humanos a las condiciones ambientales y a los desinfectantes sugieren que el riesgo de transmisión por el agua sería muy bajo; aún así se deberán realizar análisis formales de riego.

Vigilancia epidemiológica

Los datos epidemiológicos para COVID-19 en la Región de Murcia se recuperaron de reservorios del Servicio de Epidemiologia de la Consejería de Salud de la Región de Murcia, y se graficaron como cargas promedio de ARN de SARS-CoV-2 en los tres tipos de ensayos de RT-qPCR. En general se detectaron señales de amplificación en la RT-qPCR de aguas residuales en aquellos municipios en los cuales se diagnosticaron casos de COVID-19- Se encontraron muestras positivas de aguas residuales, con al menos dos de tres ensayos de RT-qPCR, en municipios con prevalencia baja, como Murcia (96 casos, 21.18 casos por cada 100 000 habitantes), Cartagena (36 casos, 16.76 casos por cada 100 000 habitantes) y Molina de Segura (12 cases, 16.69 casos por cada 100 000 habitantes). Cabe mencionar que se obtuvieron muestras positivas de aguas residuales 12 a 16 días antes de que se comunicaran los primeros casos de COVID-19 en los  municipios de Lorca, Cieza y Totana. En un estudio previo de París se detectó material genético de SARS-CoV-2 antes de que ocurriera la fase exponencial de la epidemia. Los resultados del presente estudio indican que SARS-CoV-2 puede detectarse semanas antes de que se confirmen los primeros casos de enfermedad. La detección precoz de ARN de SARS-CoV-2 en aguas residuales podría constituir un “alerta” que permita anticiparse a la situación de demanda sanitaria inminente e implementar estrategias destinadas a retrasar la propagación de la enfermedad. Los hallazgos del presente estudio confirman que la EAR podría emplearse como un sistema precoz de monitorización de la infección por SARS-CoV-2 en la comunidad.

Asimismo, la vigilancia ambiental podría ser un instrumento para adoptar las decisiones correctas, en términos de no interrumpir las restricciones demasiado pronto, con la finalidad de reducir el riesgo de segundas olas o de recurrencias locales. Las pruebas masivas en la población representan el abordaje de elección en este sentido, pero cuando esta metodología no es accesible, la monitorización del agua podría ser un sustituto razonable, ya que aporta información confiable sobre la situación en un determinado momento.

Los datos obtenidos en aguas residuales no reflejan cuantitativamente la prevalencia de casos confirmados de COVID-19; en el futuro se deberán evaluar modelos que incluyan todas las variables que pueden afectar las características epidemiológicas, de modo de interpretar mejor los hallazgos que se obtienen en el contexto de la vigilancia. No todos los pacientes con COVID-19 eliminan SARS-CoV-2 en heces y, cuando esto ocurre, los títulos y la duración de la eliminación varían considerablemente de un enfermo a otro y en el transcurso del tiempo. Se destaca, además, que el número real de casos positivos en la región de Murcia no se conoce con precisión, debido a que la mayoría de ellos fueron leves o asintomáticos, y no se incluyeron en las estadísticas epidemiológicas. También se deberán incorporar modelos complejos para determinar las correlaciones entre diversas variables ambientales (lluvias, temperatura, tiempo de retención hidráulica en alcantarillas), la detección de ARN de SARS-CoV-2 en aguas residuales, y la prevalencia de COVID-19.

Conclusión

En términos generales, la vigilancia epidemiológica de las aguas residuales podría representar un método complementario para estimar la presencia, y tal vez la prevalencia, de COVID-19 en las comunidades; de confirmarse los datos disponibles hasta ahora, estas estrategias podrían ser aplicadas en el ámbito de salud pública para mejorar la asignación de recursos sanitarios y la prestación de servicios médicos, sobre todo en aquellas zonas con poca capacidad para efectuar pruebas masivas en la población.