Introducción y objetivos 

La disfunción cardíaca en la enfermedad renal crónica (ERC) cursa con calcificación vascular y cardiomiopatía urémica, que causa hipertrofia y fibrosis. La mayoría de los pacientes sometidos a diálisis crónica presenta hipertrofia del ventrículo izquierdo (HVI), que es un predictor de mortalidad y se observa con más frecuencia desde el estadio 3 de la ERC. 

Originalmente, Klotho se definió como una proteína antienvejecimiento. En la actualidad se clasifica en tres tipos, alfa, beta y gamma, con diversas funciones. La forma transmembrana de alfaKlotho (en este estudio, Klotho) sirve como correceptor del factor de crecimiento fibroblástico FGF23, que regula el equilibrio externo del fósforo y puede circular como Klotho soluble (solo el dominio extracelular). En la ERC se observa la reducción en los niveles plasmáticos de Klotho, en tanto que el aumento de esta proteína se asocia con la atenuación de la calcificación vascular. 

Los autores llevaron a cabo un estudio experimental en modelos animales y cultivos de fibroblastos y miocardiocitos con el fin de evaluar la relación entre Klotho, el fósforo y la aparición de hipertrofia y fibrosis, así como su potencial reversión con la administración externa de la proteína. Este estudio evaluó los siguientes puntos: la HVI y la fibrosis se detectan en la deficiencia primaria, genética, de Klotho, en tanto que la deficiencia secundaria se observa ante el alto consumo dietario de fosfatos, el envejecimiento y la ERC; la HVI es previa a la fibrosis y se asocia con disfunción ventricular izquierda; los niveles altos de fósforo y bajos de Klotho se correlacionan con HVI más grave y fibrosis; los niveles altos de FGF23 se asocian con HVI más grave y fibrosis, pero solo en presencia de niveles moderados a bajos de Klotho; in vitro, Klotho bloquea la hipertrofia producida por el factor transformador de crecimiento (TGF) beta1 y la angiotensina II (Ang II) y atenúa la regulación en más de los marcadores de fibrosis provocada por el TGF-beta1, la Ang II y los niveles altos de fosfatos en cultivos de fibroblastos cardíacos. 

Métodos 

Los modelos en ratas y ratones fueron aprobados por el University of Texas Southwestern Medical Center. Se utilizaron ratones con hipomorfismo Klotho y Tg-Kl y modelos roedores de ERC (nefrectomía unilateral y nefrectomía 5/6). En los animales en los que se empleó placebo se realizó laparotomía y los riñones se manipularon manualmente. La dieta rica en fosfatos consistió en 2% de fosfato durante 18 semanas. La función cardíaca se evaluó mediante resonancia magnética nuclear. Las células ventriculares provenientes de ratas neonatas se cultivaron y evaluaron con inmunofluorescencia con anticuerpo monoclonal de rata dirigido contra Klotho humano. Para evaluar la morfología cardíaca y la fibrosis se utilizaron secciones cardíacas en parafina y evaluación con tricrómico y otros métodos estandarizados. Además, mediante inmunoblot con anticuerpos anti-Klotho se evaluaron miocardiocitos, fibroblastos, riñones y orina. 

Resultados

Disfunción cardíaca, hipertrofia y fibrosis en ratones con déficit de Klotho  

Se silenció el gen que codifica Klotho. Los ratones homocigotas para el gen silenciado de Klotho (k1/k1) mueren bajo condiciones de estrés, por lo que la investigación se realizó en ratones heterocigotas (k1/+). Se realizó resonancia magnética nuclear en la semana 12, cuando los grupos tuvieron el mismo peso, pero los ratones con déficit de Klotho presentaron peor fracción de eyección, volumen sistólico y gasto cardíaco, con mayor grosor parietal, en comparación con los ratones control y los ratones transgénicos que sobreexpresaron Klotho (Tg-Kl). También se comprobó mayor fibrosis en los ratones k1/+, pero se destaca que en los ratones evaluados antes de la semana 12 ya había hipertrofia y, luego de la semana 12, hipertrofia con fibrosis, lo que sugiere que la primera precede a la segunda. Los ratones homocigotas presentaron elevación de la alfa actinina y de la cadena pesada de la beta miosina, ambos marcadores de hipertrofia; además, se suprimió la fosforilación de Smad2/3 y la quinasa reguladora por señales extracelulares Erk, que están relacionadas con la fibrosis. 

Hipertrofia cardíaca y fibrosis en la ERC 

Se investigó si una causa secundaria de deficiencia de Klotho, como la ERC, puede producir alteraciones similares. Se utilizó nefrectomía unilateral y, luego se provocó insuficiencia por isquemia-reperfusión en el riñón contralateral, seguida de una dieta rica en fosfatos (2%) o mediante nefrectomía 5/6. En ambos modelos de ERC se comprobó hipertrofia (aumento de alfa actinina) y fibrosis (aumento de alfa actina del músculo liso y del colágeno tipo 1). También se verificó el aumento de fosfo-Smad2/3 y fosfo-Erk en el corazón urémico, lo que sugirió la activación de estas vías de señalización. 

Las bajas concentraciones de Klotho circulante y renal, el envejecimiento y la dieta rica en fosfatos inducen remodelado cardíaco patológico en forma sinérgica 

En la actualidad, la fosfotoxicidad se reconoce cada vez más como un factor potencial de riesgo para las enfermedades cardiovasculares y renales. En los tres grupos de ratones con diferente expresión genética de Klotho, la dieta rica en fosfatos durante 12 semanas redujo los niveles de Klotho en riñones, plasma y orina. Al realizar el experimento en ratones de 12 meses se observaron niveles aun más bajos de Klotho que en los ratones jóvenes. La hipertrofia y la fibrosis fueron más marcadas en los ratones k1/+ y en los de 12 meses. Klotho suprime la fosfotoxicidad, en tanto que la edad la exacerba. Además, se observó activación de fosfo-Smad2/3 y fosfo-Erk, más pronunciada en los grupos con bajos niveles de Klotho y en ratones de mayor edad, en forma similar a lo que ocurre en el corazón urémico. 

Efectos directos de Klotho soluble en los cardiomiocitos neonatales y los fibroblastos cardíacos in vitro 

Los estudios in vivo no pueden concluir de manera fehaciente si existe un efecto directo de Klotho a nivel cardíaco; por ello, se utilizaron cultivos de miocardiocitos y fibroblastos de rata para determinar si Klotho puede proteger directamente dichas células contra el daño provocado por el TGF-beta1, la Ang II y los niveles altos de fosfatos. Estos mecanismos incrementan el tejido conectivo mediante el factor de crecimiento del tejido conectivo y del colágeno tipo 1. Se demostró que ambos parámetros se redujeron con Klotho. Las vías de señalización fueron activadas de manera diferencial en fibroblastos y en miocardiocitos. 

Correlación entre los valores bioquímicos, hormonales y Klotho y la hipertrofia y la fibrosis 

Para poder determinar los cambios en el Klotho plasmático, en función del envejecimiento, el fósforo y la ERC, se definió un nivel de Klotho normal (100%) como aquel hallado en ratones jóvenes, sin mutación de Klotho y alimentados con una dieta regular. Se observó una correlación inversa entre el nivel plasmático de Klotho y la hipertrofia y la fibrosis cardíaca, y una correlación directa con los niveles plasmáticos de fósforo. Luego de realizar un análisis multivariado se comprobó que el nivel plasmático de Klotho y el fósforo se relacionaron con el peso cardíaco y con los marcadores de fibrosis, que se consideraron predictores independientes de remodelado cardíaco adverso. El FGF23 no fue un predictor independiente de remodelado, pero al ajustar el nivel plasmático de Klotho a la concentración de FGF23 se demostró una potenciación del daño cardíaco en el grupo con bajo nivel de Klotho y alto de FGF23.

Discusión y conclusiones 

Los ratones con bajos niveles de Klotho presentaron alteraciones cardíacas, pero no insuficiencia cardíaca florida. La fragilidad y la muerte súbita impidieron realizar resonancia magnética nuclear a los ratones con déficit total de Klotho (k1/k1), pero los autores asumen que este grupo tendría mayor daño cardíaco, incluso durante el desarrollo embriológico. 

Los resultados hallados sugieren que la deficiencia de Klotho desempeña un papel causal en el remodelado cardíaco. Previamente, otros autores habían descrito la disfunción del nodo sinusal, la única parte del corazón que expresa Klotho. Se observa ARNm de Klotho, pero no expresión de la proteína en la membrana. 

El envejecimiento, la fosfotoxicidad y la ERC parecen contribuir de manera individual y sinérgica en la disminución de los niveles plasmáticos de Klotho, lo que induciría el remodelado cardíaco, por un efecto directo sobre los miocardiocitos y los fibroblastos y por un efecto indirecto mediante FGF23. Otros estudios destacaron que, de manera paradójica, los niveles excesivamente elevados de Klotho pueden ser dañinos, dado que parecen provocar hipofosfatemia, osteomalacia y fracturas patológicas. A nivel renal, las vías de señalización de hipertrofia y fibrosis son similares a las cardíacas, por lo que Klotho parece cumplir una función esencial en el daño renal progresivo. 

Los fibroblastos activados provocan fibrosis, con mayor riesgo de arritmias y disfunción diastólica. La fosfotoxicidad es un factor de riesgo tanto para los riñones como para el corazón y podría deberse a la disminución de Klotho sistémico y renal o al incremento en la paratohormona y la reducción de la vitamina D₃. Sin embargo, los únicos predictores independientes de remodelado cardíaco en el análisis multivariado fueron Klotho y el fosfato, en tanto que FGF23 no fue un predictor por sí mismo pero, según los autores, podría ser un mediador patogénico en casos de deficiencia de Klotho. 

En el presente estudio se demostró que los niveles bajos de Klotho circulante, provocados por cualquier causa, como modificaciones genéticas, ERC, la carga de fosfatos dietarios o el envejecimiento, se asociaron con hipertrofia, fibrosis y disfunción cardíaca. Además, Klotho posee efectos antifibróticos in vitro. Así, los autores destacan la importancia fisiopatológica del déficit de Klotho, que podría provocar la miocardiopatía urémica, y concluyen que será un objetivo diagnóstico y terapéutico potencial a futuro.