Introducción

La pandemia por enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) fue causada por un nuevo virus de ácido ribonucleico (ARN) envuelto, perteneciente a la familia de los beta coronavirus, denominado coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2). Las manifestaciones clínicas de la COVID-19 son diversas y van desde cuadros asintomáticos hasta la muerte. La respuesta inflamatoria mediada por el SARS-CoV-2 tiene tres estadios diferentes; el III es el más grave y se manifiesta como un síndrome de hiperinflamación sistémica extrapulmonar, impulsado por una tormenta de citoquinas. Además, esta tormenta de citoquinas es responsable del daño multiorgánico, incluido el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la disfunción cardíaca y renal. En general, el pronóstico y la recuperación en el estadio III son pobres.

En la actualidad se investiga un tratamiento que impida la replicación viral, pero que también detenga la respuesta inmunitaria exacerbada, provocada por el SARS-CoV-2. En diferentes estudios se analiza el efecto de la administración conjunta de un inhibidor de la desgranulación de los mastocitos, como el ketotifeno, y un inhibidor de la ciclooxigenasa, como indometacina, o el naproxeno, en pacientes con COVID-19. Se estima que esta terapia combinada inhibe la replicación viral y evita que se desencadene la tormenta de citoquinas. Además, el ketotifeno parece proporcionar protección contra una posible lesión gastrointestinal inducida por la indometacina o el naproxeno cuando se utilizan en combinación.

En general, para evaluar la susceptibilidad in vitro de los virus, la replicación del virus se mide en presencia de concentraciones crecientes del producto en comparación con la replicación en su ausencia. La media de la concentración máxima eficaz es la concentración del producto a la que la replicación del virus se inhibe en un 50 % (CE₅₀). Además, se evalúa la toxicidad celular del agente estudiado. En general, el efecto citotóxico de un compuesto se determina calculando la concentración de la citotoxicidad celular (CC₅₀), es decir, la concentración del compuesto de prueba que reduce la viabilidad celular en un 50%, en comparación con el valor de control celular.

El objetivo del presente estudio in vitro fue investigar la eficacia del ketotifeno, el naproxeno y la indometacina, solos o en combinación, para reducir la replicación del SARS-CoV-2. Además, se evaluó la citotoxicidad de estos fármacos.

Métodos

Para el cultivo celular se utilizaron células de mono infectadas por SARS-CoV-2. Primero, se compararon los efectos citopáticos (EC) de la indometacina, el ketotifeno y el naproxeno con el remdesivir (control positivo). Los compuestos de prueba se prepararon en diferentes concentraciones el día de la prueba. A las placas de ensayo se añadieron 50 µl de SARS-CoV-2 diluido en medio de crecimiento de virus para generar una multiplicidad de infección de 0.05, lo que proporciona un efecto citopático del 100% en 4 días. El virus se añadió en filas triplicadas para evaluar la actividad antiviral y se añadió medio de crecimiento viral sin virus en filas triplicadas para evaluar la citotoxicidad. El porcentaje de protección celular logrado por el control positivo (remdesivir) y los agentes de prueba en células infectadas con virus se calculó mediante la fórmula de Pauwels y col. Los valores de CE₅₀ se calcularon a partir de los resultados del porcentaje de la protección celular por el análisis de regresión no lineal utilizando la fórmula Hill. Posteriormente, se realizó un ensayo de reducción del rendimiento para cada agente investigado solo o en combinación. Para los estudios de combinación, los compuestos se agregaron juntos en una proporción de 1:1; después, se sumaron 100 μl de volumen de combinación de compuestos a las monocapas de células. Después de 48 horas de incubación, se recogió el virus. Las monocapas de células se observaron microscópicamente con puntaje visual de CE inducido por el virus utilizado como criterio de valoración. La replicación viral se expresó como el porcentaje con respecto al crecimiento del virus cuando no se añadió fármaco, para cada concentración. Por último, se analizaron los efectos citotóxicos de la indometacina, el ketotifeno y el naproxeno en las células de mono durante 4 días o 48 horas, para imitar el ensayo antivírico o el ensayo de reducción del rendimiento. Las células viables se determinaron mediante tinción. La concentración citotóxica del 50%, es decir, la CC₅₀, se definió como la concentración del compuesto de prueba que reduce la absorbancia de las células infectadas simuladas en un 50% del valor de control.

Resultados

Ninguno de los tratamientos demostró actividad antiviral en el ensayo de CE de 4 días. En el ensayo de reducción de replicación viral, el ketotifeno solo inhibió la replicación del SARS-CoV-2 y exhibió una CE₅₀ de 48.9 µM, en tanto que el naproxeno solo no inhibió la replicación viral y exhibió una CE₅₀ > 100 µM. Cuando se aplicó de forma combinada, el ketotifeno mejoró la capacidad del naproxeno para reducir la replicación viral. La CE₅₀ de naproxeno se redujo a < 6 µM en la presencia de ketotifeno. Estos datos indicaron un efecto aditivo o sinérgico. En comparación con el ketotifeno solo, se halló un aumento en el porcentaje de inhibición de la replicación de SARS-CoV-2 al 68%, 68% y 92% cuando se coadministró con 25, 50 y 100 μM de naproxeno, respectivamente.

La indometacina sola inhibió la replicación viral y exhibió una CE₅₀ de 100.1 µM. La indometacina no alcanzó una CE₅₀ en presencia de 50 μM de ketotifeno, aunque se observó una inhibición de la replicación viral del 60% con 6.25 μM de indometacina. Estos datos provenientes del estudio in vitro indican que se requiere una dosis menor de indometacina para inhibir el crecimiento del virus en presencia de 50 μM de ketotifeno, lo que indica un efecto aditivo o sinérgico. La indometacina no alcanzó una CE₅₀ en presencia de 25, 12.5, 6.25 o 3.1 μM de ketotifeno. Cuando se aplicaron en forma conjunta, mejoró la capacidad de la indometacina para reducir la producción de virus. La CE₅₀ de la indometacina se redujo a < 6 μM en la presencia de ketotifeno. En comparación con el ketotifeno solo (60% de inhibición en la CE₅₀), se observó un aumento en el porcentaje de la inhibición de la replicación del SARS-CoV-2 al 79%, 83% y 93% cuando se coadministró con 25, 50 y 100 µM de indometacina, respectivamente. Las curvas de dosis-respuesta sugieren un efecto antivírico aditivo o sinérgico contra el SARS-CoV-2 cuando el ketotifeno y la indometacina se administran en combinación.

No se observó citotoxicidad para la indometacina, el naproxeno y el ketotifeno en las concentraciones ensayadas.

Discusión

Tanto la combinación de ketotifeno e indometacina como la de ketotifeno y naproxeno redujeron la replicación del SARS-CoV-2. Los estudios previos indicaron que la indometacina y el naproxeno ejercen propiedades antivirales. Estos agentes inhiben la nucleoproteína viral involucrada en la replicación del SARS-CoV-2. El ketotifeno potencia el efecto antiviral del naproxeno y la indometacina. La combinación de ketotifeno e indometacina fue más eficaz para inhibir la replicación viral que la combinación de ketotifeno y naproxeno. Los tres agentes probados en el presente estudio no exhibieron efectos citotóxicos. En general, los resultados de este trabajo concuerdan con los de la bibliografía. En relación con el objetivo de la combinación de los agentes para reducir la respuesta inmune excesiva, tanto la indometacina como el naproxeno han demostrado que disminuyen la respuesta inflamatoria. Estos hallazgos sugieren que ambos agentes pueden ser eficaces para contrarrestar la tormenta de citoquinas asociada con la infección por SARS-CoV-2. El ketotifeno ha sido aprobado para el tratamiento de la urticaria crónica y el asma y tiene con un excelente perfil de seguridad. Los mastocitos han sido involucrados en la patogenia de las infecciones virales y su activación provoca la liberación de diversos mediadores inflamatorios que, a su vez, intensifican la lesión inmunológica. Se estima que el ketotifeno inhibe este proceso y, en el caso de la COVID-19, impediría la tormenta de citoquinas. Además, se ha observado que reduce de manera sustancial el daño pulmonar y la mortalidad relacionados con el virus de la influenza. En conjunto, estos datos permiten señalar que el ketotifeno reduce la gravedad de la COVID-19.

Los resultados del presente estudio in vitro fueron promisorios y justifican la realización de investigaciones adicionales. Según los investigadores, es importante analizar si la combinación de ketotifeno con indometacina o naproxeno, además de detener la replicación viral, inhibe la tormenta de citoquinas provocada por la infección por SARS-CoV-2. 

Conclusiones

Los autores demostraron que la combinación de ketotifeno con indometacina o naproxeno reduce de forma significativa la replicación del SARS-CoV-2. En comparación con el ketotifeno solo, la combinación con indometacina o naproxeno ejerce un efecto aditivo o sinérgico. El ketotifeno, el naproxeno y la indometacina no ejercen efectos citotóxicos.