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RESECCION DE TEJIDO HUMANO COLONICO; UN NUEVO METODO PARA EVALUAR LA ADHESIVIDAD IN VITRO DE LOS PROBIOTICOS
(especial para SIIC © Derechos reservados)
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ouwehand.jpg Autor:
Arthur C. Ouwehand
Columnista Experto de SIIC



 Artículos publicados por Arthur C. Ouwehand 
Coautor
Satu Westerlund* 
MSc, University of Turku, Finlandia*

Recepción del artículo: 21 de agosto, 2003

Aprobación: 0 de , 0000

Primera edición: 7 de junio, 2021
Segunda edición, ampliada y corregida:  7 de junio, 2021

Conclusión breve
La elección del probiótico más adecuado puede depender de diversos factores. Identificar el tipo de lesiones que existe en el intestino y el lugar donde se encuentran, así como seleccionar una dieta adecuada, puede ser establecido a través del estudio de tejido intestinal humano.

Resumen

La adhesividad a la mucosa intestinal es uno de los criterios de selección habituales para las bacterias probióticas. Los modelos comúnmente utilizados para evaluarla in vitro, como los cultivos tisulares de células y mucus intestinal, toman en cuenta solamente una parte del intestino. Aquí describimos el uso de material humano resecado como una alternativa para estudiar in vitro la adhesividad de estas bacterias al tejido enterocolónico.Se estudió la adhesividad para piezas de tejido humanas de diferentes partes del colon y para distintas enfermedades intestinales. Además, se evaluó el efecto de un esquema alimentario basado en avena líquida sobre la adhesividad de las bifidobacterias.Se vio que dos de las muestras exploradas exhiben sitios específicos para la unión mientras que otras dos tienen sitios específicos de la enfermedad. El esquema alimentario aumentaba en más del doble la unión de dos de las bifidobacterias y no afectaban la capacidad para adherirse de las otras.Los resultados muestran que el tejido intestinal humano provee un nuevo modelo para la evaluación de los probióticos y permite la investigación de la adhesividad específica, tanto del sitio como de la enfermedad.Esto puede hacer factible la selección de los probióticos observando el funcionamiento sobre sitios específicos o sobre lesiones existentes en el intestino.

Palabras clave
Probióticos, adhesividad, mucosa colónica, mucosa intestinal, infección intestinal, modelos, bifidobacterias, lactobacillus, in vitro

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
página www.siicsalud.com/des/expertos.php/20080

Especialidades
Principal: Gastroenterología, 
Relacionadas: Farmacología, Gastroenterología, Medicina Interna, Nutrición, 

Enviar correspondencia a:
Arthur C. Ouwehand, BSc, MSc, PhD. Functional Foods Forum, University of Turku, 20014 Turku, Finland

RESECTED HUMAN COLONIC TISSUE; A NEW METHOD TO ASSESS THE ADHESION OF PROBIOTICS IN VITRO

Abstract
Adhesion to the intestinal mucosa is one of the main selection criteria for probiotic bacteria. Models commonly used to asses probiotic adhesion in vitro, like tissue culture cells and intestinal mucus, take into account only part of the intestinal mucosa. Here we describe the use of resected human intestinal material as an alternative method to study probiotic adhesion in vitro.Adhesion of selected probiotics was studied to human intestinal tissue pieces from different parts of the colon and to tissue from different intestinal diseases. In addition, the effect of a food matrix (liquid oat based product) on the adhesion of bifidobacteria was investigated.Two of the tested strains were found to exhibit site specific adhesion while two other strains were observed to have disease specific adhesion. The food matrix tested, more than doubled the adhesion of two of the tested bifidobacteria and did not affect the adhesion of the others.The results show that resected human intestinal tissue provides a valuable new model for the assessment of probiotics and allows for the investigation of site and disease specific adhesion. This may make it possible to select for specific probiotics aimed at functioning as specific sites or lesions in the intestine

Key words
Probióticos, adhesividad, mucosa colónica, mucosa intestinal, infección intestinal, modelos, bifidobacterias, lactobacillus, in vitro

RESECCION DE TEJIDO HUMANO COLONICO; UN NUEVO METODO PARA EVALUAR LA ADHESIVIDAD IN VITRO DE LOS PROBIOTICOS

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo
Introducción
Los probióticos correspondientes a bacterias formadoras de ácido láctico (BAL) son habitualmente utilizados para balancear la flora intestinal y tratar las alteraciones que afectan su equilibrio [13]. La adhesividad de estos agentes a la mucosa intestinal es considerada importante para el cumplimiento de diversos efectos beneficiosos que poseen sobre la salud, tales como la exclusión por competencia de los gérmenes patógenos [3], la modulación de la respuesta inmunológica [9], la colonización transitoria prolongada [2] y el refuerzo de la curación de la mucosa dañada [5]. Este mecanismo es entonces uno de los criterios de selección mayor de los probióticos [7].Para el estudio sistemático de las propiedades de unión de numerosos agentes potenciales de este tipo, dos modelos in vitro se utilizan con frecuencia: cultivos de células tisulares y de mucus intestinal. Las células de cultivo, habitualmente las Caco-2, y en una menor medida las HT-29, han sido ampliamente elegidas para investigar esta capacidad de interactuar con los enterocitos que poseen los probióticos [6]. Una desventaja posible con el uso de cultivos tisulares es que se valen de células cancerosas [25] que pueden ser o no diferentes de los enterocitos normales. Más aún, los tejidos de los cultivos, con la excepción de las células HT-29 MTX no tienen una capa mucosa, como se encuentra normalmente sobre las células de las vellosidades intestinales.El otro modelo empleado para estudiar la adhesividad, el modelo mucoso, permite el estudio de la unión al mucus desde diferentes grupos de individuos; por edad [17], por el estado de salud [10], por especies [24], por el tipo de dieta [16], etcétera. Una posible complicación de este método es que no contiene los enterocitos subyacentes aun cuando solamente una parte menor de las bacterias intestinales parecen estar asociadas con ellos [15].Ninguno de los dos modelos considera la presencia de una flora normal, pese a que está generalmente aceptado que provee de exclusión competitiva contra micro-organismos exógenos [1] y podría esperarse que interfiera con la adhesividad de los probióticos.Con el objeto de incorporar las tres partes medias de la mucosa intestinal humana, enterocitos, mucus y la flora normal, hemos desarrollado un modelo nuevo a través del uso de tejido intestinal humano resecado [21]. Se empleó este sistema para evaluar la capacidad de los agentes seleccionados para fijarse a diferentes sitios del colon [21] y tejidos de tres enfermedades intestinales frecuentes: carcinoma rectal, diverticulitis y enfermedad intestinal inflamatoria. Además, el modelo ha sido utilizado para evaluar la influencia de un esquema alimentario sobre la adhesión de los probióticos nuevos a la mucosa intestinal [11].

Métodos y materiales
El uso de material intestinal humano resecado fue aprobado por la junta del comité de ética de la Universidad de Turku y del Hospital Central de la Universidad de Turku. Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes con diverticulitis, carcinoma rectal, enfermedad intestinal inflamatoria y pacientes sometidos a operaciones por motivos diferentes de la inflamación o malignidad (controles). Se colocó el tejido resecado en hielo antes de los 20 minutos de la resección; fue cortado longitudinalmente y lavado suavemente en sal de fosfato con pH amortiguado (SFA; pH 7,2; 10 mM de fosfato) con 0,01% de gel hasta que ningún contenido fuera visible (figura 1), para dejar la superficie de la mucosa intacta. Desde el tejido, 9 mm de piezas circulares fueron cortadas y conservadas a -70 °C en SFA con 40% de glicerol hasta que fuera utilizada. No se observaron diferencias significativas en la adhesividad entre las muestras frescas y congeladas (datos no mostrados).



Figura 1. Tejido colónico humano. Nótese la lesión en la mucosa en la parte central del tejido.
La unión a sitios diferentes del colon (ciego, colon ascendente, colon transverso derecho, colon transverso izquierdo y colon descendente) fue investigada para Lactobacillus rhamnosus GG (Valio Ltd. Helsinki, Finlandia), L casei Shirota (Yakult Pte. Ltd. Singapore), L. johnsonii La1, aislada de un producto LC1 Nestlé y Bifidobacterium lactis Bb12 (Chr. Hansen, Hørsholm, Dinamarca). La adhesividad específica por enfermedad fue evaluada para: L. rhamnosus GG; L. rhamnosus LC 705, Valio Ltd.; L. rhamnosus E-800, VTT, Espoo, Finlandia; L. breve PEL 1, Universidad de Helsinki, Helsinki, Finlandia y L. reuteri ING1, Ingman, Söderkulla, Finlandia. La influencia de un patrón alimentario, de un medio líquido a base de avena [14], sobre la adhesividad a la mucosa se evaluó para 14 bifidobacterias potencialmente probióticas. Los lactobacilos crecieron bajo condiciones de anaerobiosis en de Man, Rogosa y Sharpe broth (MRS; Merck, Darmstadt, Alemania) y las bifidobacterias se desarrollaron en forma anaerobiótica en el medio anaerobio de Gifu (MAG; Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Japón). Para marcar isotópicamente la bacteria desde el punto de vista metabólico, se agregó [metil-1,2-3H]-timidina (120 Ci/mmol; Amersham Biosciences, Reino Unido) para el lavado, nuevamente suspendido en SFA y el número de bacterias ajustados a 107-108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml antes del ensayo de adhesividad (ver más adelante).Para evaluar la capacidad de unión al tejido colónico humano, las fracciones de tejido fueron disueltas a temperatura ambiente y lavadas suavemente en ácido 4(2 hidroxietil) 1 piperazinaetano sulfónico (HEPES) amortiguada con solución salina de Hanks. Se ubicaron las piezas de tejido en los dispositivos de 24 placas de cultivo tisular con el lado correspondiente a la mucosa hacia arriba. Se agregaron 500 µl de suspensión bacteriana marcados por radioisótopos a los dispositivos para cubrir el tejido. Las piezas fueron incubadas durante 1 hora a 37 °C en un baño de agua para favorecer la unión de las bacterias. Después de lavar suavemente dos veces con SFA, la mucosa fue separada entonces y digerida durante la noche con 300 ml al 30% de agua oxigenada (H2O2) y 150 µl al 70% de ácido perclórico a 70 °C. Después del proceso de digestión, se determinó la radiactividad por centellografía líquida. La adhesividad está expresada como el porcentaje de radiactividad recuperada después de la unión, relacionada con la radiactividad de las suspensiones bacterianas agregadas al tejido colónico [8].Cada experimento fue realizado con tres muestras paralelas con el objeto de ajustar por posibles errores durante los procesos del ensayo. Los resultados de la adhesividad se muestran como el promedio ( desvío estándar) de los tres experimentos independientes.

Resultados
La adhesividad al tejido del colon ascendente fue significativamente más baja (p < 0.05; prueba de Friedman) para L. johnsnii La1 y B. lactis Bb12 que para los tejidos de otras partes del colon (tabla 1). La adhesividad específica de enfermedad fue observada para dos de las muestras probióticas examinadas (tabla 2).






En el caso de L. rhamnosus GG fue menor (p < 0.05; Mann-Whitney U test) que el tejido de control (4.9%) y el tejido de la diverticulitis (3.3%) cuando se lo comparó con tejido de IBD (9.7%) y tejido de carcinoma rectal (6.5%). La L. reuteri ING1 se adhirió significativamente mejor (p < 0.05; Mann-Whitney U test) para tejidos de IBD (8.7%) comparado con tejido de controles (3.7%), carcinoma rectal (5.3%) y diverticulitis (2.9%). Hubo una tendencia para L. rhamnosus E-800 para adherir también mejor el tejido IBD (8.9%) que el tejido de carcinoma rectal (4.2%). No obstante, esto no alcanzó significación estadística (p = 0.08; Mann-whitney U test).La exposición de la bifidobacteria potencialmente probiótica al producto líquido a base de avena reforzó significativamente (p < 0.05; Student´s t-test) la capacidad de unión de dos de las muestras examinadas de tejido colónico humano sano (tabla 3).



Discusión
La capacidad de adherirse a la mucosa intestinal es una propiedad importante de los microorganismos probióticos, al punto de ser considerado como el mecanismo clave de la funcionalidad probiótica [19]. Los métodos comúnmente usados para evaluar la capacidad adhesiva de los probióticos toman en cuenta solamente parte de la mucosa intestinal humana y pueden además dar una representación menos confiable de las cualidades de adhesión de una cepa particular. Por lo tanto es necesario el uso de varios modelos. Los métodos actualmente descritos representan a la mucosa intestinal completa (el mucus, los enterocitos y la flora) con la excepción de la mucosa asociada al sistema inmune.Así como ocurre en otros modelos in vitro, se ha observado adhesividad dependiente de la cepa. Además, nuestro método ofrece nuevas vías de caracterización de ésta en relación con el medio colónico. Dos de las cepas evaluadas mostraron unión específica de sitio en la mucosa colónica humana. Sin embargo, las diferencias son pequeñas y no está claro si son biológicamente importantes. Comparada con anteriores observaciones sobre la fijación de estos agentes a la mucosa intestinal [18], se demostró que la unión al tejido es baja. La razón para esto se desconoce, a pesar de que los bajos niveles de unión a tejidos intestinales no-linfoides que poseen los lactobacilos están de acuerdo con observaciones in vivo previas [23].Dos de las cepas examinadas exhibieron adhesión específica según la enfermedad. También aquí, las diferencias son pequeñas y la relevancia biológica todavía requiere ser precisada.Las observaciones sobre el sitio y la unión específicos según enfermedad son independientemente importantes, ya que no pueden ser estudiadas con otros modelos. Estos hallazgos pueden ayudar a explicar por qué cepas probióticas diferentes, aun de las mismas especies, tienen propiedades distintas [12]. Esta investigación ofrecería la posibilidad de elegir agentes específicos dirigidos a sitios o lesiones seleccionados en el intestino.Se ha demostrado ampliamente que la matriz alimentaria afecta la sobrevida y la funcionalidad de los probióticos, por ejemplo la leche comparada con el agua tiende a mejorarles la sobrevida [4][22]. Nosotros mostramos aquí que también un esquema alimentario no repetido todos los días influye significativamente en la adhesividad de las cepas de bifidobacterias seleccionadas para la mucosa intestinal humana. Tales elementos pueden abrir el camino a nuevas aplicaciones de estos agentes en los productos de utilización no frecuente [11]. También, en términos generales, la observación de que el patrón alimentario influye sobre la unión al intestino es importante puesto que los ensayos están normalmente realizados con amortiguadores del ph, mientras que en las aplicaciones terapéuticas habrá un esquema de alimentación definido. Este aspecto ha recibido escasa atención hasta la fecha [22].Una nueva posibilidad del uso de tejido intestinal humano resecado es el estudio de estos agentes en una forma tridimensional. Combinando la microscopia láser con bacterias probióticas marcadas con fluoresceína, la posición tridimensional de los probióticos viables en la mucosa y su interacción con los patógenos puede determinarse en tiempo real (figura 2).



Figura 2. Adhesión de Lactobacillus rhamnosus GG (marcado con rojo de Texas) y Salmonella eneterica Typhimurium (expresando una proteína fluorescente amarilla) al tejido intestinal humano tal como se observa a través de la microscopia láser. Los campos seleccionados corresponden al mismo lugar de la mucosa, pero con aumentos crecientes según se indica en el ángulo superior izquierdo de cada campo.
Esto da la posibilidad de observar in situ la adhesividad de los probióticos.En conclusión, los resultados obtenidos proveen una base importante para el desarrollo posterior más extenso de las muestras intestinales resecadas, como un modelo para el estudio de la adhesividad LAB; tomando en cuenta las interacciones entre el epitelio gastrointestinal, el mucus y los huéspedes de la flora de la mucosa. El desarrollo de este método ofrece una ventaja más amplia sobre los ensayos in vitro actuales y las nuevas medidas de la selección terapéutica LAB, por ejemplo, y la caracterización de las interacciones con la flora normal.




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