EFICIENCIA DE LA AMPLIFICACIÓN DEL GENOMA DEL VIRUS DEL DENGUE
Daniel Atchley1,Guillermo Comach2,Alvaro Ramirez3,Silvana Vielma4,Guillermo Comach5,Alvaro Ramirez6,Daniel Atchley7 y María Inés Odreman-macchiolo8
1Biólogo, Professor, College Of Pharmacy Harding University
2Medico Veterinario,, Jefe De Lardidev, Laboratorio Regional De Diagnóstico E Investigación Del Dengue Y Otras Enfermedades Virales, Maracay 2301, Estado Aragua, Venezuela
3Biologo Molecular, Scientific Operations Manager / Medical, Scientific Operations Manager / Medical Information & Communication Head En Novartis De Venezuela. Laboratorio Biología De Virus, Instituto Venezolano De Investigaciones Científicas (ivic),
4Medico, Profesor, Universidad De Ls Andes
5Medico Veterinario,, Jefe De Lardidev, Laboratorio Regional De Diagnóstico E Investigación Del Dengue Y Otras Enfermedades Virales, Maracay 2301, Estado Aragua, Venezuela
6Biologo Molecular, Scientific Operations Manager / Medical, Scientific Operations Manager / Medical Information & Communication Head En Novartis De Venezuela. Laboratorio Biología De Virus, Instituto Venezolano De Investigaciones Científicas (ivic),
7Biologo, Professor, College Of Pharmacy Harding University
8Magister Scientae, Profesor Instructor. Estudiante Phd, Laboratorio De Microbiologia Y Salud Pública Del Estado Mérida, Merida, Venezuela
Merida, Venezuela (SIIC)
La porción distal de la región NS del virus del dengue es específica para cada serotipo y permite su uso para la amplificación de los virus circulantes en Venezuela y posiblemente en las Américas.
Desde el punto de vista epidemiológico, el virus del dengue (DENV) es la infección transmitida por artrópodos más frecuente en el planeta. La infección es causada por cualquiera de los cuatro serotipos virales denominados DENV–1 a DENV-4. Recientemente, la OMS/TDR ha clasificado las formas sintomáticas de la enfermedad en dengue con signos de alarma o sin ellos y dengue grave.
El diagnóstico específico de la infección por el virus dengue constituye un elemento clave para la instauración de medidas terapéuticas destinadas a evitar las complicaciones asociadas a las diversas formas clínicas de esta enfermedad. Las pruebas confirmatorias de la enfermedad se realizan basadas en la fase en que se encuentra el paciente. Durante la fase aguda, se realizan pruebas virales (cultivo o amplificación por PCR) y en la fase crítica y de recuperación se utilizan la determinación de anticuerpos del tipo IgM anti-dengue. Los métodos de amplificación viral descritos en la literatura utilizan regiones variables tales como la región de la envoltura (E), premembrana, NS3, NS5 y 3´NC tanto por las técnicas de PCR punto final, como en tiempo real. El principal problema en la amplificación del DENV son sus posibles variaciones en las secuencias del genoma viral.
El objetivo del estudio* fue evaluar la eficiencia de amplificación de la región genómica NS5, una de las áreas más conservadas del DENV, mediante un ensayo cuantitativo de PCR-tiempo real (qPCR), comparándola con la región cápside-premembrana (C-prM), utilizada clásicamente para amplificación y la región 3´NC viral, a partir de 167 muestras de ARN viral aislado de casos sospechosos clínicamente de la enfermedad.
Entre los resultados más relevantes de esta investigación, se encontró que las tres regiones génicas tuvieron perfiles de amplificación/coeficientes de correlación similares (0.987-0.999). La región NS5 tuvo la eficiencia de amplificación más elevada para los cuatro serotipos (98% al 100%). Durante el proceso de validación, 41.1% (67/167) de las muestras de suero resultaron positivas para DENV al menos por dos de las regiones genómicas empleadas. Los valores de concordancia entre las regiones NS5/C-prM y NS5/3'NC fueron de 56.7% y 97%, respectivamente. La concordancia fue débil entre las regiones NS5/C-prM (< 0.109; IC 95%), sin embargo, fue moderada entre las regiones NS5/3'NC (< 0.489; IC 95%). La naturaleza de la variación genómica en dengue se atribuye principalmente a fenómenos de degeneración de un codón, especialmente en las regiones que codifican la cápsula, la membrana y la envoltura viral. Por lo tanto, cualquier modificación no predecible de la secuencia del gene de la unión cápside-premembrana pudiera generar variaciones entre los ensayos de amplificación cuando se utilizan virus del dengue de varios orígenes. Por el contario, la secuencia usada para amplificar la región 3´NC incluye al menos 52 nucleótidos bien conservados entre los serotipos virales, permitiendo una mejor eficacia de la región comparada con NS5.
Otras variables estudiadas en este estudio fue la comparación de las químicas SYBRGreen®-I y el ensayo TagMan® bien sea en formato uniplex o en formato multiplex. El ensayo de tipificación uniplex en formato NS5/TaqMan® mostró alta sensibilidad (100%) caundo se comparó con el ensayo C-prM utilizando SYBRGreen®-I (76%). El formato multiplex de la región NS5 en formato TagMan®, no permitió la amplificación de los cuatro genotipos al mismo tiempo, disminuyendo la sensibilidad alcanzada por el formato uniplex.
La validación externa del ensayo mostró una significativa concordancia entre los resultados de la amplificación de la región NS5, comparada con los resultados combinados de amplificación de la región premembrana, cultivo viral y determinación del antígeno NS1. Igualmente, una alta sensibilidad (100%), especificidad (78%) y acuerdo alto entre los ensayos utilizados.
Un hallazgo inesperado fue la existencia, en un 17.3% de los casos, de coinfecciones por más de un serotipo del DENV, donde la más observada fue entre DENV1/DENV-2.
En conclusión, la amplificación de la región NS5 ofrece la mayor opción para la detección y serotipificación del DENV en muestras clínicas provenientes de casos sospechosos venezolanos y posiblemente de virus circulando en las Américas.
