Association of Pneumocystis jiroveci with others Respiratory Pathogens in Bronchoalveolar Fluids

Abstract
The eventual co-infection of Pneumocystis jiroveci with bacterial, fungal and parasitologic respiratory pathogens in 52 respiratory secretions was evaluated. The samples obtained by bronchoalveolar lavage belong to AIDS patients treated in the Respiratory Instensive Care Unit of the Muñiz Hospital. They were consecutively processed between January and September of 2006 in different laboratories of the Muñiz Hospital, resulting all of them positive for P. jiroveci. Mycobacterium tuberculosis was isolated in 2 (3.84%) out of the evaluated samples while a significant number of Streptococcus pneumoniae (n = 2), Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa appeared in other 4 (7.69%). The obtained results revealed the presence of at least one respiratory pathogen other than P. jiroveci in 12% of evaluated samples, being these values lower than those expected by us, on account of the impaired immunologic status of evaluated patients. The number of detected co-infections with different pathogens could decrease probably because of the empiric treatment with antibiotic, the absence of viral studies and the inadecuate transport of the sample. The scanty number of associations was probably due to the moment of sample recollection; P. jiroveci was the predominant pathogen over the other ones eventually present in the respiratory tract.

Key words
pulmonary neumocystosis, mixed pulmonary infections, Pneumocystis jiroveci

Artículo completo
Introducción

La neumocistosis pulmonar (PCP) es una de las infecciones oportunistas más frecuentes entre los pacientes con sida.¹ En alrededor del 35% de las secreciones respiratorias remitidas al laboratorio de Parasitología del Hospital de Enfermedades Infecciosas “Francisco J. Muñiz” para la investigación de Pneumocysitis jiroveci, provenientes de pacientes con sida internados en la Unidad de Cuidados Intensivos Respiratorios, se confirma la presunción diagnóstica de neumocistosis pulmonar.²

Las secreciones respiratorias obtenidas mediante lavado broncoalveolar constituyen el material clínico de elección para el diagnóstico de la PCP; no obstante, el esputo inducido puede, en principio, reemplazarlo en pacientes en quienes los procedimientos endoscópicos no son accesibles.^3,4

La falta de desarrollo in vitro de P. jiroveci obliga al diagnóstico de esta infección mediante la visualización de los diferentes elementos del ciclo de vida del microorganismo (principalmente quistes y trofozoitos), ya sea en preparaciones en fresco o previamente coloreadas de secreciones respiratorias.⁵

La observación de los exudados espumosos provenientes del alvéolo pulmonar de los pacientes con PCP, que muestran una morfología microscópica de “panal de abejas”, permite un diagnóstico certero de esta afección en estos pacientes.⁶

El grave compromiso inmunológico de los pacientes con sida los hace susceptibles de padecer infecciones mixtas por variados microorganismos (distintas especies de bacterias, virus, hongos y protozoarios), lo cual también podría aplicarse a los episodios de PCP.⁷

El propósito de este trabajo es establecer eventuales asociaciones del agente causal de la PCP, P. jiroveci, con otros patógenos respiratorios primarios o potenciales (con excepción de los virus), en los pacientes con sida y diagnóstico presuntivo de PCP internados en la Unidad de Cuidados Intensivos Respiratorios (UCIR) del Hospital Muñiz.


Materiales y métodos

Se evaluaron 52 muestras de secreciones respiratorias obtenidas por lavado broncoalveolar, procesadas en forma consecutiva en los laboratorios de Parasitología, Micobacteriología, Micología y Bacteriología del Hospital Muñiz, entre el 2 de enero y el 30 de septiembre de 2006. Todos ellas fueron positivas para la presencia de Pneumocystis jiroveci por microscopia y pertenecían a pacientes con diagnóstico de sida internados en la UCIR.

Fueron tenidos en cuenta los resultados obtenidos en los respectivos laboratorios para la investigación de parásitos (microscopia), hongos (microscopia y cultivos), bacterias potencialmente patógenas (cultivos) y micobacterias (microscopia y cultivos).

La presencia de P. jiroveci fue puesta de manifiesto por la visualización de estructuras con forma de “panal de abejas” correspondientes al exudado espumoso que cubre los alvéolos pulmonares (patognomónicas de la PCP) en el examen en fresco del concentrado de los materiales remitidos.⁶ Los hallazgos de la microscopia en fresco fueron confirmados mediante la aplicación a extendidos fijados con calor de estos concentrados, de una modificación rápida de la coloración de Grocott⁸ y eventualmente de la coloración de Giemsa, que permitieron evidenciar, respectivamente, las formas quísticas y trofozoitos, de P. jiroveci.

La coloración de Kinyoun fue aplicada para la investigación de bacterias filamentosas del género Nocardia y ooquistes de Cryptosporidium sp. y Cyclospora cayetaniensis, todos ellos ácido-resistentes, en los mencionados materiales.

Los resultados de los cultivos para la investigación de hongos y bacterias fueron obtenidos de las correspondientes historias clínicas. La investigación de micobacterias se realizó mediante microscopia con la coloración de Ziehl-Neelsen y posteriores cultivos en medios de Lowenstein-Jenssen y con piruvato de sodio, de los concentrados de los materiales previamente descontaminados y homogeneizados con el método de Petroff.⁹

En el laboratorio de Bacteriología se aplicó la microscopia previa coloración de Gram a los concentrados para determinar la presencia de células epiteliales planas, bronquiales, macrófagos, leucocitos polimorfonucleares y bacterias. Los materiales fueron allí evaluados en forma cuantitativa, mediante su cultivo en agar sangre de carnero y agar chocolate.

Las bacterias recuperadas con potencial neumopatógeno fueron jerarquizadas según el tipo y cantidad de células presentes en la microscopia y la concentración de unidades formadoras de colonias (> 10⁴ UFC/ml) desarrolladas.


Resultados

En 2 (3.84%) de los materiales investigados, ambos baciloscópicamente negativos, además de la presencia de P. jiroveci se obtuvo desarrollo de Mycobacterium tuberculosis, mientras que en otros 4 (7.69%), el estudio bacteriológico reveló el desarrollo en cantidades significativas (> 10⁴ UFC/ml) de especies bacterianas eventualmente relacionadas con patología pulmonar (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa).

La microscopia para hongos, micobacterias y parásitos (examen en fresco y diferentes coloraciones) de las muestras positivas para P. jiroveci fue negativa en todos los casos, así como los cultivos para hongos.


Discusión y conclusiones

La PCP ha sido descrita como una de las infecciones oportunistas con mayor prevalencia entre los pacientes con sida, no obstante lo cual, sólo aproximadamente el 20% del total de los lavados broncoalveolares de los pacientes con sida internados en diferentes salas del Hospital de Enfermedades Infecciosas “Francisco J. Muñiz” enviados al laboratorio de Parasitología para el diagnóstico de PCP, son positivas. Este porcentaje de muestras positivas para P. jiroveci se eleva a 35% cuando se trata de secreciones respiratorias provenientes de pacientes internados en la UCIR del mencionado hospital.²

Gran parte de los pacientes con PCP, debido al deterioro de su estado general, reciben tratamiento empírico, basado en las características clínicas y radiológicas presentes al momento de la internación. Otras veces, el diagnóstico etiológico definitivo no se realiza, ante la imposibilidad de obtener secreciones respiratorias mediante el lavado broncoalveolar.

Estos tratamientos empíricos, que en general deben poseer un amplio especto de actividad antibacteriana, pueden ocasionalmente tener actividad deletérea sobre otros patógenos respiratorios que eventualmente pueden acompañar a P. jiroveci.

La metodología microbiológica de diagnóstico está relacionada con el tipo de material procesado, en el caso de otras muestras diferentes del lavado broncoalveolar se requieren métodos más sensibles que los empleados en el presente estudio, tales como la inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales.¹⁰ No obstante, cuando aplicamos esta técnica en nuestros pacientes no obtuvimos diferencias significativas respecto de la microscopia en fresco, lo cual atribuimos a la gran carga microbiana presente en las muestras.¹¹

Respecto de la metodología de diagnóstico de la PCP empleada en nuestro laboratorio, ésta resultado rápida, económica, se encuentra al alcance de laboratorios de baja complejidad y se muestra eficaz en la identificación de P. jiroveci en los pacientes internados en nuestro hospital.² Cabe recordar que teniendo en cuenta el tipo de pacientes asistidos en el Hospital Muñiz, por lo general inmundeprimidos y portadores de múltiples infecciones, la metodología elegida es aquella que posee mayores posibilidades de visualizar una amplia gama de microorganismos y no únicamente P. jiroveci.

La inmunodepresión grave que sufren los pacientes con sida, en particular aquellos internados en la UCIR, favorece la asociación de patógenos, los cuales eventualmente pueden incluir P. jiroveci.⁷ No obstante, el examen microscópico de los materiales respiratorios remitidos al Laboratorio de Parasitología para el diagnóstico de PCP, sólo esporádicamente muestra otros patógenos respiratorios o sistémicos (tanto parásitos, como bacterias y hongos), lo cual crea la impresión de que la asociación de P. jiroveci con otros microorganismos patógenos respiratorios es rara. En los últimos años sólo hemos observado la asociación de P. jiroveci con Cryptococcus neoformans (determinada por la presencia de levaduras capsuladas) y Strongyloides stercolaris (establecida por la presencia de larvas del nematelminto) (Bava AJ, datos no publicados).

En el presente estudio se puso de manifiesto que en el 12% de los materiales investigados, P. jiroveci se encontró acompañado de otros patógenos respiratorios: Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa.

Al respecto, Mootsikapun y col.¹¹ encontraron Mycobacterium tuberculosis (37%), Pneumocystis jiroveci (24%) y Cryptococcus neoformans (15%) como los agentes causales más frecuentemente relacionados a la patología pulmonar en los pacientes con sida por ellos evaluados. La coexistencia de infecciones pulmonares observada por estos autores –que alcanza al 10.5%– es similar a la hallada en el presente trabajo, y la asociación de P. carinii y Cryptococcus neoformans fue la más frecuente.

Quizás en el presente estudio el porcentaje de materiales con otros patógenos respiratorios, además de P. jiroveci, podría haber sido mayor de haberse incluido en él estudios virológicos, teniendo en cuenta la importancia de las infecciones por citomegalovirus en estos pacientes.¹² No obstante, si bien citomegalovirus es frecuentemente reconocido en secreciones pulmonares de pacientes con sida e infecciones respiratorias, su papel preciso como patógeno primario permanece controvertido en muchos casos.¹² No obstante, ha sido recuperado del 40%-50% de los pacientes con PCP asociada al sida y en el 20%-40% de pacientes con sida y otras infecciones oportunistas.¹³

Se agrega a ello el hecho de que probablemente los tratamientos antibióticos empíricos, realizados en estos pacientes previamente a la toma de la muestra, así como su remisión a los laboratorios en forma incorrecta pueden ser causa de resultados falsos negativos.

Ewig y col.⁷ recuperaron patógenos bacterianos de secreciones respiratorias obtenidas por lavado broncoalveolar en 19 (48%) de 40 pacientes con sida: Streptococcus pneumoniae (crecimiento exagerado en cultivos) y Mycoplasma pneumoniae, pero no de pacientes HIV negativos con patología respiratoria. Estos autores establecieron que las coinfecciones no parecen ser cofactores relevantes en la mortalidad de los pacientes portadores, pero sí que su diagnóstico favorece su tratamiento inmediato.

Castro y col.¹⁴ estudiaron retrospectivamente la incidencia y las características clínicas de la coinfección por P. jiroveci y M. tuberculosis en pacientes con sida, en 2 651 sujetos internados con probable tuberculosis o PCP, entre 1995 y 2004. Entre ellos, 99 pacientes fueron diagnosticados con PCP (81 presuntivamente y 18 con certeza) y 35 fueron casos nuevos de tuberculosis. Entre ellos, sólo 17 pacientes tuvieron una coinfección por ambos patógenos. Nuestros pacientes, al igual que los referidos en esta serie, poseen por lo general recuentos en sangre venosa periférica de linfocitos T CD4+ que no superan las 100 células/μl (datos no publicados), lo cual es un marcador indirecto del grave deterioro inmunológico que cursan y la elevada posibilidad de padecer múltiples infecciones oportunistas. Debe tenerse en cuenta que la PCP se manifiesta clínicamente cuando estos recuentos son menores a los 200 linfocitos TCD4+/μl, mientras que otras infecciones fúngicas y parasitarias se hacen evidentes con valores aun más bajos.

Por ello, podríamos concluir que los resultados obtenidos representan un porcentaje menor al real de infecciones respiratorias mixtas que incluyen a P. jiroveci como agente causal. La falta de asociación de P. jiroveci con otros patógenos en las infecciones pulmonares de los pacientes evaluados igualmente podría deberse a que en el momento de la toma de la muestra, es este microorganismo el que predomina como patógeno, sobre otros eventualmente presentes en el árbol bronquial.

Es importante para el laboratorista que realiza el procesamiento de este tipo de muestras tener en cuenta la probable coexistencia de otros patógenos y que el estudio microbiológico no debe concluir con la visualización de P. jiroveci.

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