PEPTONA PAPAÍNICA DE CORAZÓN DE VACA COMO FUENTE DE NUTRIENTES PARA LOS MICROORGANISMOS
Raisa Zhurbenko1,Claudio Rodríguez Martínez2,Tamara Lobaina Rodríguez3,Orestes Darío López Hernández4 y Diana Rosa Viera Oramas5
1Doctor en Ciencias de los Alimentos, Centro Nacional de Biopreparados, La Habana, Cuba
2Doctor en Ciencias Técnicas, Centro Nacional de Biopreparados, La Habana, Cuba
3Master en Ciencias, Centro Nacional de Biopreparados, La Habana, Cuba
4Master en Ciencias, Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos, La Habana, Cuba
5Master en Ciencias, Centro Nacional de Biopreparados, La Habana, Cuba
La Habana, Cuba (SIIC)
La peptona papaínica del músculo de corazón de res puede ser utilizada como componente fundamental de las combinaciones nutritivas para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.
Las peptonas y los extractos proteicos son excelentes fuentes naturales de aminoácidos, péptidos y proteínas para el cultivo de los microorganismos. El número de estos productos disponibles en el mercado es significativo. Ellos se obtienen, tradicionalmente, por la digestión enzimática o hidrólisis ácida de sustratos naturales de origen proteico, tales como carne de vaca, leche, caseína, gelatina, plantas o biomasa de microorganismos.
Estos sustratos son proteínas de alto valor nutritivo, todas comprometidas con la alimentación humana. Por esta razón, varios autores realizan numerosos intentos de obtener peptonas a partir de fuentes de proteínas no tradicionales y subproductos, utilizando para ello los residuos de la industria pesquera, subproductos de la industria cárnica, microalgas, entre otros. En la actualidad existen informes sobre la utilización de tejidos animales, procedentes de porcinos y equinos, o la combinación de ambos.
El corazón de vaca es un subproducto de la industria cárnica y su valor nutritivo es menor que el de la carne. La presencia de grasa, tejido conectivo y vascular lo hacen menos atractivo para la producción de peptona y resulta en un desafío tecnológico obtener un producto de alta calidad que promueva el crecimiento microbiano de manera similar a la peptona de carne de vaca, usualmente conocida como peptona bacteriológica.
Varios autores han desarrollado métodos para la obtención de los digeridos del músculo de corazón animal como ingredientes de medios de cultivo para los microorganismos. Para esto, es necesaria la comparación del comportamiento de la base nutritiva obtenida con peptonas estándar ya evaluadas previamente.
El objetivo de la presente investigación* consistió en el desarrollo de un método de obtención de la peptona papaínica de corazón de vaca y la comparación de su capacidad de promoción de crecimiento microbiano con las peptonas comúnmente empleadas en microbiología.
Se utilizó corazón de vaca recolectado en el matadero Antonio Maceo, de la Ciudad de La Habana, transportado en vehículos refrigerados a temperatura de 2°C a 8°C y almacenado a temperatura de -20 °C por un período hasta tres meses.
El corazón se sometió a un proceso de limpieza manual, eliminando los tejidos grasos, conectivos y vasculares. El tejido del músculo de corazón de vaca, se molió a través de una rejilla con el diámetro de orificio de 3 mm. El picadillo obtenido se mezcló con agua desionizada. Se realizó el tratamiento térmico consistente en hervir la mezcla por 30 minutos. Se filtró por placa clarificante al vacío, se concentró en un rotoevaporador y se deshidrató por aspersión en un secador piloto para la obtención de la peptona papaínica de corazón de vaca (PPCV).
Se estudió la influencia del pH de hidrólisis y de la cantidad de la enzima papaína sobre la calidad de la PPCV, obtenida mediante un diseño experimental completamente aleatorizado, según un plan factorial 22, ejecutando cada determinación para las variables a analizar por triplicado (n = 3). Los niveles de papaína a utilizar se determinaron previamente por los autores, según las experiencias preliminares. Como variables a analizar se seleccionaron los contenidos de nitrógeno amínico (Nam), nitrógeno total (Nt), cloruros (en forma de NaCl) (NaCl) y la relación entre nitrógeno amínico y nitrógeno total (Nam/Nt). Se estudió la composición química de PPCV y su capacidad de promoción del crecimiento para varios microorganismos. La determinación de calcio, magnesio, cinc, cobre, hierro, sodio, potasio, cobalto y plomo se realizó en un espectrofotómetro de absorción atómica SP9.
La determinación de la densidad óptica de los cultivos microbianos en el tiempo, para un grupo de cepas microbianas de colección (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Bacillus subtilis ATCC 6633) se realizó en un medio especialmente diseñado al efecto que contenía 2% de PPCV; 0.5% NaCl y 0.1% de Na2HPO4; pH 7.0-7.2. Los valores de la densidad óptica de los cultivos a 37°C se registraron cada una hora durante ocho horas. Los cultivos de B. subtilis se incubaron a 30°C. Los valores se compararon con los obtenidos en un medio formulado con la peptona bacteriológica tomada como referencia (Biotécnica Internacional, México) (PBBI).
Se estudió el desempeño de la PPCV, en comparación con PBBI, y con peptona bacteriológica de Marine Chemicals, India (PBMC), en agar dextrosa de Sabouraud frente a varios microorganismos de la ATCC: Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 17111, Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y Saccharomyces uvarum ATCC 9080, por el método de siembra por vertimiento en placa.
Se determinó la densidad microbiana en el tiempo estudiando el incremento de la absorbancia a 640 nm (espectrofotómetro PU 8620). Los recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) se realizaron con ayuda de un contador de colonias. Se calculó la desviación estándar de todos los valores de los parámetros químicos. Con los resultados obtenidos en el diseño experimental 22 se procedió a adaptar el siguiente polinomio:
y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2,
según López Planes. Los coeficientes "bn" se calcularon mediante el sistema matricial B = (X’X)-1X’Y, donde: Y = matriz de los resultados experimentales; X = matriz de las variables independientes. Su significación para p < 0.5 se determinó mediante la prueba de Student. La adecuación del modelo se detectó mediante la prueba de Fisher.
El procesamiento estadístico de los datos experimentales obtenidos en el diseño factorial 22 ofreció los modelos siguientes para el Nam, Nt, Nam/Nt y NaCl, respectivamente, todos expresados en porcentaje:
y = 2.75 – 0.27x1 + 0.03x2- 0.03x1x2
y = 12.93 + 0.18x1
y = 21.27 – 2.36x1
y = 5.59 + 0.40x2
Al observar los resultados, juntamente con las ecuaciones de regresión obtenidas, se pudo concluir que el pH (x1) es la variable que ejerce la mayor influencia (inversamente proporcional) sobre el contenido de Nam y, seguidamente, influyó la cantidad de enzima papaína de 700 TU de actividad utilizada (x2). Se detectó que el Nam aumentó más en las variantes realizadas con 0.86 g de enzima por un kilogramo de sustrato. La interacción de ambas variables favoreció el incremento de Nam al emplear el valor mínimo de pH 5 y el valor máximo de enzima 0.86 g/kg. Estos resultados correspondieron a la variante tres, con la cual se logró el valor de Nam de 3.07 ± 0.05% y se obtuvo una diferencia significativa para p < 0.05 de esta variante con respecto a las tres restantes. Se obtuvo diferencia significativa (p < 0.05) para el contenido de Nt en la variante cuatro (13.20 ± 0.21%), en comparación con las tres primeras. La ecuación de regresión para el Nt mostró la mayor influencia de la variable x1 con su nivel superior (pH 6.5) sobre el contenido de Nt en el producto final. La relación Nam/Nt alcanzó su mayor nivel para la variante tres del diseño (23.95 ± 0.46%) y resultó significativamente diferente (p < 0.05) con respecto a los valores de este índice, logrados con las variantes dos (19.03 ± 0.20%) y cuatro (18.79 ± 0.36%). En cuanto al contenido de NaCl, los valores 5.33 ± 0.46%; 5.04 ± 0.51%; 6.13 ± 0.24% y 5.84 ± 0.34%, corresponden a las variantes uno, dos, tres y cuatro, respectivamente.
La nueva peptona mostró un valor reducido de pérdida por desecación (3.17 g/100 g), y el nitrógeno amínico constituye alrededor del 25% del nitrógeno total.
Se observan los resultados del desempeño de la PPCV, en comparación con la PBBI, al estudiar la densidad microbiana en el tiempo.
El hallazgo de que el valor del pH es la variable que influye de manera más significativa sobre el grado de hidrólisis en la producción de peptonas coincide con resultados anteriores divulgados por los autores y por otros investigadores.
El valor más elevado del pH estudiado influyó en el aumento de la solubilidad de las proteínas del tejido del músculo de corazón de vaca al alejarse del punto isoeléctrico de la mayoría de ellas. Este planteamiento se corroboró con la ecuación de regresión para el nitrógeno total, donde se puso de manifiesto la influencia de la variable x1 con su nivel superior, elevando el valor de Nt al máximo.
A manera de resumen, se puede afirmar que la mejor variante de este diseño resultó ser la número tres, corroborando, de esta forma, la conveniencia de realizar la hidrólisis a pH 5.
Los valores de PD para PPCV se encontraron por debajo del 6%, coincidiendo con los valores informados para los digeridos enzimáticos de corazón deshidratados 2.8%-6% que, a su vez, coinciden con los establecidos para las peptonas bacteriológicas 3.0%-6.0%. Estos hallazgos concuerdan con los informes de Mourey Valdés y col., quienes plantean que para los países con el clima tropical, el límite de este indicador se encuentra normalmente en valores iguales o inferiores al 8%. Los niveles alcanzados para este indicador garantizan la mayor estabilidad del producto durante la conservación, al impedir las interacciones químicas.
El análisis del contenido de macroelementos y microelementos demostró que la peptona de corazón desarrollada tiene un elevado contenido de elementos tales como K, Ca y Fe, fundamentales para el crecimiento microbiano y que inciden en la formación del material genético, la síntesis de enzimas y de otros metabolitos fundamentales y los procesos de intercambio de la célula con el exterior.
Los niveles de otros elementos, tales como Mg, Cu, Pb, Zn, Na y Co, resultaron satisfactorios y característicos de las peptonas en general: Mg 206-1 000 ppm, Cu 2-5 ppm, Zn 9.2-27 ppm, Co 0.1 ppm, comunicados por Oxoid, para peptonas bacteriológica y de carne (Mg, Co, Pb, Zn y Co); por Biomérieux para peptona de carne y digerido pancreático de corazón (Mg), y por Solabia para digerido enzimático de corazón (Mg).
Un grupo de aminoácidos de la peptona obtenida en la presente investigación superó el contenido de las peptonas de corazón referidas en la bibliografía. Entre ellos se destacan aminoácidos imprescindibles para el crecimiento de una amplia gama de microorganismos: cisteína, histidina, metionina, fenilalanina y tirosina. El contenido de otros aminoácidos, de suma importancia para la promoción de crecimiento, se asemeja o se encuentra en el rango característico de los productos obtenidos a partir de corazón, comercializados en la actualidad, entre ellos: alanina, glicina, lisina, prolina y triptófano. Haciendo un balance del contenido de aminoácidos, y teniendo en cuenta los resultados del crecimiento microbiano de los microorganismos ensayados en los medios formulados con la peptona de corazón en etapas anteriores, era de esperar que la PPCV, obtenida por el método desarrollado, promoviera adecuadamente el crecimiento de diferentes gérmenes microbianos.
Los resultados del presente estudio, relacionados con el aumento de la densidad microbiana en el tiempo, concuerdan con los presentados por otros autores, quienes informaron el excelente crecimiento para varios microorganismos en medios líquidos utilizando digerido enzimático de corazón de cerdo.
Se puso de manifiesto la factibilidad de la utilización de PPCV en el cultivo y enumeración de mohos y levaduras al demostrar que la peptona obtenida en este estudio promueve el crecimiento de los microorganismos estudiados de manera equivalente (sin diferencia significativa o menor del 10%) a las empleadas en los medios controles (con PBBI y PBMC). Estos hallazgos coinciden con las investigaciones realizadas por otros autores que demuestran que la utilización de digerido enzimático de músculo de corazón favorece el crecimiento de diferentes microorganismos gramnegativos y grampositivos.
Se puede considerar la PPCV como una peptona bacteriológica, de acuerdo con la norma ISO/TS 11133-1:2000 que establece los criterios para la armonización de la descripción de varios componentes de medios de cultivo. Los índices de calidad y el desempeño de esta base nutritiva la ubican en el rango de productos considerados como peptonas; es apropiada, además, para el cultivo de bacterias y hongos en los medios de cultivo para diagnóstico clínico y sanitario.
