COMBINACIÓN DE AEROSOLIZACIÓN POR IONIZACIÓN ELÉCTRICA Y ESPECTROSCOPIA DE MASA PARA LA DETERMINACIÓN DEL NIVEL PLASMÁTICO DE GLIMEPIRIDA

Maharastra State, India: La combinación de aerosolización por ionización eléctrica y espectroscopia de masa en tándem permitiría reducir el riesgo de error humano, con ahorro destacado de tiempo, en el marco del procesamiento automático de las muestras plasmáticas para la cuantificación de la concentración de glimepirida.

Journal of Chromatographic Science 50(1):64-70

Autores:
Kundlik ML, Zaware BH, Kuchekar SR

Institución/es participante/s en la investigación:
Padmashri Vikhe Patil College

Título original:
Rapid and Specific Approach for Direct Measurement of Glimepiride in Human Plasma By LC-ESI-MS-MS Employing Automated 96 Well Format: Application to a Bioequivalence Study

Título en castellano:
Abordaje Rápido y Específico para la Determinación Directa de la Glimepirida en el Plasma Humano Mediante Aerosolización por Ionización Eléctrica

Extensión del  Resumen-SIIC en castellano:
2.27 páginas impresas en papel A4

ReSIIC editado en:  Bioquímica  Farmacología  Medicina Farmacéutica

Introducción
La glimepirida es un hipoglucemiante oral de la familia de las sulfonilureas que actúa mediante la estimulación de la liberación pancreática de insulina. Se describen además efectos extrapancreáticos, como el incremento de la sensibilidad de los tejidos periféricos a la acción de la insulina.
Después de su administración por vía oral, la glimepirida se absorbe en su totalidad en el tubo digestivo y alcanza concentraciones plasmáticas máximas hacia las 2 a 3 horas. La unión a proteínas plasmáticas es muy elevada, con un volumen de distribución de 8.8 litros. El fármaco se metaboliza en forma completa en el hígado, con una vida media de eliminación de 5 a 8 horas.
Con el objetivo de estimar las concentraciones del fármaco en líquidos biológicos, se han empleado distintos métodos de cromatografía; sin embargo, estos recursos se han vinculado con escasa sensibilidad, como consecuencia de diversas limitaciones metodológicas. En el presente ensayo se propuso la creación y validación de un método bioanalítico fundamentado en la espectroscopia de masa, para la cuantificación rápida de los niveles plasmáticos de glimepirida.
Métodos
Se utilizaron dos preparados estandarizados de glimepirida y glimepirida-_D8 (elegida como control interno [CI]), con una pureza estimada de 99.56% y 96.9%, en ese orden. Se eligieron solventes orgánicos para este modelo experimentales, con la inclusión de ácido fórmico, ácido ortofosfórico y formato de amonio de alta pureza. Se diluyeron las formulaciones de glimepirida y CI en metanol, con una segunda dilución posterior con una mezcla de metanol y agua hasta alcanzar una concentración intermedia de 20 µg/ml. Se elaboraron además soluciones en distintas concentraciones, con el objetivo de diseñar tanto una curva de calibración como las muestras destinadas al control de calidad. La curva se complementó con la incorporación de la solución de glimepirida en muestras de plasma congelado y libre de fármacos, hasta lograr concentraciones de 2.0, 4.0, 20.0, 60.0, 120.0, 240.0, 360.0, 480.0 y 650.0 ng/ml. Las muestras destinadas al control de calidad se elaboraron en concentraciones de 6.0, 180.0 y 450.0 ng/ml.
Las muestras de plasma se centrifugaron sin secado y reconstitución previa, con extracción en fase sólida y posterior dilución en un medio con metanol y acetonitrilo con 0.05% de ácido fórmico. El procesamiento total involucró 96 muestras.
La aerosolización por ionización eléctrica con espectroscopia de masa en tándem se realizó con equipos automatizados y controlados; los cocientes entre los valores máximos obtenidos para la glimepirida y el CI se emplearon en un modelo de regresión lineal con un factor de ponderación predefinido. Mediante la curva de respuesta lograda, se calcularon las concentraciones de las muestras de control de calidad y la estabilidad de las soluciones.
Resultados y discusión
El objetivo de este modelo consistió en la creación y validación de una estrategia sensible y rápida para la cuantificación de los niveles de glimepirida, con la finalidad de su aplicación en la determinación de la farmacocinética de los compuestos utilizados en ensayos clínicos.
En un primer modelo, por medio de la calibración de las condiciones de espectroscopia de masa en modos positivo y negativo para la glimepirida y el CI, se comprobó una respuesta más acentuada en el contexto de la ionización positiva. En los diversos intentos en los que se evaluó la utilización de formato de amonio y metanol para optimizar la fase móvil, se demostró una respuesta reducida cuando el pH del formato de amonio era de 3.5. Dado que el p_Ka de la glimepirida se estima en 6.2, la adición de 2 mM de formato de amonio junto con acetonitrilo permitió lograr una mayor especificidad. En este contexto, se obtuvieron picos simétricos ante niveles óptimos de temperatura. En estas condiciones ideales de cromatografía se eliminaron los pasos de evaporación y reconstitución, que suelen asociarse con mayor complejidad para estos procedimientos.
La especificidad de este método se evaluó mediante la comparación de los gráficos de cromatografía obtenidos a partir de 6 muestras de plasma. No se demostraron interferencias para la glimepirida o el CI por parte de sustancias plasmáticas endógenas. Asimismo, la condición lineal del método analíticos se determinó en el marco de un proceso de regresión ponderado con al prueba de cuadrados mínimos. Fue posible calcular la concentración de glimepirida a partir de una ecuación lineal simple en el cual se eligió como factor de ponderación la inversa del cuadrado del nivel del fármaco. Las curvas de calibración adquirieron una conformación lineal en el intervalo de concentraciones de 2.0 a 650.0 ng/ml, con un coeficiente de correlación no menor de 0.9994.
En otro orden, se calculó la recuperación de la glimepirida por medio de la comparación de las áreas máximas del fármaco obtenidas a partir de las muestras de plasma, por un lado, con los estándares para concentraciones similares de las muestras de control de calidad, por el otro. A su vez, la recuperación del CI se efectuó mediante la comparación de una serie semejante de muestras de plasma. En este modelo, la media del porcentaje de recuperación de la glimepirida y del CI fueron del 81.91% y 83.36%, en ese orden. Del mismo modo, se investigó la presencia de efectos matriciales a partir de 6 muestras diferentes de plasma, con la inclusión de preparados con heparina, alto contenido en lípidos o hemólisis. En este modelo, se comprobaron resultados comprendidos dentro del margen de error aceptable de ±15%, por lo cual se consideró que la elución de los picos de matriz endógena no afectaban los patrones de elución de la glimepirida o el CI.
En un segundo modelo y con la meta de evaluar la biodisponibilidad relativa de las formulaciones de glimepirida utilizadas en este ensayo, se propuso a veinte sujetos sanos la administración de una dosis única de la formulación de glimepirida en estudio y de un comprimido de referencia del mismo fármaco, en un protocolo abierto, aleatorizado y de diseño cruzado. Se aplicó un método de extracción en fase sólida para el análisis de los niveles de glimepirida en las muestras plasmáticas en períodos predefinidos a partir de la administración de una dosis de 4 mg del fármaco en cada fase. La concentración de glimepirida alanzó niveles máximos a las 5 h de la indicación.
Conclusiones
El objetivo de este ensayo consistió en la elaboración de un método simple y automatizado para estimar la concentración plasmática de glimepirida en los seres humanos, en especial en términos de las fases de absorción y eliminación. El método propuesto permitiría reducir el riesgo de error humano, en el marco de un ahorro destacado de tiempo y del procesamiento automático de las muestras. El límite de cuantificación resultó bajo y se asoció con la posibilidad de controlar niveles del fármaco incluso después de cinco vidas medias, así como con elevada reproducibilidad de los resultados. A partir de los parámetros de validación se propone la utilización de este método para el control de los niveles terapéuticos del fármaco, tanto en los ensayos clínicos como en los estudios farmacocinéticos.