Introducción

Las técnicas de reproducción asistida, como la fertilización in vitro, requieren la estimulación de los ovarios con diversos fármacos con el fin de aumentar el número de ovocitos a recolectar y, por ende, las probabilidades de éxito. Los regímenes de estimulación ovárica son variados y entre ellos se cuenta con la regulación por disminución (down regulation) de la hipófisis, seguido por el tratamiento con gonadotrofinas, o la estimulación con gonadotrofinas seguido de antagonistas de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH) para evitar el pico prematuro de hormona luteinizante (LH). Las gonadotrofinas se utilizan en reproducción asistida desde hace décadas y las distintas preparaciones se fueron modificando. Las primeras preparaciones comerciales se obtuvieron de la extracción de las orinas provenientes de donadoras posmenopáusicas, pero tenían baja pureza y especificidad. Posteriormente, fue posible el logro de formulaciones obtenidas con mayor pureza y especificidad hasta llegar a la elaboración de la hormona foliculoestimulante humana (FSH) recombinante (rFSH). Las gonadotrofinas como FSH, LH y gonadotrofina coriónica humana (HCG) son heterodímeros que consisten en subunidades alfa y beta ligadas de forma no covalente. En las especies animales, la secuencia de aminoácidos de las subunidades alfa es idéntica, mientras que las diferentes subunidades beta confieren la especificidad biológica a las gonadotrofinas individuales. Ambas subunidades están glucosiladas, con numerosas glucoformas debido a la heterogeneidad de las cadenas de glucanos a las que se unen.

Se cuenta con una preparación de gonadotrofina menopáusica humana urinaria (menotropina o HMG), cuyo contenido informado por el fabricante es de 75 UI de FSH y 75 UI de LH, en una relación 1:1, y sin agregado de HCG. Habitualmente, cuando la actividad de LH es muy baja, se agrega HCG obtenida de la orina de embarazadas. Según el fabricante, la pureza es comparable a la de la rFSH. El objetivo de los autores fue realizar una caracterización detallada de la composición de la preparación de HMG y compararla con la de rFSH.

Materiales y métodos

Todas las gonadotrofinas utilizadas en el estudio fueron de origen humano. La bioactividad in vivo declarada de la HMG fue de 75 UI de FSH urinaria y de 75 UI de LH urinaria. Esta formulación altamente purificada de HMG se conoce como HMG-HP (HMG-highly purified). En los estudios comparativos se utilizó la rFSH con una bioactividad in vivo de aproximadamente 12 000 UI/mg y las preparaciones de LH y HCG recombinantes se utilizaron como referencias en la identificación de diferentes gonadotrofinas en la HMG-HP. La LH y la HCG recombinantes se produjeron sólo con propósitos de investigación y no se purificaron hasta el nivel de las preparaciones clínicas, pero tuvieron por lo menos un 95% de pureza.

Las inmunoactividades de FSH, LH y HCG se midieron según inmunoensayos enzimáticos tipo sándwich (IEE). Los anticuerpos monoclonales de captura utilizados en los 3 ensayos se dirigieron contra las subunidades beta de la FSH, la LH y la HCG, respectivamente, mientras que la detección de anticuerpos monoclonales marcados con peroxidasa de rábano picante fue específica para la subunidad alfa. Estos ensayos sólo detectaron heterodímeros intactos y no subunidades libres. Las muestras se analizaron con cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC). Otra forma de separar las mezclas de proteínas es por cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (high-performance size-exclusion chromatography, HP-SEC) y electroforesis con dodecil sulfato sódico en gel de poliacrilamida (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). El perfil de isohormonas de las gonadotrofinas en la HMG-HP se analizó por isoelectroenfoque (IEF), con las gonadotrofinas recombinantes como referencia. Las proteínas separadas por SDS-PAGE y por IEF se analizaron por inmunoelectrotransferencia (Western blot). Se realizó la separación de los componentes presentes en la HMG-HP por electroforesis en gel bidimensional y digestión tríptica en gel y las impurezas se identificaron por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), técnica utilizada en espectrometría de masas. El inhibidor de la proteína C humano se cuantificó por IEE tipo sándwich.

Resultados

La cantidad promedio de FSH en la HMG-HP, determinada por IEE, fue de 78 UI, mientras que los contenidos promedio de LH y HCG fueron de 3 y 10 UI, respectivamente.

El perfil isohormonal de gonadotrofinas en la HMG-HP analizado por IEF, con las gonadotrofinas recombinantes como referencia, demostró que no se detectaron isoformas de LH. Las bajas cantidades de LH encontradas con IEE aparentemente estuvieron por debajo del límite de detección por IEF. El análisis por Western blot con anticuerpos específicos para HCG demostró la presencia de HCG en la HMG-HP.

El contenido de gonadotrofinas de la HMG-HP determinado por RP-HPLC fue del 70% y el resto correspondió a impurezas.

La separación de las mezclas de proteínas basada en el tamaño o la masa con HP-SEC indicó que el contenido de la HMG-HP contiene más HCG que LH, lo cual confirma los datos obtenidos por IEE, IEF y RP-HPLC.

La presencia de isoformas de subunidad beta de LH no pudo demostrarse inequívocamente sobre la base de la movilidad electroforética en gen bidimensional.

Las impurezas detectadas por HP-SEC fueron del 15%, mientras que por electroforesis en gel bidimensional representaron aproximadamente un cuarto de la intensidad total. Se identificaron las impurezas de la HMG-HP por EGPA bidimensional y digestión por tripsina y luego se analizaron por MALDI. Los análisis confirmaron la presencia de inhibidor de la elastasa leucocitaria, inhibidor de la proteína C y glucoproteína zinc alfa 2. La cantidad de inhibidor de la proteína C presente en la HMG-HP se determinó por IEE específico y se demostró que fue la impureza principal en la HMG-HP. Con la utilización del mismo IEE no se detectó el inhibidor de la proteína C en las preparaciones de gonadotrofinas recombinantes.

Discusión y conclusión

Comentan los autores que los resultados obtenidos por diversos métodos complementarios demostraron que el componente principal responsable de la bioactividad de LH in vivo en la HMG-HP es la HCG y no la LH, con una cantidad 3 veces superior. La HCG tiene mayor contribución a la bioactividad in vivo de la LH que la LH debido a su vida media significativamente más prolongada. Aproximadamente el 95% de la bioactividad de LH en la HMG-HP se debe a la HCG, mientras que la LH contribuye sólo con el 5% de la bioactividad total de la LH. Estos resultados coinciden con un estudio publicado previamente. La presencia de pequeñas cantidades de HCG en las preparaciones de HMG es esperable, debido a que la orina de las mujeres menopáusicas contiene pequeñas cantidades detectables de material similar a la HCG, pero su concentración siempre es inferior a la de la LH. Según los autores, la relación de LH/HCG en la preparación de HMG-HP sólo puede explicarse por el agregado de HCG por fuentes externas, a diferencia de lo proclamado por el fabricante.

Los análisis de composición por RP-HPLC, HP-SEC, SDS-PAGE y electroforesis en gel bidimensional demostraron cantidades significativas de impurezas proteicas derivadas de la orina. Las impurezas determinadas por RP-HPLC representaron el 30%, mientras que la detección por HP-SEC fue de sólo el 15%. Las impurezas tienen tamaños moleculares más grandes que las gonadotrofinas y la diferencia con la RP-HPLC se debe a la superposición de impurezas y gonadotrofinas en el caso de la HP-SEC. Con la electroforesis en gel bidimensional las impurezas representaron un cuarto de la intensidad total. Los datos en conjunto demostraron claramente la presencia de cantidades significativas de impurezas en la HMG-HP y la pureza de la preparación es, a lo sumo, del 70%. Las 3 impurezas identificadas fueron el inhibidor de la elastasa leucocitaria, el inhibidor de la proteína C y la glucoproteína zinc alfa 2. Se desconoce si la presencia de estos contaminantes puede tener consecuencias positivas o negativas en los ciclos de estimulación ovárica, por lo que se requieren más investigaciones al respecto.

Este estudio demostró que hubo una diferencia en la pureza entre la HMG-HP y la rFSH, y esta última fue claramente superior ya que no se detectaron impurezas, mientras que en la HMG-HP éstas representaron el 30% de la preparación.

En conclusión, la preparación de HMG-HP contiene un 70% de gonadotrofinas y un 30% de impurezas. Las impurezas identificadas fueron principalmente 3 (inhibidor de la elastasa leucocitaria, inhibidor de la proteína C y glucoproteína zinc alfa 2).