Autor: Irene Madrigal Bajo Columnista Experto de SIIC Institución: Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER) Artículos publicados por Irene Madrigal Bajo

Conclusión breve
La reciente aparición de nuevas tecnologías de alto rendimiento cada vez más sensibles y con mayor capacidad de análisis posibilita la detección de nuevos reordenamientos crípticos desequilibrados responsables de retraso mental.

Resumen

El estudio del retraso mental de origen genético es uno de los campos más complejos en genética humana debido a que presenta una heterogeneidad muy elevada, con una gran complejidad de las bases genéticas y factores ambientales que influyen sobre éstas. En estos momentos, casi la mitad de los casos de retraso mental de origen genético quedan sin un diagnóstico. El objetivo de este trabajo es aportar una visión actualizada de las recientes metodologías desarrolladas para alcanzar un diagnóstico molecular de retraso mental de origen genético para poder dar asesoramiento genético y ofrecer un diagnóstico prenatal. El primer paso es la evaluación del paciente con una exploración clínica minuciosa y la obtención de datos sobre antecedentes personales y familiares. Cuando exista una sospecha diagnóstica de un síndrome clínico reconocible que cursa con retraso mental, ésta deberá ser confirmada en el laboratorio con la técnica correspondiente. Ante casos de retraso mental en los que no existe sospecha clínica para ningún síndrome determinado se realizarán tres pruebas de forma rutinaria: cariotipo, estudio molecular de la expansión CGG del gen FMR1 y estudio de las regiones subteloméricas. Hasta hace poco era difícil avanzar más, pero la reciente aparición de nuevas tecnologías de alto rendimiento cada vez más sensibles y con mayor capacidad de análisis como el MLPA o el aCGH (cariotipo molecular) está permitiendo la detección de nuevos reordenamientos crípticos desequilibrados responsables de retraso mental.

Palabras clave
retraso mental, asesoramiento genético, protocolo de estudio

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: Genética Humana, Pediatría, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Medicina Familiar, Neurología, Salud Mental, 

Enviar correspondencia a:
Montserrat Milà Recasens, Hospital Clínic Depart. Bioquímica i Genètica Molecular, 08036, Barcelona, España

Patrocinio y reconocimiento
Este trabajo ha sido financiado por el Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII y la Fundación Ramón Areces (V-2006-FRARECES-O).

Study Protocol of Genetic Mental Retardation. Application of New Technologies for the Detection of Unbalanced Cryptic Rearrangements

Abstract
The study of the molecular basis of mental retardation is one of the most complex fields in human genetics due to its clinical and molecular heterogeneity. In fact, it is estimated that around 50% of the affected individuals remain undiagnosed. The aim of this work is to provide an updated view of recent methodologies developed to reach a molecular diagnosis of this condition. The first step is evaluating the patient with a thorough clinical examination and data on personal and family background. All suspected diagnosis of a known syndrome that involves mental retardation must be confirmed in the laboratory with the appropriate technique. In cases of mental retardation of unknown ethiology, three tests must be conducted: karyotype, molecular study of the CGG expansion in the FMR1 gene and the study of subtelomeric regions. Until now, it was difficult to go further but the recent emergence of new and more sensitive and high throughput technologies as the MLPA or aCGH (molecular karyotype) is allowing the detection of new cryptic unbalanced rearrangements responsible for mental retardation.

Key words
mental retardation, genetic counselling, protocol of study

Artículo completo
El retraso mental (RM) se define como una incapacidad en el desarrollo de las habilidades cognitivas y en la adquisición de un nivel de inteligencia que sería el apropiado para un determinado grupo de edad. En la población general la incidencia del RM está estimada entre un 1%-3%.¹ A pesar del gran número de estudios que existen, más de un 50% de los casos tienen una etiología desconocida. Se sabe que alrededor de un 15% están causados por factores ambientales tales como la malnutrición durante el embarazo, infecciones, asfixia neonatal o el síndrome alcohólico fetal, mientras que un 30% de los casos son de origen genético². Este último grupo engloba las anomalías cromosómicas, los reordenamientos crípticos, los factores monogénicos y los multifactoriales. El estudio del RM de origen genético es uno de los campos más complejos en genética humana, debido a que presenta una elevada heterogeneidad genética. Si introducimos el término RM en la base de datos OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) nos proporciona más de mil entradas, motivo por el cual existe un escaso número de individuos con la misma etiología no sólo por la gran complejidad de las bases genéticas, sino también por las distintas causas ambientales que influyen sobre éstas.
Podemos considerar dos categorías de RM hereditario: el RM sindrómico, que tiene lugar con penetrancia y expresividad variables como característica fenotípica de numerosos síndromes hereditarios, y el RM no sindrómico, en el que el RM se presenta de forma aislada sin ninguna otra característica distintiva. Hasta ahora, la mayoría de las mutaciones identificadas en genes responsables de RM eran mutaciones no sinónimas y deleciones, posiblemente debido a la falta de técnicas lo suficientemente eficaces para la detección de otro tipo de reordenamientos. Diversos estudios ya han demostrado que los reordenamientos crípticos desequilibrados son una causa importante de RM, con una incidencia del 10%-20%.^3-5 Entre las alteraciones más comunes encontramos los reordenamientos subteloméricos, responsables de 5%-10% de RM,^6-8 o las deleciones submicroscópicas intersticiales, que dan lugar a síndromes microdelecionales o a síndromes de genes contiguos, o a ambos, como el síndrome de William-Beuren.⁹
Recientemente se han desarrollado nuevas tecnologías que permiten la detección de este tipo de alteraciones y que deben ser incluidas en los protocolos de estudio del RM. En 2006, Milà y col. propusieron un protocolo de estudio de RM que permitiera alcanzar el mayor número de diagnósticos posibles y poder así dar asesoramiento genético y ofrecer un diagnóstico prenatal para futuras generaciones.¹⁰ El objetivo de este trabajo es proporcionar una actualización de las recientes metodologías disponibles para el diagnóstico molecular del RM.



Diagnóstico genético del RM

El primer paso para el diagnóstico del RM es una exploración clínica minuciosa enfocada en la detección de anomalías mayores y menores y la obtención de datos sobre antecedentes personales y familiares. En función de los datos clínicos obtenidos, el protocolo de estudio dependerá de si existe sospecha diagnóstica clara de un síndrome que curse con RM o si por el contrario nos encontramos frente a un caso de RM inespecífico (Figura 1).









Ante la sospecha clínica de una condición sindrómica para la que se dispone de una prueba de laboratorio determinada, como una anomalía cromosómica, un síndrome microdelecional o mutaciones en un gen conocido, se realizará un estudio dirigido que permitirá llegar a un diagnóstico molecular y confirmar la sospecha clínica inicial. En los casos en los que se sospecha un síndrome microdelecional o un cromosoma marcador aplicaremos técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) con diferentes sondas: centroméricas, pintado cromosómico, específicas para locus, etc. Cuando se sospeche un síndrome que pueda estar causado por genes sometidos a imprinting deberemos realizar estudios mediante técnicas de biología molecular con enzimas sensibles a la metilación (que nos permitirá conocer qué genes están activos o inactivos) o estudios de disomía uniparental con marcadores microsatélites distribuidos a los largo del cromosoma implicado. Por último, en los casos en que se sospeche un síndrome monogénico causado por mutaciones en un gen conocido, procederemos al estudio mutacional del gen correspondiente, como por ejemplo síndrome de Rett (gen MECP2), síndrome de Coffin-Lowry (RSK2), etc. Para ello se pueden emplear las diferentes técnicas de búsqueda de mutaciones de las que disponemos actualmente como single strand conformation polimorfism (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) o secuenciación directa de todo el gen.
En el caso de que la evaluación clínica no conduzca a un diagnóstico, el primer paso es realizar un cariotipo para descartar anomalías cromosómicas numéricas, estructurales o de ambos tipos, superiores a 5 Mb. Las cromosomopatías constituyen un porcentaje muy elevado de las causas de RM sindrómico (cerca de un 20%), mientras que en los casos de RM no sindrómico prácticamente no hay cromosomopatías detectables mediante citogenética convencional. Si el cariotipo no revela ninguna anomalía, el segundo paso es el estudio molecular de la expansión CGG del gen FMR1, responsable del síndrome X frágil (SFX). El estudio del SFX se realiza fundamentalmente debido a su elevada relación costo-beneficio ya que es responsable de un tercio de los varones con RM. Por último también se realizará el estudio de regiones subteloméricas ya que 6%-10% de los RM son debidos a pequeñas pérdidas o ganancias de estas regiones.^6,8 Si los resultados son negativos y nos encontramos ante un caso de RM familiar con una estructura adecuada, existe la posibilidad de realizar un estudio de ligamiento. En cuanto a los casos esporádicos, hasta hace relativamente poco tiempo de forma rutinaria no disponíamos de técnicas que permitieran profundizar más en el estudio de pacientes afectados de RM, ya que debido a su alto coste de tiempo y dinero, éstas estaban limitadas a proyectos de investigación. Actualmente, la aparición de nuevas tecnologías de alto rendimiento cada vez más sensibles y con mayor capacidad de análisis como la multiplex ligation probe amplification (MLPA) o los arrays de CGH (aCGH) está permitiendo la detección de nuevos reordenamientos responsables de RM.^11-13



Nuevas técnicas de estudio del RM

Desde el descubrimiento de las bandas G en los años ’70, el análisis del cariotipo ha sido la principal herramienta para el diagnóstico de alteraciones cromosómicas en RM, tanto de aneuploidías totales o parciales como de reordenamientos (traslocaciones, microduplicaciones y microdeleciones). La citogenética convencional tiene una resolución de 6-10 Mb, por lo que la identificación de alteraciones submicroscópicas requiere técnicas más sensibles. En una primera etapa, técnicas de citogenética molecular como la CGH y la FISH permitieron dar un paso hacia delante en el conocimiento de la etiología del RM de base genética. Sin embargo éstos no resultan adecuados para realizar cribajes de rutina, ya que son muy laboriosos y son pocos los loci que se pueden estudiar en un solo experimento. Otra estrategia ampliamente utilizada para la identificación de mutaciones responsables de RM es la realización de cribajes de poblaciones de pacientes afectados de RM mediante el estudio molecular de genes responsables de esta patología; sin embargo estos cribajes, que se basan el realización de estudios por SSCP, DGGE o DHPLC y posterior secuenciación de los fragmentos con migraciones anómalas, dan un resultado positivo sólo en 1% de los pacientes, en el mejor de los casos. Dos tecnologías que han mejorado significativamente el diagnóstico del RM de origen genético son la MLPA y los aCGH.



Multiplex ligation-dependent probe amplification

La técnica de MLPA se ha convertido en una valiosa herramienta para la detección de reordenamientos crípticos. Esta técnica se basa en la detección simultánea del número de copias de una secuencia diana mediante la hibridación genómica del ADN con una mezcla de sondas específicas.¹⁴ La MLPA es una tecnología accesible a cualquier laboratorio de biología molecular que disponga de una PCR y tenga acceso a un analizador de fragmentos o secuenciador. Actualmente se dispone de kits comerciales para descartar reordenamientos en las regiones subteloméricas y los principales síndromes microdelecionales. El gran número de estudios surgidos en los últimos años pone de manifiesto la eficiencia de esta tecnología para el análisis a gran escala de desequilibrios en pacientes con RM inespecífico, especialmente en las regiones subteloméricas y genes candidatos que mapean en el cromosoma X.^15-18 En el campo del RM ligado al cromosoma X el MLPA se ha convertido en una técnica eficaz para la detección de reordenamientos crípticos en este cromosoma, con una tasa detección de este tipo de reordenamientos del 6%,¹⁹ sólo algo inferior a la obtenida mediante aCGH.¹³
Aunque el MLPA no detecta reordenamientos equilibrados ni alteraciones en aquellas regiones para las cuales no se han diseñado sondas, esta técnica resulta especialmente útil para el diagnóstico de portadores de deleciones o duplicaciones, ya que hasta ahora este tipo de alteraciones requerían otras tecnologías más costosas como la FISH o la CGH. Por otro lado, el diseño de sondas de MLPA específicas para locus es relativamente sencillo, por lo que es posible diseñar estudios para la detección de ganancias o pérdidas de cualquier región cromosómica, lo que resulta especialmente útil tanto para la detección de portadoras como para la confirmación de resultados de aCGH (Figura 2).









Tecnología de microarrays: aCGH y SNP arrays

En la década de los ’90 la CGH se convirtió en una de las técnicas más empleadas para la detección de cambios en el número de copias de ADN a lo largo de todo el genoma. Inicialmente su utilización supuso una enorme ventaja frente a las técnicas de citogenética convencional, sin embargo pronto quedó limitada por su bajo poder de resolución, similar al de la citogenética de alta resolución (5 Mb-10 Mb). La aparición de los aCGH, con un mayor poder de resolución, ha permitido la detección de reordenamientos crípticos desequilibrados a lo largo de todo el genoma. El aCGH es una técnica que combina la tecnología de los microarrays con la CGH, en la que la hibridación se realiza sobre secuencias de ADN conocidas fijadas en un soporte sólido, generalmente de cristal. En función del tipo de material que se fija en el soporte, disponemos de diferentes tipos de aCGH, como los arrays de BAC o los arrays de oligonucleótidos. Comparado con el cariotipo convencional, el aCGH proporciona una mayor resolución y permite delimitar las alteraciones detectadas en una secuencia genómica conocida. Su resolución está determinada por el tamaño y la densidad de secuencias fijados en el soporte. Los arrays tiling path aportan una cobertura total de la región a estudiar. Esta tecnología permite además un diseño diferente para cada experimento, por lo que muchos laboratorios realizan estudios con aCGH de regiones genómicas seleccionadas. Cuando el array ofrece una cobertura parcial o total de todos los cromosomas, permite obtener un “cariotipo molecular”. En el campo del RM es común el uso de arrays diseñados específicamente para la detección de síndromes microdelecionales o microduplicacionales conocidos^20-22 y la detección de reordenamientos subteloméricos,²³ tanto a nivel prenatal como posnatal.
En un estudio reciente, nuestro grupo diseñó y construyó un tiling path array del cromosoma X para poner de manifiesto reordenamientos crípticos en pacientes con RM ligado al cromosoma X, lo que permitió detectar desequilibrios clínicamente relevantes en 11.5% de los pacientes estudiados,¹³ e identificar nuevos reordenamientos responsables de RM.^24,25 La aplicación de los aCGH posibilita además la caracterización de síndromes microduplicacionales/microdelecionales conocidos, gracias a lo cual podemos delimitar de forma precisa la región implicada y establecer una correlación fenotipo/genotipo. En 2007, Rodríguez-Revenga y col. presentaron la caracterización molecular de una deleción del locus NDP mediante aCGH en un paciente afectado de enfermedad de Norrie que presentaba epilepsia mioclónica juvenil, característica clínica no informada en pacientes con este síndrome. El aCGH mostró una deleción de aproximadamente 1 Mb en Xp11.3, que afectaba los genes NDP, MAOA, MAOB y EFHC2.²⁶ Las mutaciones en el gen EFHC2 se han relacionado recientemente con la epilepsia mioclónica,²⁷ por lo que pudimos concluir que este gen era el responsable directo de la epilepsia que mostraba el paciente. La caracterización precisa de este tipo de deleciones es de importancia clínica no sólo para el asesoramiento genético, especialmente en mujeres portadoras, sino también para el establecimiento temprano de un tratamiento.
Otro tipo de microarrays que se están implementando en los protocolos de estudio del RM son los SNP. Los SNP arrays permiten tanto la identificación de variaciones en el número de copia (microdeleciones y microduplicaciones) como la detección de disomías uniparentales. La desregulación de genes o regiones sometidos a imprinting es responsable de varios trastornos asociados a RM, del desarrollo o de ambos; síndromes tales como los de Prader-Willi, de Angelman, de Beckwith-Wiedemann o de Silver-Russell.²⁸
La aplicación de estas nuevas tecnologías en diferentes campos de la genética ha conducido al descubrimiento de las variaciones en número de copia (CNV). Las CNV son cambios numéricos submicroscópicos de fragmentos de ADN que varían en tamaño desde 1 kb a varias Mb.^29,30 Estos cambios, detectados en la población general, incluyen deleciones, inserciones y duplicaciones y representan una de las principales fuentes de variación genómica, con cerca de 1 500 regiones variables descritas, abarcando aproximadamente el 12% del genoma y miles de genes.³¹ Es preciso, por lo tanto, tener en cuenta toda esta información para interpretar los resultados obtenidos con los microarrays, para poder discriminar qué reordenamientos pueden estar implicados en la patología del RM y qué reordenamientos son simplemente cambios “benignos” sin implicación clínica alguna.³² Si nos remitimos a los resultados obtenidos en nuestro estudio, aproximadamente el 76% de las CNV detectadas en el cromosoma X corresponden a estas CNV “benignas” que aparentemente confieren leves o ninguna consecuencia fenotípica.¹³
El uso de microarrays de resolución cada vez mayor, está aumentando las tasas de detección de desequilibrios cromosómicos en pacientes con RM o anomalías congénitas.^5,33 Además del diagnóstico de pacientes sin anomalías cromosómicas visibles, los microarrays pueden ser de gran utilidad para desenmascarar desequilibrios submicroscópicos en pacientes con desequilibrios cromosómicos visibles. En particular, traslocaciones aparentemente equilibradas en pacientes que presentan un fenotipo anómalo pueden enmascarar deleciones tanto en los puntos de rotura como en otros puntos del genoma.^34,35
Tanto los aCGH como los SNP arrays parecen estar ya preparados para su introducción en las pruebas de rutina, aunque ahora el desafío principal reside en la correcta interpretación clínica de las CNV detectadas mediante estas tecnologías y en el abaratamiento de costos para que sea accesible a todos los laboratorios de diagnóstico. En general, esta limitación puede ser en parte superada gracias al diseño de microarrays específicos que permitan estudiar sólo aquellas regiones del genoma que nos interesan, disminuyendo de esta forma los costos y facilitando la interpretación de los resultados.^36,37

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