Introducción

La autofagia, que comprende una serie de reacciones enzimáticas de digestión de las organelas y proteínas del citoplasma en las vesículas conocidas como autolisosomas, mediante la cual se realiza el reemplazo de distintos componentes celulares y se produce la energía requerida para diversos procesos metabólicos, asegura la supervivencia del osteoblasto en el tejido óseo y promueve su actividad en presencia de concentraciones altas de glucosa. En este sentido, se ha observado que la glucosamina, una aminoazúcar, mediante cascadas de señalización no relacionadas con mTOR, activa los mecanismos de autofagia y, en la terapia de la artrosis, produce el aumento de la masa ósea, lo que constituye un efecto beneficioso en pacientes de edad avanzada que suelen presentar un cuadro de osteoporosis asociado. Cabe destacar que si bien se desconocen las vías de señalización implicadas en la capacidad de la glucosamina para contrarrestar la osteoporosis, la activación de mecanismos antiinflamatorios mediada por dicho compuesto provocaría una mayor diferenciación del osteocito del linaje osteoblástico. La estimulación de la diferenciación y de la actividad de los osteoblastos constituye una estrategia terapéutica de relevancia fundamental en el control de la osteoporosis, ya que estas células derivadas de células madre mesenquimales, generan la matriz ósea (síntesis y secreción de componentes y depósito de minerales). De esta forma, la utilización de un tratamiento eficaz en la osteoporosis permitiría reducir la incidencia y la propensión a presentar fracturas osteoporóticas debido a la pérdida de masa ósea y de la estructura del hueso (la osteoporosis afecta de manera significativa a mujeres de edad avanzada; la probabilidad de experimentar fracturas vertebrales, en el extremo distal del radio y en la cadera, es del 45% en mujeres mayores 50 años, en un intervalo de diez años).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la implicancia de la glucosamina y la autofagia en la diferenciación del osteoblasto y las vías moleculares involucradas.

Métodos

El modelo utilizado fue la línea celular hFOB1.19, que constituye un linaje de osteoblastos de origen fetal. Estas células fueron cultivadas en medio DMEM-F12 con suero fetal bovino al 10% y antibióticos (penicilina/estreptomicina) al 1% (condiciones de crecimiento: uso de incubador con humidificación, a 37°C y presión de CO₂de 5%). Se establecieron diferentes grupos de tratamiento: el grupo control, en el cual las células crecieron en las condiciones antes mencionadas, y los grupos experimentales, en los que luego de mantener las células (6 x 10³ por pocillo, de placa de 96) en dichas condiciones durante un período de 24 horas, se reemplazó el medio de crecimiento por medio fresco que contenía, alternativamente, diferentes concentraciones de glucosamina (el efecto de cada concentración se evaluó en seis réplicas). La viabilidad celular se determinó en diferentes intervalos (0 a 72 horas) luego de la adición del medio con glucosamina, mediante la incubación de los diferentes grupos de células en 10 µl de solución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio)a una concentración de 5 mg/ml (duración: 4 horas). El MTT reducido precipita en cristales de formazano, lo cual implica actividad celular y, por ende, la absorbancia a 490 nm de los cristales disueltos en DMSO cuantifica la viabilidad. Asimismo, se estudió la proliferación celular mediante la incorporación de BrdU, detectada por medio de la medición de absorbancia a 450 nm. Por otra parte, se estableció el porcentaje de apoptosis por medio del uso de citometría de flujo en células (5 x 10⁵) marcadas en forma previa con anexina V-yoduro de propidio (en la reacción se utilizaron 5 µl de cada molécula de marcaje en 500 µl de binding buffer [incubación de 15 min a temperatura ambiente]). Cabe destacar que para evaluar la respuesta del osteoblasto a la glucosamina, respecto de la autofagia, se estudió mediante inmunofluorescencia la expresión de la proteína LC3A/B (utilización de anticuerpo dirigido contra LC3 [dilución 1:200, incubación a 4°C, durante la noche]) en células que, en forma previa, fueron fijadas en paraformaldehído al 4% y permeabilizadas en tritón X-100 al 0.2%, con el correspondiente bloqueo de las uniones inespecíficas (albúmina de suero bovino al 5%). Asimismo, la expresión de LC3, Beclin-1 y SQSTM1/p62, se determinó por medio de la realización de Western blot (uso de anticuerpos primarios específicos y los correspondientes anticuerpos secundarios y, detección quimioluminiscente con ECL), con una fase inicial de separación en geles de SDS-PAGE de 12% (cantidad de proteína cargada: 30 µg) y transferencia a membranas de PVDF de 0.2 µm.

En el análisis de los datos se utilizó ANOVA de una vía y, un valor de p < 0.05 determinó la significación estadística.

Resultados

De acuerdo con las observaciones efectuadas en el presente trabajo, determinadas concentraciones de glucosamina (≤ 0.6 mM) aumentan la viabilidad y la proliferación de los osteoblastos hFOB1.19, mediante la activación de los mecanismos de autofagia. En este sentido, los mayores porcentajes de viabilidad y de incorporación de BrdU se registraron luego de tratamientos de 24 y 48 horas con concentraciones de glucosamina < 0.6 mM; se estableció una significación estadística de p < 0.05 para concentraciones de 0.2 mM (incubación de 48 horas) y de 0.4 mM y 0.6 mM (incubación de 24 y 48 horas). Cabe destacar que se postula que la autofagia es el proceso inducido por bajas concentraciones de glucosamina que subyace al incremento en la proliferación de osteoblastos, ya que al agregar 3-metiladenina (3-MA), un inhibidor de este proceso, se registró la reversión del aumento en el porcentaje de incorporación de BrdU provocado por la exposición a una concentración de 0.6 de la aminoazúcar durante 24 o 48 horas. En concordancia, se observó un aumento en los niveles de los marcadores biológicos de autofagia, de las proteínas Beclin-1 y LC3, implicadas en la conformación de los autofagosomas, en los extractos de células tratadas con 0.6 mM de glucosamina. En particular, se registraron mayores incrementos en los niveles de estas proteínas en células expuestas durante 48 horas a concentraciones más elevadas de glucosamina, en el rango de 0 a 0.6 mM. Sin embargo, si bien la cascada de señalización de mTOR suele encontrarse implicada en la activación de la autofagia, en células hFOB1.19, la inducción de este proceso por concentraciones crecientes ≥ 0.6 mM de glucosamina determinó la inhibición de dicha vía mediante la reducción de los niveles de mTOR fosforilada (p-mTOR) (mayor reducción a concentraciones superiores), luego de un intervalo de 48 horas. Asimismo, el tratamiento con 100 nM de rapamicina, un antagonista de la vía de mTOR, bloqueó la activación de la autofagia provocada por la exposición a glucosamina (0.6 mM). Cabe destacar que los niveles de la proteína SQSTM1/ p62, cuya expresión indica la degradación de los autolisosomas, disminuyeron en función de la extensión de los intervalos de incubación con glucosamina (≤ 48 horas) y las concentraciones utilizadas (≤ 0.6 mm) (mayor reducción a concentraciones más elevadas y períodos de exposición de mayor duración). Asimismo, la 3-MA (5 mM) revirtió dicha disminución y el aumento en los niveles de las proteínas LC3 II y Beclin-1. En concordancia, la 3-MA inhibió la expresión de agregados de proteína LC3 en la superficie de los autofagosomas, la cual fue inducida por la exposición de células hFOB1.19 a glucosamina 0.6 mM durante 48 horas.

En el presente trabajo, la exposición de los osteoblastos a concentraciones de glucosamina > 0.8 mM, provocó una reducción significativa de la viabilidad y la proliferación celular (en intervalos de 24, 48 y 72 horas) en conjunción con un aumento de la apoptosis (en periodos de 24 y 48 horas [las concentraciones más elevadas se correlacionaron con mayores aumentos del porcentaje de células apoptóticas]). Dicho incremento en la apoptosis dependió de la actividad de la caspasa-3 y el bloqueo de la autofagia (el inhibidor de la enzima Z-DEVD-FMK y, del proceso autofágico, 3-MA, revirtieron el aumento inducido por la exposición a glucosamina 0.8 mM durante 48 horas).

Discusión

Si bien, los resultados de estudios previos efectuados en diferentes modelos no permiten arribar a un consenso respecto del efecto de la glucosamina en la viabilidad y la proliferación celular, mediante las observaciones efectuadas en los osteoblastos hFOB1.19 es posible determinar que la glucosamina, en concentraciones bajas (≤ 0.6 mM) o altas (≥ 0.8 mM), activa mecanismos que desencadenan la división celular o la apoptosis, respectivamente. Asimismo, la exposición de hFOB1.19 a concentraciones de glucosamina en el rango ≤ 0.6 mM durante 48 horas, indujo autofagia (mayor expresión de LC3 y Beclin-1 y, menores niveles de SQSTM1/p62), lo cual redundó en una activación de la proliferación (el aumento en la división celular se revierte con la utilización del inhibidor de autofagia, 3-MA). Dichas concentraciones de glucosamina redujeron los niveles de fosforilación de mTOR (48 horas de tratamiento), inhibición necesaria para la inducción de la autofagia.

Conclusión

El potencial de la glucosamina como estrategia terapéutica en el tratamiento de la osteoporosis radica en su capacidad, cuando es utilizada en concentraciones ≤ 0.6 mM, de estimular la proliferación de osteoblastos (línea celular hFOB1.19) mediante la inducción de la autofagia y la inhibición de la cascada de señalización de mTOR.