CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE CÉLULA ENTERA PARA LA HIDROXILACIÓN DE LAS SULFONILUREAS

Saar, Alemania: Se evaluó el metabolismo de la glibenclamida y la glimepirida por el sistema enzimático CYP105A1 y se creó un sistema de producción de derivados de sulfonilureas a partir de Bacillus megaterium transformado con CYP105A1. Se demostró que el bacilo posee un sistema de transferencia de electrones compatible.

Journal of Biotechnology 157(3):405-412

Autores:
Kleser M, Hannemann F, Bernhardt R

Institución/es participante/s en la investigación:
Universitätsklinikum des Saarlandes

Título original:
CYP105A1 Mediated 3-Hydroxylation of Glimepiride and Glibenclamide Using a Recombinant Bacillus megaterium Whole-Cell Catalyst

Título en castellano:
Uso de una Forma Recombinante de Bacillus megaterium como Catalizador de Célula Entera para la 3-Hidroxilación de la Glimepirida y Glibenclamida Mediada por CYP105A1

Extensión del  Resumen-SIIC en castellano:
3.13 páginas impresas en papel A4

ReSIIC editado en:  Bioquímica  Farmacología  Diabetología  Informática Biomédica  Medicina Farmacéutica

Introducción
El CYP105A1 (P450_SU-1) es uno de los dos sistemas enzimáticos pertenecientes al citocromo P450 caracterizados por Streptomyces griseolus ATCC 11796. Aunque otros compuestos pueden ser empleados como sustratos del CYP105A1, los autores se han enfocado en las sulfonilureas (SU). Estas sustancias son utilizadas ampliamente como secretagogos para el tratamiento de la diabetes mellitus (DBT) tipo 2. Este trastorno metabólico se caracteriza por la secreción reducida de insulina debida a insuficiencia pancreática progresiva, que resulta en niveles altos permanentes de la glucemia. Los efectos adversos a largo plazo, como enfermedad coronaria, accidente cerebrovascular (ACV) y ceguera, son consecuencias de no tratar o tratar de manera inadecuada la DBT con mal control glucémico.
La terapia más común, además de la dieta, es el uso de agentes hipoglucemiantes. Las SU aumentan la secreción de insulina al cerrar los canales K_ATP en las células beta pancreáticas. Esto lleva al aumento en la concentración de calcio en el citosol y en la liberación de la insulina.
Los autores han estudiado el metabolismo de la glibenclamida y la glimepirida por el CYP105A1. Las ferredoxinas FD1 y FD2, que posiblemente proveen electrones al CYP105A1 in vivo, se encuentran caracterizadas, pero no se ha encontrado gen alguno de la ferredoxina reductasa en S. griseolus. Si bien la transferencia de electrones del NADPH al citocromo puede ser establecida al utilizar las ferredoxinas y la ferredoxina reductasa de Spinacia oleracea, los autores reemplazaron el sistema de transferencia de electrones de la espinaca por la ferredoxina Etp1^fd(516-618) y la ferredoxina reductasa Arh1 de Schizosaccharomyces pombe. Estas proteínas redox son capaces de reconstituir la actividad de CYP105A1. Los investigadores demostraron la cinética de la glimepirida y la glibenclamida in vitro y lograron su bioconversión in vivo mediada por CYP105A1, que es de utilidad para aplicaciones biotecnológicas.
Materiales y métodos
La glimepirida, la glibenclamida, las enzimas de restricción del ADN, las enzimas modificadoras del ADN y los medios de cultivo bacteriano fueron adquiridos de distintos proveedores. Se obtuvo la cepa MS941 de Bacillus megaterium y el vector de expresión pKMBm4 correspondiente. Se construyó el vector de expresión pSMF, utilizando el pKMBm4 como molde. Las secuencias génicas de CYP105A1, Etp^fd(516-618) y Arh1 fueron adaptadas a los codones utilizados por B. megaterium. La secuencia de CYP105A1 fue adaptada a los codones utilizados por Escherichia coli para los estudios in vitro.
Para los estudios in vitro se amplificó el CYP105A1 por reacción en cadena de la polimerasa y se lo incorporó a un vector pKKHC. Se generó otro vector con las secuencias de Arh1 y Etp1^fd(516-618) ubicadas luego del gen de CYP105A1. Se utilizó la cepa E. coli JM109 para la expresión del CYP105A1 y Arh1, y la cepa E.coli BL21 para la expresión de Etp^fd(516-618).
El ensayo in vitro se realizó mediante la incubación de citocromo 1 µM, Etp^fd(516-618) 10 µM, Arh1 3 µM y catalasa 0.1 mg/ml en una solución tampón de potasio 50 mM y pH 7.4, con 0.1% Tween 20 y MgCl₂ 5 mM. La regeneración del NADPH se obtuvo mediante glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 2 U/ml y glucosa-6-fosfato 2 mM. Los sustratos se disolvieron en DBTSO y se agregaron a la mezcla de reacción para lograr una concentración final de 250 µM en un volumen total de 250 µl. Las reacciones se iniciaron con NADP⁺ 1 mM a 30° C y 900 rpm, se detuvieron a intervalos variables de tiempo y se extrajeron con 3 volúmenes de acetato de etilo. Luego de secar la fase orgánica, las muestras fueron resuspendidas en 100 µl del solvente analítico, y analizadas por RP-HPLC.
Las cepas de B. megaterium fueron modificadas con el método de transformación de protoplastos mediada por PEG. Luego de la incubación, se inició la inducción de la expresión de proteínas heterólogas al agregar xilosa 5 g/l a una DO_{578 nm} = 0.4. Se agregaron los sustratos respectivos disueltos en DBTSO a las 24 horas luego de la inducción. Se extrajeron muestras de 0.5 ml en varios momentos y se las analizó por HPLC.
Se realizaron estudios de radioinmunoensayo de identificación de proteínas (western blot) con alícuotas de B. megaterium llevadas a densidades celulares similares.
El cultivo con glimepirida fue colectado luego de 7 horas y el de glibenclamida luego de 24 horas de tiempo de conversión. Luego se los centrifugó a 4 000 x g por 20 minutos y se colectaron los sobrenadantes para extraerlos con 3 l de acetato de etilo. La fase orgánica fue secada y el extracto disuelto en 2 ml de cloroformo/metanol (93:7). Los metabolitos fueron purificados mediante una cromatografía por filtración en gel. Las fracciones fueron analizadas por resonancia magnética nuclear (RMN).
Se utilizó la estructura cristalográfica del CYP105A1 como condición del análisis por computadora de acoplamiento del sustrato. Los compuestos utilizados para el acoplamiento fueron creados manualmente y optimizados según el campo de fuerza MM+. La proteína Se conservó rígida en las corridas de acoplamiento. Para cada ligando, se realizaron 100 corridas y se aplicó el algoritmo de genética lamarckiana con los parámetros por defecto, a excepción de la tasa de mutación, que fue aumentada a 0.05.
Resultados y discusión
Según los perfiles de HPLC, la glimepirida es convertida a un producto (P_A) y la glimepirida a un producto principal (P1) y 2 secundarios (P2 y P3) en una proporción de 7.5:2.5:0.5.
Los parámetros de la conversión de las SU se obtuvieron a partir de concentraciones de glimepirida y glibenclamida de 2.5 a 50 µM. Los valores de K_m fueron 5.3 ± 0.8 µM para la glimepirida y 6.6 ± 0.8 µM para la glibenclamida. El valor de V_máx para la glimepirida fue 0.57 ± 0.02 nmol/min y para la glibenclamida fue 0.23 ± 0.01 nmol/min. Las k_cat fueron 37.6 ± 1.5 y 15.0 ± 0.5 x 10^-3 s^-1, respectivamente. Al compararlas, la glimepirida mostró una K_m más baja y una V_máx y k_cat 2.5 veces más altas que la glibenclamida.
La estructura del metabolito de la glibenclamida fue dilucidada mediante la evidencia de los espectros de RMN. El espectro de RMN ¹³C del producto de biotransformación mostró una señal de un alcohol secundario a un delta = 67.03. Mediante el estudio de los protones involucrados, se determinó que el producto debía ser el derivado 3-hidroxiciclohexil de la glibenclamida. La 3-hidroxiglibenclamida existe en configuraciones cis y trans respecto de los sustituyentes en el C-1 y C-3 de la fracción de ciclohexano. Los datos se ajustaron a datos publicados anteriormente de la forma cis. Las mediciones de RMN 2D indicaron que estos protones se encontraban en posición axial y que el residuo en C-1 y el grupo hidroxilo en C-3 se encontraban en posición ecuatorial. Esto confirmó que el metabolito de la glibenclamida era el isómero cis-1,3 de la 3-hidroxiglibenclamida: 1-[4-[2-(cloro-2-metoxibenzamida)etil]fenil]sulfonil-3-(cis-3-hydroxiciclohexil)urea.
La biotransformación de la glimepirida también llevó a la hidroxilación en el C-3 (delta = 72.49) del anillo ciclohexilo. La posición relativa de los residuos en C-1 y C-4 de la fracción de ciclohexano debe permanecer trans y ambos deben estar en la posición ecuatorial, lo que resulta en las posiciones axiales de H-1 y H-4. Se realizaron experimentos a distintas temperaturas, pero la resonancia de H-3 quedó ocluida por el triplete de H-17. El espectro NOESY a 343 K reveló su posición axial con correlaciones con H-1_ax y H-5_ax. Luego, el grupo hidroxilo en C-3 se encontraba en el plano ecuatorial y cis al residuo C-1. La 1-[4-[2-(3-etil-4-metil-2-oxo-3-pirrolina-1-carboxamida)etil]fenil]sulfonil-3-(cis-3-hidroxi-trans-4-metilciclohexil)urea, o (1R*),(3R*),(4R*)-3-hidroxiglimepirida es un nuevo compuesto.
Se aplicó el acoplado molecular para dilucidar las posibles formas de unión de la glimepirida y glibenclamida que pudieran llevar a productos de hidroxilación alternativos o sucesivos. Las formas permiten la identificación inequívoca de aquellos residuos involucrados en interacciones con los ligandos, en contraste con otros aminoácidos que son cruciales para la estabilidad funcional de la proteína. Las posiciones más favorables desde el punto de vista energético muestran el anillo ciclohexilo muy próximo al hierro hemo para la glimepirida y la glibenclamida.
Un oxígeno del grupo sulfonilo de la glimepirida interacciona con la cadena lateral de la Arg84 mediante un puente de hidrógeno. La forma de acoplamiento obtenida más frecuentemente mostró a este carbón a 3.19 Å del hierro hemo. Sin embargo, la resolución por RMN de la estructura del P_A demostró una hidroxilación en la posición 3 del anillo ciclohexilo, inmediatamente próxima a la predicción.
Se encontraron fuertes interacciones electrostáticas mediadas por puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de la Arg73 y Arg84 con los átomos de oxígeno del grupo sulfonilo de la glibenclamida. Esta conformación permite la hidroxilación en las posiciones 3 y 4 del residuo ciclohexilo. Las distancias entre el hierro hemo y los carbonos correspondientes del ciclohexilo son 2.50 Å hacia la posición 4 y 3.69 Å hacia la 3. Se identificó al producto P1 como la modificación en la posición 3, aun cuando la 4 parecía más favorable. La hidroxilación se obtuvo en la configuración cis.
Todo esto significa que el presente sistema bacteriano puede ser utilizado para producir este metabolito y, tal vez, otros compuestos relacionados. Esto puede llevar a la generación de nuevas sustancias, con el grupo hidroxilo como punto inicial de nuevas modificaciones. B. megaterium es una bacteria grampositiva del suelo con muchas ventajas. La estabilidad de los plásmidos, la baja actividad de las proteasas y su cultivo sencillo en diferentes fuentes de carbón hacen que se encuentre instaurado incluso en procesos biotecnológicos industriales.
La cepa MS941 de B. megaterium fue transformada con el vector pSMF-MK-1 que contenía el gen de CYP105A1 o con el vector pSMF-MK-2 que, además, codificaba dos compuestos redox alternativos: Arh1 y Etp^fd(516-618). El análisis del metabolismo mostró patrones de HPLC idénticos a los ensayos in vitro con las enzimas purificadas. Se realizó una transformación con el vector pSMF-MK-0 como control y se cultivó ese bacilo con glimepirida y glibenclamida. Se encontró que las SU no son metabolizadas por la cepa hospedadora.
Se encontró una eficiencia de conversión baja de la glimepirida por B. megaterium MK-1 y MK-2. De manera inesperada, el MK-1 también mostró actividad en el metabolismo de la glimepirida, en el rango de MK-2. El organismo hospedador puede proveer la transferencia de electrones. Es sabido que B. megaterium contiene diferentes citocromos P450. Los autores suponen que el sistema redox correspondiente del organismo hospedador es el responsable del flujo eficiente de electrones al CYP105A1. Es posible que la expresión de Arh1 y Etp^fd(516-618) en la construcción MK-2 sea muy baja para promover la actividad de CYP105A1 y, por esta razón, ambos sistemas mostraron una actividad similar.
Se notó que, con el medio de cultivo TB, la eficacia de la conversión de la glimepirida aumenta de manera considerable (30 veces). Esto no sucedió sólo por una mayor densidad de células, sino también por un aumento en la expresión de CYP105A1. El agregado del ácido aminolevulínico incrementó la tasa de conversión de la glimepirida aun más. La conversión total de 25 mg de glimepirida se da luego de 3.5 horas. La conversión de 25 mg de glibenclamida toma 12 horas, aproximadamente.
Conclusiones
Se generó un sistema de célula entera de alta eficacia para la hidroxilación de SU mediante el uso de B. megaterium. CYP105A1 cataliza una hidroxilación selectiva en la estereoquímica y en la región del residuo ciclohexilo de los fármacos glimepirida y glibenclamida. Tales sustancias hidroxiladas pueden resultar útiles como precursoras para el diseño de la próxima generación de SU. Además, el producto P1 de la conversión de la glibenclamida podría ser utilizado como estándar químico para la espectrometría de masa para investigaciones diagnósticas o forenses.