Introducción

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en los países con recursos altos; la aterosclerosis cumple un papel fundamental en la aparición de enfermedad cardiovascular. La ateroesclerosis obedece a la inflamación crónica de las paredes de los vasos, con formación de placas de ateroma y obstrucción vascular. Los niveles elevados de lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDLox) en las células endoteliales vasculares constituyen un factor decisivo para la inflamación vascular, asociada con aumento de la permeabilidad endotelial y con migración de monocitos y de células de músculo liso vascular a la íntima, factores involucrados en la aparición de las placas de ateroma.

Uno de los derivados del colesterol que participa en el proceso de la aterosclerosis es el 25-hidroxicolesterol (25-OHC), una LDLox que participa en la inflamación crónica, la proliferación vascular y el proceso aterogénico. Luego de la ingesta de comidas ricas en grasas, como también en los pacientes con hipercolesterolemia, se observan niveles séricos elevados de 25-OHC, un producto que ejerce efectos proinflamatorios sobre la pared vascular, con disfunción del endotelio, aumento del estrés oxidativo y producción de citoquinas proinflamatorias. Se ha referido que el bloqueo de la síntesis de 25-OHC podría inhibir el proceso de aterosclerosis al suprimir la formación de macrófagos espumosos. En este contexto, los efectos del 25-OHC sobre la pared vascular deben conocerse con precisión.

Las estatinas son fármacos que reducen la síntesis de colesterol al inhibir la actividad de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzyma A reductasa. Estos fármacos se administran con frecuencia para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular aterosclerótica. Según las recomendaciones de la European Society of Cardiology (ESC) y de la European Atherosclerosis Society (EAS) de 2019 se sugiere el tratamiento de alta intensidad con estatinas (atorvastatina en dosis de entre 40 y 80 mg, o rosuvastatina, en dosis de entre 20 y 40 mg) en los pacientes con riesgo alto o muy alto de eventos cardiovasculares. En los sujetos con intolerancia a las estatinas o cuando los efectos de estos fármacos no son suficiente, se recomienda el uso de ezetimibe, ya sea en monoterapia o en terapia combinada.

La eficacia del tratamiento contra la aterosclerosis determina la magnitud de la prevención de eventos cardiovasculares. En este escenario, el objetivo del presente estudio fue comparar los efectos antiinflamatorios de dos estatinas que se utilizan en la práctica clínica (atorvastatina y rosuvastatina), del ezetimibe y del tratamiento combinado con ezetimibe y estatinas sobre las células vasculares endoteliales de seres humanos (human vascular endothelial cells [HUVEC]) en cultivo, dañadas o no con colesterol oxidado.

Métodos

Se analizó la expresión de ARN mensajero (ARNm) para citoquinas proinflamatorias, entre ellas interleuquina (IL)-1β, IL-18 e IL-23, y de citoquinas antiinflamatorias, como la IL-35 (subunidades de IL-12A y de EB13), el factor transformante de crecimiento β (TGF-β), la IL-10 y la IL-37. También se determinaron los niveles de IL-35 en el sobrenadante de los cultivos. Los estudios con HUVEC se realizaron antes y después de la estimulación de estas células con 25-OHC. Las HUVEC fueron estimuladas con atorvastatina (5 μM), rosuvastatina (10 μM), ezetimibe (1.22 μM), atorvastatina-ezetimibe (5 μM + 1.22 μM) o rosuvastatina-ezetimibe (10 μM + 1.22 μM), con preincubación o no con 10 μg/ml de 25-OHC. La expresión de ARNm se determinó por medio de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, en tanto que los niveles de IL-35 se determinaron con enzimoinmunoensayo (ELISA).

Los análisis estadísticos se realizaron con modelos de varianza (ANOVA), con procedimiento post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Los valores de p < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Análisis de la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-18 e IL-23

La administración de 25-OHC se asoció con aumento de la expresión de ARNm para IL-1β (p < 0.001). Dicha expresión se redujo en el contexto de la estimulación de los cultivos con atorvastatina (p < 0.01), rosuvastatina (p < 0.001), ezetimibe (p < 0.001), el tratamiento combinado con atorvastatina más ezetimibe (p < 0.001) o la aplicación combinada de rosuvastatina y ezetimibe (p < 0.05).

La administración de 25-OHC se asoció con aumento de la expresión de ARNm para IL-18 (p < 0.001). Sin embargo, los niveles disminuyeron luego del tratamiento con atorvastatina (p < 0.001), rosuvastatina (p < 0.05), atorvastatina más ezetimibe (p < 0.01) o rosuvastatina más ezetimibe (p < 0.001). En cambio, el tratamiento exclusivo con ezetimibe no fue eficaz para revertir los efectos del 25-OHC (p > 0.05).

La administración de 25-OHC se asoció con aumento de la expresión de ARNm para IL-23 (p < 0.01). Este efecto se redujo con el uso de atorvastatina (p < 0.001) o rosuvastatina (p < 0.001). En cambio, los tratamientos con ezetimibe, atorvastatina más ezetimibe o rosuvastatina más ezetimibe fueron incapaces de revertir el efecto de 25-OHC (p > 0.05).

Análisis de la expresión de genes de citoquinas antiinflamatorias (TGF-β, IL-10 e IL-37)

El 25-OHC disminuyó de manera significativa la expresión de ARNm para IL-10 e IL-37 en HUVEC, después de 24 horas de cultivo, en comparación con los controles no estimulados (p < 0.05). El tratamiento con atorvastatina y rosuvastatina aumentó estos niveles, mientras que no se observaron efectos significativos con ezetimibe, ezetimibe más atorvastatina o ezetimibe más rosuvastatina (p > 0.05).

El 25-OHC aumentó de manera significativa la expresión de ARNm para TGF-β en HUVEC, luego de 24 horas de cultivo, en comparación con las células no estimuladas (p < 0.001). La expresión se redujo exitosamente con el tratamiento con atorvastatina (p < 0.001), rosuvastatina (p < 0.001), atorvastatina más ezetimibe (p < 0.001) o rosuvastatina más ezetimibe (p < 0.001), aunque no se observaron cambios en las células tratadas solo con ezetimibe (p < 0.05).

Análisis de la expresión de genes y niveles de IL-35 (IL-12, EBI3)

El 25-OHC aumentó la expresión de ARNm para EBI3 (p < 0.001). Sin embargo, este efecto se redujo luego de la exposición a rosuvastatina (p < 0.001) y a ezetimibe más rosuvastatina (p < 0.01). No se observaron efectos significativos para ezetimibe, atorvastatina o ezetimibe más atorvastatina (p > 0.05).

El 25-OHC aumentó la expresión de ARNm para IL-12A (p < 0.001); el efecto se anuló con el tratamiento con atorvastatina (p < 0.001) y con rosuvastatina (p < 0.001). Asimismo, la exposición a ezetimibe más atorvastatina y a ezetimibe más rosuvastatina disminuyó la expresión del gen de IL-12A, aunque el efecto fue más débil (p < 0.05). No se observaron efectos significativos con ezetimibe (p > 0.05).

El 25-OHC aumentó los niveles de IL-35 (p < 0.001). El efecto se suprimió con rosuvastatina (p < 0.01) y con ezetimibe más rosuvastatina (p < 0.001), pero no con atorvastatina, ezetimibe o ezetimibe más atorvastatina (p > 0.05).

Discusión y conclusión

Las estatinas, como monoterapia o en combinación con ezetimibe, son eficaces para el tratamiento de la aterosclerosis y la prevención de eventos cardiovasculares. La inflamación crónica, la proliferación vascular y la aparición de aterosclerosis están determinadas, en parte, por el contenido de esteroles oxidados en sangre. En este estudio se compararon los efectos pleiotrópicos directos de la atorvastatina y la rosuvastatina, el ezetimibe, y sus combinaciones, sobre la expresión de ARN para citoquinas proinflamatorias (IL-1β, IL-18 e IL-23) y para citoquinas antiinflamatorias (TGF-β, IL-35, IL-10 e IL-37) en células endoteliales dañadas con 25-OHC. También se determinaron los niveles de IL-35.

En las células HUVEC previamente dañadas con 25-OHC, la exposición a atorvastatina y a rosuvastatina disminuyó la expresión de ARNm para citoquinas proinflamatorias y aumentó la expresión de ARNm para citoquinas antiinflamatorias. Solo la incubación con rosuvastatina y con rosuvastatina más ezetimibe disminuyó los niveles de IL-35, a nivel de ARNm y de proteína. La exposición a ezetimibe redujo la expresión de IL-1β, mientras que el tratamiento con rosuvastatina más ezetimibe y con atorvastatina más ezetimibe revirtió los efectos del 25-OHC sobre el ARNm para IL-1β, IL-18 e IL-35.

En conclusión, los resultados de este estudio indican que la rosuvastatina es el fármaco que se asocia con los efectos antiinflamatorios más intensos, y el mejor en términos de reducción de los efectos de los esteroles oxidados. Las dos estatinas analizadas se produjeron efectos antiinflamatorios más pronunciados respecto de ezetimibe; más aún, los efectos favorables que se observaron en el contexto de la exposición a los tratamientos combinados obedecerían a los efectos favorables de las estatinas. Sin embargo, se destaca la limitación relacionada con el hecho de que los hallazgos in vitro no pueden extrapolarse a lo que ocurre in vivo en el proceso de la aterosclerosis. Aunque los resultados sugieren que en condiciones experimentales específicas la terapia combinada con ezetimibe más estatinas no disminuye aún más la expresión de citoquinas proinflamatorias, respecto del uso exclusivo de estatinas, este hallazgo no significa que estas combinaciones no se asocien con beneficios adicionales en otros tejidos o células que participan en el proceso aterosclerótico in vivo.