Introducción

Se ha estimado que en los Estados Unidos, entre el 18% y el 26% de los sujetos realizan trabajo por turnos, incluidos trabajos en horas de la noche (shift work [SW]). En otros países se comunicaron cifras similares. En un estudio transversal, el SW se asoció de manera significativa e independiente con riesgo aumentado de sueño de mala calidad. Los trastornos del sueño afectan la salud de las personas y aumentarían el riesgo de presentar eventos cardiovasculares, diabetes, trastornos gastrointestinales, trastornos mentales, estrés psicológico, cáncer y deterioro de la calidad de vida.

El sueño abarca dos ciclos alternantes: el sueño no asociado con movimientos oculares rápidos (non-rapid eye movement [NREM]) y el sueño con movimientos oculares rápidos (rapid-eye movement [REM]). Un episodio de sueño comienza con un breve período de sueño NREM, incluidas las etapas 1, 2, 3 y 4, seguido del sueño REM, en ciclos que se repiten durante toda la noche.

Al inicio del sueño NREM, la frecuencia cardíaca, la presión arterial, la frecuencia respiratoria y la tensión muscular disminuyen gradualmente; las fases 3 y 4 del sueño NREM o sueño de onda lenta (slow-wave sleep [SWS]) se caracterizan por la liberación de hormona de crecimiento para la reparación y regeneración fisiológicas, y por la reducción de la actividad del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal (HHS). Durante el sueño REM o sueño paradójico hay actividad cerebral y pérdida del tono muscular. El sueño REM es importante para el procesamiento emocional y la consolidación de la memoria.

La alteración del sueño puede afectar los ritmos circadianos y la secreción de hormonas, como la melatonina; también se asocia con activación del sistema nervioso simpático y del eje HHS, respuestas de estrés, cambios metabólicos e inflamación. La interrupción breve del sueño se acompaña de efectos deletéreos, como angustia emocional y déficits cognitivos, de la memoria y del desempeño. Los ritmos circadianos se asocian fuertemente con la salud mental y la regulación del estado de ánimo, de modo que la interrupción de los ritmos circadianos puede motivar trastornos psiquiátricos y del estado de ánimo.

Estudios recientes sugieren fuertemente que la microbiota intestinal contribuye en el estado de salud y enfermedad. Los metabolitos de la microbiota regulan el metabolismo; además, la microbiota se comunica de manera bidireccional con el cerebro, por medio de conexiones neurales, endocrinas, inmunológicas y humorales. Se comprobó disbiosis en numerosos trastornos psiquiátricos, como depresión, ansiedad y enfermedad de Parkinson; la disbiosis también contribuye en los procesos inflamatorios centrales y periféricos y en los déficits cognitivos inducidos por la privación del sueño (PS). El sistema inmunitario y numerosos mediadores son modulados por la microbiota. Las anormalidades de los ritmos circadianos también podrían afectar las comunidades del microbioma, con consecuencias desfavorables para el organismo. En este estudio experimental se analizaron los efectos de la PS por medio del método modificado de plataforma múltiple (modified multiple-platform method [MMPM]) con el propósito de conocer diversos efectos de los trastornos de los ritmos circadianos.

Materiales y métodos

Un grupo de ratas macho C57BL/6 se asignaron aleatoriamente a un grupo control y a un grupo de PS (10 en cada grupo), por medio de 72 horas de MMPM. Se determinaron los efectos de la PS sobre la ingesta, el comportamiento, la liberación de citoquinas, la microbiota y la expresión de diversos genes. Los animales fueron sacrificados para la obtención de muestras de plasma, tejido cerebral y colon proximal. Los análisis estadísticos se realizaron con pruebas de la U de Mann-Whitney y de la t, según el caso.

Resultados

Efectos de la PS sobre la ingesta, el peso corporal y las hormonas de estrés

Luego de 48 a 72 horas de PS, los animales presentaron un aumento significativo de la ingesta de alimentos (p < 0.05 respecto del grupo control). Sin embargo, la disminución del peso fue significativamente más importante en el grupo experimental que en el grupo control. En el grupo experimental se observó un incremento no significativo en los niveles de corticosterona, la principal hormona esteroide del eje HHS.

Efectos de la PS sobre la ansiedad, la actividad locomotora, la cognición y la depresión

La ansiedad se determinó con la prueba del laberinto elevado (elevated plus maze [EPM]) y con la prueba de campo abierto (open field test [OFT]) después de 72 horas de PS. El número de heces durante la EPM fue significativamente más alto en el grupo experimental, en comparación con el grupo control. Los ratones sometidos a PS pasaron significativamente menos tiempo en el campo central en el OFT, respecto de los animales del grupo control. Sin embargo, la actividad locomotora no difirió de manera significativa entre los grupos. La memoria y la depresión se evaluaron con la prueba de reconocimiento de objetos nuevos (novel object recognition test [NORT]) y con la prueba de la suspensión de la cola (tail suspension test [TST]), respectivamente. El índice de discriminación y el tiempo de inmovilidad no difirieron de manera significativa entre los grupos. En las pruebas de comportamiento, la PS durante 72 horas indujo ansiedad y posible depresión, aunque no ejerció efectos sobre la memoria y la actividad locomotora.

Efectos de la PS sobre el perfil del microbioma

En el grupo experimental, la diversidad alfa (enriquecimiento) mostró índices Observed, Chao1, Shannon y Simpson significativamente más bajos, respecto de los animales del grupo control. Para la diversidad beta (composición), el análisis de coordenadas principales, en función de las distancias UniFrac, ponderadas y no ponderadas, mostró un nivel alto de divergencia entre los grupos. Según el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal del cladograma, a nivel de género, Enterorhabdus, Muribaculum, Erysipelatoclostridium, Lactobacillus, GCA-00066575, Marvinbryantia, Monoglobus, UCG-009, Negativibacillus, Ruminococcus, Candidatus-Saccharimonas, Parasutterella y Akkermansia fueron menos abundantes en los animales del grupo experimental, respecto de los ratones del grupo control. En animales expuestos a PS se comprobó abundancia de Clostridia, Clostridiales, Enterobaterales, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Ruminococcaceae, Enterobateriaceae, Candidatus_Arthromitus y Enterobacter. 

Análisis de ácidos grasos de cadena corta en heces

En el análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) en materia fecal se comprobó reducción significativa de ácido propiónico en el grupo experimental, respecto del grupo control (p < 0.001). En cambio, las concentraciones de ácido butírico y de ácido acético no difirieron entre los grupos. Por lo tanto, la PS reduce el contenido de bacterias productoras de ácido propiónico, un fenómeno que podría incrementar la permeabilidad intestinal, con liberación de factores patógenos en la circulación.

Endotoxinas y marcadores inflamatorios en plasma

Los lipopolisacáridos (LPS) en plasma constituyen un biomarcador de la permeabilidad intestinal. Los niveles de LPS tendieron a ser más altos en los animales del grupo experimental, pero las diferencias respecto del grupo control no fueron significativas (p = 0.07). Los LPS en plasma inducen activación de las respuestas inmunológicas innatas y síntesis de citoquinas proinflamatorias. En los animales del grupo experimental se observaron concentraciones aumentadas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), una citoquina proinflamatoria (p < 0.05). Por lo tanto, la PS se asocia con pérdida de la integridad intestinal, con translocación de LPS al plasma y con inflamación sistémica. 

Análisis de ARN mensajero y correlación con el TNF-alfa, la microbiota y los genes del colon proximal

En el análisis de la expresión de ARN mensajero (ARNm) en el colon proximal, en los animales sometidos a PS se observó expresión significativamente más alta del ARNm para el gen TNF-alfa y expresión reducida de ARNm para ocludina (OCLN, gen de unión estrecha), el regulador circadiano de criptocromo 1 (cryptochrome circadian regulator 1 [CRY1]), y proteína 1 similar a ARNT cerebral y muscular (brain and muscle ARNT-like 1 [BMAL1]; gen circadiano), respecto del grupo control. En cambio, no se observaron diferencias significativas entre los grupos en la expresión del receptor de hormona liberadora de corticotrofina (CRF).

En el análisis inmunohistoquímico se comprobó menor expresión de OCLN y BMAL1 en el grupo experimental que en el grupo control.

Algunos microorganismos de la microbiota fueron más abundantes en el grupo experimental con PS, respecto del grupo control (Enterobacter y Candidatus_Arthromitus), y estos se asociaron de manera positiva con los niveles plasmáticos de TNF-alfa y con el gen de TNF-alfa en el colon, y de manera negativa con los genes de unión estrecha del colon (OCLN y ZO-1) y con el gen circadiano del colon (CRY1). En cambio, otros microorganismos fueron menos abundantes entre los animales sometidos a PS (Lactobacillus, Muribaculum, Parasutterella, Ruminococcus, GCA-900066575, Monoglobus, Candidatus-Saccharimonas, Enterorhabdus, Marvinbryantia y Akkermansia), y se asociaron negativamente con los niveles plasmáticos de TNF-alfa y con el gen de TNF-αlfa en el colon, pero presentaron una correlación positiva con los genes de unión estrecha del colon (OCLN y CLDN1) y con los genes circadianos del colon (BMAL1 y CRY1).

Los niveles plasmáticos de TNF-alfa se relacionaron negativamente con la expresión del gen de unión estrecha del colon OCLN y con los genes circadianos (BMAL1, clock circadian regulator [CLOCK] y CRY1).

La expresión del gen OCLN se asoció de manera fuerte y significativa con BMAL1, CLOCK y CRY1. El gen circadiano CRY1 se vinculó negativamente con Enterobacter y Candidatus­_Arthromitus, más abundantes en los animales sometidos a PS que en los del grupo control.

La microbiota con abundancia reducida en los animales del grupo experimental, respecto del grupo control (Lactobacillus, Muribaculum, Parasutterella, Ruminococcus, GCA_900066575, Monoglobus, Candidatus_Saccharimonas, Enterorhabdus, Marvinbryantia y Akkermansia), presentó una correlación fuerte y positiva con la expresión de los genes OCLN y CRY1. 

Expresión de ARNm, genes del hipocampo y microbiota en la corteza prefrontal

En la corteza prefrontal, los animales con PS presentaron niveles significativamente más altos de TNF-alfa, respecto del grupo control (p < 0.05); en cambio, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en los genes de unión estrecha, CLOCK, y genes relacionados entre los dos grupos. En el hipocampo, los ratones sometidos a PS presentaron expresión significativamente reducida de receptores de 5-hidroxitriptamina 1 A (5-HT_1AR) y los niveles de TNF-alfa tendieron a ser más altos (p = 0.12)

La abundancia de la microbiota en el grupo experimental (Enterobacter y Candidatus_Arthromitus) se correlacionó de manera positiva con los niveles de TNF-alfa en el hipocampo, y de manera negativa con la expresión de OCLN, ZO-2 y 5-HT_1AR. En cambio, la menor abundancia en los animales con PS de Lactobacillus, Muribaculaceae, Parasutterella, Ruminococcus, Monoglobius, Enterorhabdus, Marvinbryantia y Akkermansia se asoció negativamente con los niveles de TNF-alfa y de manera positiva con la expresión de OCLN, ZO-2 y 5-HT_1AR.

Expresión de ARNm y genes en la corteza cerebral

En relación con el índice inflamatorio en la corteza cerebral, los ratones expuestos a PS presentaron niveles significativamente más elevados de TNF-alfa, de la molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1 [IBA1], un marcador de activación de la microglía) y de la molécula de adhesión intercelular (intercellular adhesion molecule 1 [ICAM1]); asimismo, los niveles del miembro 1A de la superfamilia de receptores de TNF-alfa (TNFRSF1A; p = 0.07) y de interleuquina (IL)-6 (p = 0.08) tendieron a ser más elevados. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la expresión de genes de unión estrecha, CLOCK y genes relacionados con la serotonina, respecto del grupo control.

La ICAM-1 se asoció de manera positiva con TNF-alfa, IL-1 beta e IL-6; el gen circadiano BMAL1 se correlacionó negativamente con TNF-alfa e ICAM-1.

Conclusión

La PS aguda se observa con frecuencia entre los sujetos que trabajan en turnos variables o por fuera de los horarios diurnos habituales. En este estudio experimental con ratones sometidos a PS se observó mayor inflamación en el colon (niveles más altos de TNF-alfa) y regulación anómala de los ritmos circadianos y de la expresión de genes de unión estrecha. La disfunción de barrera intestinal se asoció con mayor concentración de LPS y de TNF-alfa. La inflamación podría vincularse con la activación de la microglía y la expresión de diversas citoquinas, mientras que la inflamación y la reducción de los receptores de serotonina en el hipocampo generarían ansiedad. Los hallazgos en conjunto sugieren que la microbiota podría ser un modulador importante de la inflamación, el metabolismo, la integridad de la barrera y el sistema nervioso central.