Frequency of three Connexin 26 gene mutations in patients with non-syndromic pre-lingual auditory deficiency in the population of the Espirito Santo State - Brazil

Abstract
Deafness is a sensorial deprivation, in which there is an abnormal reaction to the sonorous stimulus. In developed countries one in 1 000 newborns manifest some type of deafness and more than 60% of these show a genetic origin. In Brazil, it is believed that only 16% of deafness cases are caused by genetic factors. Of all hereditary auditory deficiencies approximately half is caused by mutations in gene Gap Junction Protein Beta 2 (GJB2), which codes for Connexin 26, a constituent of GAP junctions of the internal ear. Four genetic alterations in this gene present high prevalence in specific ethnic groups, 35delG in Caucasians, 167delT in Ashkenazi Jews and 235delC and W24X in oriental populations. In this study, mutations 167delT and W24X were analyzed in 70 patients and the mutation 235delC was analyzed in 11 patients. All subjects were from Espirito Santo State, presented no conclusive diagnosis about a possible genetic origin of the observed deafness, and were normal or heterozygous for the 35delG mutation. To achieve the desired results, peripheral blood DNA was extracted and used for PCR-RFLP analysis. The analyzed mutation was not detected in the patients, suggesting an ethnic diversity for hereditary deafness in the Brazilian population.

Artículo completo
Introdução

A deficiência auditiva genética é uma privação sensorial, onde o sintoma comum é uma reação anormal diante do estímulo sonoro. Ela resulta de um defeito na estrutura e no funcionamento de junções comunicantes da orelha interna, responsáveis pela correta resposta ao estímulo sonoro. Esta doença pode ter várias etiologias, que se dividem em causas genéticas e ambientais. Os fatores ambientais incluem as infecções pré-natais como rubéola, toxoplasmose, herpes, e infecções pós-natais, particularmente as meningites bacterianas e a exposição a drogas ototóxicas. Nos países desenvolvidos, em cerca de 60% dos casos, a etiologia da deficiência auditiva é hereditária.¹ No Brasil, a maioria (84%) dos casos de surdez ocorre por fatores ambientais, no entanto a proporção de casos genéticos vem aumentando à medida que as causas ambientais diminuem.²

As deficiências auditivas hereditárias podem ser classificadas de várias formas. Dentre estas classificações, podemos citar a deficiência auditiva do tipo pré-lingual neurosenssorial não-sindrômica autossômica recessiva. Sabe-se que o padrão de herança autossômico recessivo é o mais freqüentemente encontrado (cerca de 80%),³ a forma não-sindrômica da doença apresenta freqüência de 70%⁴ e a maioria das deficiências auditivas são pré-linguais (desenvolvidos antes da fala).⁵

O mapeamento do primeiro gene para a deficiência auditiva não-sindrômica autossômica recessiva, localizado no loco DFNB1, foi realizado em 1994 por meio de análise de ligação. O gene foi localizado no cromossomo 13, no braço longo (q), na região 1 e banda 2 , e corresponde ao gene gap junction protein beta-2 (GJB2).⁶ A região codificadora da proteína está situada no exon 2, como ilustrado na Figura 1.







Cerca de metade dos casos de surdez não-sindrômica autossômica recessiva é devida a mutações no gene GJB2, que codifica a conexina 26 (Cx26). Esta conexina pertence à família de proteínas transmembranas constituintes de junções comunicantes do tipo Gap, que possuem uma grande expressão no ouvido interno. Tais junções realizam o fluxo de potássio das células ciliadas externas da cóclea de volta para a endolinfa coclear (recirculação do potássio), o que é de extrema importância para que ocorra a resposta auditiva.¹

Após o estímulo sonoro, a energia mecânica do som é convertida em sinal elétrico (transdução mecanoelétrica) nas células ciliadas externas da cóclea. Na superfície apical dessas células, projetam-se microvilosidades especializadas, os estereocílios. Estes oscilam em resposta ao som que, secundariamente ao movimento do estribo na janela oval, movimenta o líquido que circunda as células ciliadas. A deflexão dos estereocílios adjacentes abre os canais de transdução, existentes nos mesmos, permitindo um influxo de potássio da endolinfa para ambas as células ciliadas. Isso causa a despolarização da membrana celular ativando os canais de cálcio da superfície basolateral da membrana que são sensíveis às alterações de voltagem. O subseqüente influxo de cálcio provoca liberação de vesículas, contendo neurotransmissores, nos terminais sinápticos do VIII par craniano (nervo auditivo), promovendo a audição. Desta forma, após o estímulo sonoro, as células ciliadas ficam hiperpolarizadas, com alta concentração de potássio intracelular. Para que nova excitação da célula seja possível, o potássio deve ser removido. O movimento de íons potássio das células ciliadas para as células de sustentação da cóclea retornando para a endolinfa é feito por meio das comunicações intercelulares especializadas, as junções comunicantes ou junções do tipo Gap, formadas por proteínas transmembranas como a Cx26, que existe entre as células de sustentação, nos fibrócitos do ligamento espiral e limbo espiral.¹

Mutações no gene da Cx26, dependendo de sua natureza e local, podem interferir na síntese das conexinas, oligomerização, transporte, degradação, interações conexon-conexon e/ou propriedades funcionais dos canais comunicantes. Deste modo, ocorre a perda total ou parcial da função da Cx26, o que gera um defeito na estrutura e no funcionamento das junções do tipo Gap, levando à manutenção de altas concentrações de potássio intracelular, prejudicando a resposta ao estímulo sonoro, e resultando em perda da audição.¹

Até maio de 2004, 121 mutações diferentes no gene GJB2 já estavam identificadas, mas somente quatro apresentavam alta prevalência em grupos étnicos grandes (35delG em caucasianos, 167delT em judeus askenazitas e 235delC e W24X em populações orientais). Tal fato sugere que a deficiência auditiva tem grande diversidade étnica, o que foi descrito em alguns estudos da literatura⁷ (Tabela 1).







Dentre estas mutações, a 35delG e a 167delT são responsáveis, em geral, por cerca de 70%-80% das deficiências auditivas profundas e não-sindrômicas.⁷ A mutação 35delG é a mais freqüente no gene GJB2, sendo comum entre europeus. Esta mutação causa a deleção de uma base guanina na seqüência de seis guaninas, que se estendem da posição 30 a 35 dos nucleotídeos, no exon codificante do gene da Cx26, resultando na interrupção do códon 38, com a conseqüente terminação prematura da proteína. Esta deleção resulta na síntese de um polipeptídio incompleto, com 12 aminoácidos, diferentemente do normal que possui 226 aminoácidos, e ocasiona a perda auditiva. No Brasil, em um rastreamento neonatal foi determinada a prevalência de 0.97% de portadores da mutação 35delG.¹ Na pesquisa realizada por Sartorato e col., com 620 recém-nascidos foram identificados seis heterozigotos para a 35delG.

A mutação 167delT ocorre com alta freqüência entre judeus askenazitas originais da América e de Israel e é caracterizada por ser uma mutação de mudança de quadro de leitura, na qual ocorre a deleção de uma base timina na posição 167 do gene GJB2, com a conseqüente formação de um códon de parada prematuro e formação da proteína somente até o aminoácido 81.^7,8 Essa mutação é, depois da 35delG, a mais freqüente nos casos de deficiência auditiva autossômica recessiva não-sindrômica do loco DFNB1. Na população askenazita a 167delT é a mutação mais comum no gene GJB2 com uma freqüência superior a 4%.⁹ Um estudo realizado por BORS e col. mostrou que em askenazitas e romanos da Hungria, a 167delT apresenta uma freqüência alélica de 2.4%. Em ambos os estudos a conservação de haplótipos flanqueando a mutação claramente sugere a origem desta mutação por efeito fundador.

A mutação W24X apresenta altas freqüências em populações orientais, como indianos e ciganos espanhóis. É a deleção do aminoácido triptofano e a conseqüente formação de um códon de parada no códon 24 do gene GJB2 que resulta na formação de uma proteína cujo comprimento é apenas um décimo do comprimento da proteína selvagem. Estudos realizados na Índia com 200 pacientes com surdez profunda não-sindrômica revelaram uma freqüência alélica de 6.5% para a W24X e mostraram que essa mutação é a causa mais comum de deficiência auditiva profunda não-sindrômica tanto no norte (13.3) quanto no sul da Índia (18.1%).¹⁰ No estudo feito por Álvarez e col. a mutação W24X apresentou uma prevalência de 79% nas 34 famílias estudadas, sendo essa alta prevalência explicada pela estrutura das sociedades estudadas, caracterizadas por conglomerados de populações isoladas geneticamente, com alto grau de casamentos consangüíneos. A análise dos haplótipos flanqueando a W24X no GJB2 revela que essa mutação é a mais comum entre indianos provavelmente devido ao efeito fundador.^8,10

A mutação 235delC ocorre em alta freqüência entre asiáticos principalmente entre japoneses e causa uma mudança no quadro de leitura no códon 79 com a deleção de uma base citosina na posição 235 do gene, resultando no término da transcrição no códon 81. Em populações japonesas a 235delC é a causa mais freqüente da deficiência auditiva não-sindrômica profunda, contribuindo com 7 alelos em 10 mutantes. O estudo com 203 pacientes japoneses portadores dessa deficiência verificou a ocorrência de 2/203 portadores da mutação 235delC na população japonesa. A análise de haplótipos que flanqueiam essa mutação verificou a associação de um tipo específico de haplótipo em todos os alelos mutantes, o que sugere uma origem única para a mutação. No entanto, devido à alta ocorrência deste haplótipo na população japonesa, é necessário uma caracterização adicional dos pacientes, para que a origem da mutação seja esclarecida.¹¹ Outro estudo realizado por RamShankar e col. também conclui que a origem da mutação 235delC está relacionada com o efeito fundador.

A análise molecular da deficiência auditiva ainda é escassa no Espírito Santo e em todos os países em desenvolvimento, porém, devido à sua alta freqüência e impactos clínicos, a detecção precoce desta deficiência transformou-se num problema de saúde pública. A surdez infantil exerce um importante impacto sobre a comunidade seja do ponto de vista econômico, envolvendo altos custos na sua detecção e reabilitação, seja do ponto de vista psicossocial, não apenas para o próprio indivíduo, como também, para sua família e mesmo para a sociedade em geral. De fato, esta afecção interfere de forma definitiva no desenvolvimento das capacidades verbais e da linguagem da criança, acarretando dificuldades de aprendizagem e efeitos deletérios sobre a evolução social, emocional, cognitiva e acadêmica. Torna-se assim fundamental realizar o diagnóstico precoce, de forma a aproveitar a plasticidade do sistema nervoso central nas idades mais jovens, pois a eficiência terapêutica das formas graves de deficiência auditiva depende da precocidade de sua realização. Além disso, o diagnóstico genético precoce contribuirá para a redução de exames e condutas médicas, e conseqüentemente redução dos custos decorrentes do desconhecimento da etiologia da surdez. Em adição, vários estudos comprovam que as mutações no gene GJB2 constituem uma importante causa da surdez congênita, justificando a triagem das mutações neste gene em nascidos surdos, o que facilitará o diagnóstico precoce da deficiência congênita, o aconselhamento genético dos familiares e permitirá o tratamento precoce dos indivíduos afetados. Torna-se fundamental o conhecimento da diversidade genética associada à esta doença para se estabelecer melhores propostas de diagnóstico molecular para cada grupo populacional.

Este estudo teve como objetivo realizar o diagnóstico molecular das mutações W24X, 167delT e 235delC no exon 2 do gene GJB2 em pacientes com deficiência auditiva neurossenssorial recessiva pré-lingual e não-sindrômica, normais ou heterozigotos para a mutação 35delG, além de estabelecer a freqüência das mutações em pacientes surdos da população capixaba.


Materiais e métodos
Amostras

A casuística foi composta por 37 indivíduos capixabas do sexo masculino (52.11%) e 34 do sexo feminino (47.89%) apresentando uma amplitude de faixa etária de 1 a 52 anos.

Após uma anamnese os pacientes diagnosticados com deficiência auditiva do tipo congênita bilateral profunda e neurossenssorial foram incluídos no estudo e encaminhados posteriormente para a coleta do material biológico. Estes e/ou seus responsáveis assinaram um termo de consentimento e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) do Centro Integrado de Atenção à Saúde (CIAS).

Foi coletada uma amostra de 5 ml de sangue venoso periférico dos pacientes em seringas contendo anticoagulante (ácido etilenodiaminotetracético [EDTA] 6%). O ácido desoxirribonucléico (DNA) genômico foi extraído de leucócitos de sangue periférico, utilizando-se o kit comercial PureGene^® DNA Purification Kit (Gentra Systems). As quantidades de reagentes utilizadas bem como o protocolo das reações de extração seguiram as especificações do fabricante.


Detecção das mutações

Para a detecção das mutações W24X, 167delT e 235delC foi utilizada a técnica da Polymerase Chain Reaction (PCR), que permite a amplificação em tubos de ensaio de milhões de cópias da região de interesse, em combinação com a técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) na qual endonucleases específicas digerem os produtos de PCR e permitem análise dos RFLPs em cada mutação estudada.


Genotipagem da W24X
As soluções para amplificação foram feitas com 25 μl de volume total da reação, contendo 24 μl de PCR mix (20mM de PCR Buffer 10x, 0.2 mM de cada um dos quatro dNTPs (ATP, GTP, CTP e TTP), 2 mM de MgCl₂, 0.4 mM de cada primer (F 5’ TCT TTT CCA GAG CAA ACC GC 3’ e R 5’ GAC ACG AAG ATC AGC TGC AG 3’), 0.4 unidades da enzima Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 18.05 μl de água destilada (dH₂O) e 1 μl de DNA proveniente do sangue periférico dos pacientes.

Essa solução foi submetida a 40 ciclos de 94ºC por 5 min, 94ºC por 45 seg, 55ºC por 45 seg, 72ºC por 1 seg e 72ºC por 7 min.

Antes da digestão, 10 μl do produto da PCR foram submetidos a uma eletroforese em gel de poliacrilamina 8% por 1 hora e 30 minutos, a 250V, para verificar se o DNA foi amplificado. O produto gerado, de 286 pb, foi inicialmente submetido à técnica de RFLP com a endonuclease de restrição AluI. Na digestão foram usados 2 μl do produto da PCR, 2 μl do tampão da enzima, 10 unidades da enzima AluI e 15.80 μl de dH₂O. Essa solução permaneceu em banho-maria a 37º C por 4 horas.

Posteriormente o produto foi checado em eletroforese vertical com gel de acrilamida 8% por 1 hora e 30 minutos, a 250 V, corado com solução de nitrato de prata (0.1%) para a análise das bandas que o DNA formou no gel.

A presença da mutação W24X introduz um sítio de restrição para a AluI. A digestão do DNA por esta enzima gera um fragmento simples (286 bp) nos indivíduos não afetados, três fragmentos (286 pb, 182 pb e 104 pb) nos indivíduos heterozigotos, e dois fragmentos (182 pb e 104 pb) nos homozigotos afetados, segundo RamShankar e col.


Genotipagem da 167delT

Para detecção da mutação 167delT foi utilizada a PCR segundo o mesmo protocolo descrito acima, nas mesmas condições de temperatura/tempo da reação. Os primers utilizados para essa reação são primer F 5’ TTG GAA AGA TCT GGC TCA CC 3’ e primer R 5’ CTC CCC CTT GAT GAA CTT CC 3’.

Antes da digestão, 10 μl do produto da PCR foram submetidos eletroforese em gel de poliacrilamina 8% por 1 hora e 30 minutos, a 250 V, para verificar se o DNA foi amplificado. O produto gerado de 272 pb foi submetido à reação de RFLP com a endonuclease de restrição PstI utilizando-se para a digestão 2 μl do produto da PCR, 2 μl do tampão da enzima, 0.2 μl de BSA (bovine serum albumin), 10 unidades da enzima PstI e 15.40 μl de dH2O. Essa solução permaneceu 4 horas em banho-maria a 37ºC.

O produto foi checado em eletroforese vertical com gel de acrilamida 8% por 1 hora e 30 minutos, a 250 V, corado com solução de nitrato de prata (0.1%) para a análise das bandas que o DNA formou no gel.

A mutação 167delT elimina um sítio de restrição da PstI de modo que a digestão do DNA com essa endonuclease produz nos indivíduos não afetados três fragmentos (112 pb, 91 pb e 69 pb), nos heterozigotos produz quatro fragmentos (181 pb, 112 pb, 91 pb e 69 pb) e nos homozigotos produz dois fragmentos (181 pb e 91 pb), segundo Bors e col.







Genotipagem da 235delC

A detecção da mutação 235delC foi realizada por meio da técnica da PCR segundo o protocolo descrito acima, porém utilizando os primers F 5’ TGT GTG CAT TCG TCT TTT CCA G 3’ e R 5’ GGT TGC CTC ATC CCT CTC AT 3’.

A solução foi submetida a 35 ciclos de 94ºC por 7 min, 94ºC por 45 seg, 55ºC por 45 seg, 72ºC por 45 seg e 72ºC por 5 min.

Antes da digestão, 10 μl do produto da PCR foram checados em gel, como descrito acima. Foi realizada a técnica de RFLP com a endonuclease de restrição ApaI e o produto de PCR formado foi de 785 pb. Na digestão foram utilizados 2 μl do produto da PCR, 2 μl do tampão da enzima, 0.2 μl de BSA, 25 unidades da enzima ApaI e 15.40 μl de dH₂O. A solução foi mantida em banho-maria a 37ºC por uma noite.

A presença da mutação 235delC elimina o ponto de corte da enzima ApaI. A digestão do DNA produz nos indivíduos normais dois fragmentos (506 pb e 279 pb), nos heterozigotos produz três fragmentos (785 pb, 506 pb e 279 pb) e no homozigoto produz um fragmento de 785 pb, segundo Kudo e col.


Resultados
Pré-screening

Num rastreamento inicial realizado por um estudo prévio, a fim de detectar a mutação 35delG nos 71 pacientes coletados, 1 dos 71 pacientes foi detectado como homozigoto afetado para a 35delG, não sendo portanto incluído neste estudo. Além disso, a análise realizada mostrou 5 pacientes hererozigotos para a 35delG.


Genotipagem das mutações

Dos 70 pacientes analisados nenhum apresentou a mutação W24X. Todos os pacientes analisados apresentaram-se também homozigotos selvagens para a 167delT. Assim, após a digestão do produto de PCR com a enzima PstI, observa-se num gel de poliacrilamida fragmentos de 112 pb, 91 pb e 69 pb, como ilustrado na Figura 3.







De 11 pacientes analisados, todos foram apresentaram normais para a mutação 235delC, sendo caracterizados no gel de poliacrilamida após a digestão do produto de PCR com a enzima ApaI pela presença de dois fragmentos, um de 506pb e outro de 279pb, como ilustra a figura 4.







Discussão/Conclusão

A heterogeneidade genética da deficiência auditiva não-sindrômica (non-syndromic hearing impairment [NSHI]) complica seu diagnóstico molecular. Além disto, os dados epidemiológicos coletados até agora indicam que há também uma diversidade na predominância de cada subtipo genético da NSHI em populações diferentes. Por exemplo, mutações no gene GJB2, aparecem com freqüências de 0% a 50% em diferentes países.⁹ Na maioria dos estudos as mutações apresentam as seguintes predominâncias: 35delG em caucasianos (30%-70%);⁸ 167delT em judeus askenazitas (76%-81%);¹⁰ 235delC em japoneses (43%-75%)¹¹ e W24X na Índia (83%-96%).¹²

Essa diversidade étnica das mutações do gene GJB2 ocorre, pois a maioria dessas alterações possui suas origens explicadas pelo chamado efeito fundador. Com exceção da 35delG que é considerada uma mutação de hot spot, o que explica sua alta prevalência,⁸ as outras três mutações citadas neste trabalho possuem a origem explicada pelo efeito fundador. Esta conclusão foi feita por meio de análises da conservação de haplótipos nas proximidades de cada uma das mutações.^8-10 O efeito fundador é um caso extremo da deriva genética em que um número reduzido de indivíduos (ou mesmo apenas uma fêmea grávida) se desloca para outro local, transportando apenas parte do patrimônio genético da população original. Deste modo, ocorre uma quebra acentuada na variabilidade genética da nova população em relação à população originária. Como resultado, a nova população pode ser substancialmente diferente da população original. Existe também uma elevada probabilidade de ocorrer endogamia, resultando num nível anormal de defeitos, relacionados com a expressão de genes recessivos.¹³

Um estudo realizado por Bors e col. analisando 163 pacientes da Hungria, 346 pacientes romanos e 186 pacientes da população askenazita apresentou os resultados mostrados na Tabela 2, comprovando a presença de 35delG entre caucasianos e a prevalência de 167delT entre askenazitas.


Tabela 2

Morell e col. analisando 555 azkenazitas mostrou que nesta população, a 167delT é considerada a principal mutação apresentando uma freqüência de 4% enquanto que a 35delG apresentou uma freqüência de apenas 0.7%. No entanto, sabe-se que em outras populações a mutação 167delT é rara e não tem sido detectada.²
Na análise de 356 pacientes de várias partes da Índia, foi mostrada uma freqüência de 6.5% de prevalência da W24X, uma pequena freqüência da 235delC (0.5%) e a total ausência da 35delG e 167delT.¹¹

Kudo e col., mostrou que na população japonesa, a análise de 203 pacientes apresentou 2 homozigotos para a 235delC e apresentou total ausência das outras mutações do gene GJB2. Outro estudo realizado com a população japonesa revelou uma prevalência de 73% da 235delC e a ausência da 35delG.²

Em um estudo realizado no Belém do Pará, Brasil, a análise de 77 pacientes surdos mostrou 80% de prevalência da 35delG e ausência das outras três mutações deste estudo.¹⁴ Um trabalho realizado no Brasil com 620 recém-nascidos revelou uma freqüência de 0.97% da 35delG.¹⁵ Oliveira e col. revelaram 84.2% de freqüência da 35delG (16 em 19 alelos mutados) e ausência total das outras três mutações.

A verdadeira etnia da população brasileira é difícil de ser estabelecida, pois há uma grande heterogeneidade com uma mistura de origens caucasiana, africana e ameríndia.¹ Porém, os estudos realizados no Brasil como os de Castro e col., Oliveira e col. e Sartorato e col. mostram uma alta prevalência da 35delG revelando a maior proporção de caucasóides no pais.

Assim como na literatura, o presente estudo comprovou a diversidade étnica da NSHI e a ocorrência de cada subtipo de mutação no gene GJB2 em populações de etnias específicas. Os pacientes analisados (origem principalmente caucasóide) para as mutações 167delT, W24X e 235delC mostraram-se todos normais comprovando a raridade destas mutações fora de suas populações específicas.

Estudos como estes que identificam as mutações específicas que causam a NSHI em uma dada população, podem contribuir para o desenvolvimento de protocolos de diagnósticos moleculares específicos para cada população, com testes adequados para detectar a maioria dos alelos mutantes de cada tipo populacional. Assim, dados epidemiológicos que mostram a predominância dos subtipos genéticos das mutações da NSHI são essenciais para melhorar a eficiência e o custo do diagnóstico molecular nos casos de surdez genética.

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