Pemphigus: clinical and serological análysis in 26 patients

Abstract
Nowadays diagnostic criteria of pemphigus include: clinical presentation with blisters and erosions, acantholisis on the conventional histopathological examination and detection of antibodies on affected skin (direct immunofluorescence) or serum (indirect immunofluorescence). Objective: The aims of this study are to compare sensibility and specificity between the ELISA method and the indirect immunofluorescence test (IIF) and to investigate a possible correlation between desmoglein titers (detected by ELISA) and clinical severity. Materials and methods: 26 patients with pemphigus were included in the study. The control group included 29 patients with other bullous diseases. In every patient, anti-intercellular substance antibodies were detected by the indirect immunofluorescence test while anti-desmoglein 1 and 3 antibodies were titered by ELISA. In addition, titers of antibodies were measured before and after therapy with intravenous immunoglobulins and plasmapheresis. 117 determinations were obtained from patients with pemphigus and 29 from the control group. Results: ELISA detection of antibodies against desmoglein 1 and desmoglein 3 is a more sensitive method than the indirect immunofluorescence test. No difference in specificity has been found. There is a positive correlation between titers of antibodies and clinical activity. Intravenous immunoglobulin therapy does not induce immediate tapering of antibody titers.

Key words
pemphigus, desmogleins, blisters

Artículo completo
Las técnicas utilizadas para llegar al diagnóstico de pénfigo han ido evolucionando con el trancurso de los años. En la actualidad el diagnóstico se basa en la clínica, la histopatología y la inmunofluorescencia tanto directa como indirecta (IFI). La IFI detecta anticuerpos antisustancia intercelular en el suero de los pacientes. Tiene una sensibilidad del 76%-80% y una especificidad del 99%.

Recientemente se ha desarrollado una nueva técnica enzimática (ELISA) (enzyme linked immunosorbent assays) (enzimoinmunoanálisis) para reconocer en el suero, de forma semicuantitativa, la presencia de anticuerpos contra desmogleínas 1 y 3; los anticuerpos antidesmogleína 3 (Dsg3) se asocian con la aparición de lesiones a nivel de las mucosas. Por el contrario, la existencia de anticuerpos antidesmogleína 1 (Dsg1) está relacionada con lesiones cutáneas.

La técnica de ELISA parece ser más sensible que la IFI en la detección de los anticuerpos causantes de la enfermedad, pero como se trata de enfermedades poco frecuentes, las series incluyen muestras pequeñas. No hemos encontrado ninguna de pacientes españoles.

En el presente trabajo estudiamos a los pacientes con pénfigo midiendo sus niveles séricos de anticuerpos mediante ELISA e inmunofluorescencia indirecta (IFI) antes y después de diferentes procedimientos terapéuticos [plasmaféresis, inmunoglobulinas intravenosas (IgIV)], y correlacionamos esos valores con el grado de afección clínica. También estudiamos la relación entre el fenotipo clínico de los pacientes y la presencia de anticuerpos antidesmogleína 1 y 3 (Dsg1, Dsg3).


Pacientes y métodos

Según los criterios recogidos en la literatura, un paciente con diagnóstico de pénfigo vulgar o foliáceo es aquel que presenta estas cuatro características:
En la clínica, ampollas-erosiones en las mucosas, cutáneas o de ambos tipos; la histopatología identifica acantólisis y formación de hendiduras suprabasales en el pénfigo vulgar o en la capa granulosa en el pénfigo foliáceo; inmunofluorescencia directa positiva con depósito de IgG en la superficie de los queratinocitos de la zona suprabasal para el pénfigo vulgar (PV) o en el estrato granuloso para el pénfigo foliáceo (PF); inmunofluorescencia indirecta positiva en alguna de las determinaciones, utilizando como sustrato tejido de esófago de mono.

Cumplían estos criterios 33 pacientes atendidos entre 1997 y 2006 (25 con PV y 8 con PF). Fueron excluidos 7 pacientes: 4 por fallecimiento y 3 por no conseguir suero de ellos.

El total de pacientes incluidos fue 26. De ellos, obtuvimos los datos clínicos: sexo, edad, tiempo de evolución, presentación clínica con superficie de piel y mucosa afectada en cada determinación, terapias empleadas y respuesta terapéutica.

El grupo control estuvo integrado por 29 pacientes con otras enfermedades erosivo-ampollares que tradicionalmente se incluyen en el diagnóstico diferencial del pénfigo: liquen plano oral, penfigoide ampollar y de mucosas, toxidermias). Todos ellos tenían diagnóstico preciso mediante biopsia, inmunofluorescencia directa o indirecta y evolución clínico-terapeútica que descartaba totalmente la presencia de pénfigo.


Resultados

Entre junio 2003 y junio 2007 realizamos el seguimiento clínico y serológico de los 26 pacientes, con un total de 117 extracciones de suero.

Estas muestras de suero fueron obtenidas en diferentes estadios clínicos de los pacientes y antes y después de aplicar diferentes procedimientos terapéuticos. Seis pacientes fueron tratados con plasmaféresis, se obtuvieron muestras de suero en 11 ocasiones, antes y después de la plasmaféresis. En 3 pacientes se administró un bolo de ciclofosfamida intravenosa posterior. En 3 pacientes cuya enfermedad fue resistente a las terapias empleadas se administró inmunoglobulina intravenosa.

Con todos los sueros obtenidos se realizó IFI utilizando como sustrato tejido de esófago de mono para medir los anticuerpos antisustancia intercelular. Al mismo tiempo, mediante la técnica de ELISA se analizaron los valores de anticuerpos antidesmogleína 1 (Dsg1) y de anticuerpos antidesmogleína 3 (Dsg3).

Al comparar los resultados de la IFI con la nueva técnica de medición de anticuerpos Dsg1 y Dsg3 encontramos una correlación estadísticamente significativa (prueba de Spearman) entre ambos resultados. Si consideramos las manifestaciones clínicas mucosas o cutáneas, los coeficientes eran de 0.911 para IFI positiva en presencia de Dsg3 si existía compromiso de las mucosas y de 0.873 para IFI positiva en presencia de Dsg1 el compromiso era cutáneo. Por ello, también la técnica de ELISA sería válida para el control y diagnóstico de los casos de pénfigo.

La sensibilidad de la prueba de ELISA para detectar anticuerpos resultó mayor (100%) en comparación con la IFI (62%), aunque la especificidad fue del 100% en ambos casos, ya que no encontramos ningún falso positivo en los 29 sueros de pacientes con patologías incluidas en el diagnóstico diferencial habitual de las enfermedades ampollares.

Una vez demostrada la utilidad de la medición de Dsg en los casos de pénfigo, estudiamos si el nivel de anticuerpos obtenido por ELISA se correlacionaba con la dilución de IFI que es paralela a la actividad clínica de la enfermedad, como ha quedado demostrado desde hace años. Mediante la prueba gamma, que relaciona variables ordinales entre sí, pudimos comprobar una correlación estadísticamente significativa de 0.526 (p < 0.0001) para el valor de Dsg3, y de 0.341 (p < 0.0001) para Dsg1. Con esta relación estadística entre diluciones de IFI y cifras de Dsg podríamos considerar inútil medir los niveles de IFI. Sin embargo, aunque era estadísticamente significativo, no resultaron infrecuentes aquellos casos discordantes entre los resultados del ELISA francamente reactivos y las escasas manifestaciones clínicas.

La presencia de AcDsg1 no se asoció con compromiso de las mucosas y el hallazgo de Dsg3 no lo hizo con manifestaciones cutáneas. En cambio, el compromiso mucocutáneo se asoció con la presencia de ambos Dsg1 y 3 (prueba de chi cuadrado).

Cuando separamos los casos de pénfigo vulgar y foliáceo los resultados fueron más evidentes ya que todos los casos de pénfigo foliáceo presentaron positividad para Dsg1 y, en ningún caso, para Dsg3. Esto es lógico ya que el pénfigo foliáceo no afecta las mucosas.

En los pacientes con pénfigo vulgar,comprobamos diversas situaciones clínicas; la más habitual, y que observamos en los casos de poco tiempo de evolución, fue el compromiso de las mucosas solamente. En estos casos sólo fueron positivos los Dsg3. En otro momento en que la clínica que presentaban los pacientes incluía el compromiso cutáneo y mucoso, aunque éste fuera mínimo, la positividad fue para Dsg3 y Dsg1 (Tabla 1).







También evaluamos la relación entre la superficie de piel afectada, en porcentaje, dividida arbitrariamente en grupos (0%, < 1%, 1-10%, 10-20%, > 20%) y el valor de Dsg1, también agrupado de manera arbitraria (0-14 U/ml, que la casa comercial considera como negativo, 14-50, 50-100, 100-150, > 150 U/ml).

Estos datos se relacionaron de forma estadísticamente significativa mediante la prueba de Spearman (0.811; p < 0.001).

Realizamos la misma comparación entre los cm² de cualquier mucosa afectada divididos en grupos (0 cm², < 2.2-5, 5-10, 10-20, > 20 cm²) y los valores de Dsg3. En este caso también comprobamos una relación estadísticamente significativa mediante la prueba de Spearman (0.653; p < 0.001), aunque es un nivel más bajo que el anterior, que se explicaría por los pacientes con poca afección mucosa y niveles elevados de Dsg3 (Tablas 2 y 3).












Los tratamientos empleados difirieron entre la respuesta clínica y el título de anticuerpos encontrado antes y después de cada uno de ellos.


Inmunoglobulina intravenosa

En 23 ocasiones realizamos tratamiento con inmunoglobulina intravenosa y, como vemos en la tabla correspondiente, los títulos de anticuerpos pretratamiento y postratamiento no se modificaron, considerando arbitrariamente que una cifra de ELISA > 10 U/ml podía considerarse significativa.

Pudimos constatar una disminución en la aparición de nuevas lesiones durante el ingreso y una tendencia a la cicatrización de las lesiones presentes. Este dato no se pudo medir ya que fue un criterio subjetivo tanto del paciente como del médico. Los ciclos de ciclofosfamida sí redujeron esta cifra, pero sólo disponíamos de dos mediciones por lo que el análisis estadístico no fue posible.


Plasmaféresis

No hallamos descenso significativo en los títulos de anticuerpos luego de la plasmaféresis, quizá debido al efecto rebote temprano. En los dos casos en los que se midió a los 8-15 días, después de complementar el tratamiento con inmunosupresores, sí se pudimos comprobar el descenso en los títulos de anticuerpos. No sucedió lo mismo cuando la plasmaféresis se complementó con IgIV.

El grado de afección clínica evaluado antes y después de los ciclos de aféresis empeoró en 4 de los 11 pacientes. En los otros 7 casos no disminuyó ese rango pero, como en el caso de las IgIV, hubo una impresión subjetiva por parte del médico y de los pacientes de mayor tendencia a la cicatrización de las lesiones existentes sin aparición de nuevas lesiones. Sin embargo, dado el escaso número de casos, no se pudo realizar el análisis estadístico.


Discusión

El antígeno fundamental implicado en el pénfigo vulgar y contra el que se detectan autoanticuerpos en la inmensa mayoría de los pacientes es una glucoproteína desmosómica de 130 kD llamada desmogleína 3 que pertenece a la familia de las cadherinas¹ (grupo de moléculas de adhesión dependientes del calcio). En el 50%-60% de los pacientes con pénfigo vulgar encontramos anticuerpos contra otro determinante antigénico: la desmogleína 1, de 160 kD, también de la familia de las cadherinas y que hallamos en todos los casos de pénfigo foliáceo. En los últimos años^2,3 se encontró una correlación clínico-serológica entre el pénfigo vulgar con afección mucosa y la presencia de anticuerpos antidesmogleína 3 y, por otra parte, entre el pénfigo vulgar con afección cutánea y mucosa y presencia de anticuerpos antidesmogleína 3 y también antidesmogleína 1.

Por otra parte, la integridad en la conformación del antígeno (Dsg) parece tener una importancia relevante en la patogenia de la enfermedad. En concreto, los dominios EC1 y EC2 serían los estímulos antigénicos más importantes en la fase activa del pénfigo, mientras que EC5 formaría parte de la diana antigénica en los momentos inactivos de la enfermedad.⁴

Recientemente,⁵ Hashimoto y Kitajima publicaron una actualización de los mecanismos fisiopatológicos implicados en la aparición de ampollas en pacientes con pénfigo y propusieron una teoría –especulativa en algunos aspectos– según la cual los anticuerpos frente a las desmogleínas se fijarían inicialmente a dichos antígenos. Esto provocaría una inhibición en la integración de la Dsg3 en el desmosoma, lo que resultaría en desmosomas sin Dsg3. Por otra parte, se activarían señales de fosforilación de Dsg3 y otras proteínas desmosómicas (placoglobina, entre ellas), mediadas por calcio y ligadas a la activación del plasminógeno, lo que generaría plasmina y con ello la digestión del desmosoma.

La aceptación casi unánime de la patogenicidad de estos anticuerpos y antígenos aún tiene un punto no aclarado y que es defendido por Grando y col. mediante repetidos enfrentamientos en la literatura científica.^6,7

La propuesta discordante de Grando se basa en que los anticuerpos frente a las cadherinas desmosómicas no son los principales responsables de la acantólisis, sino otros anticuerpos dirigidos frente a receptores colinérgicos de la superficie del queratinocito. A pesar de todo, en muchos artículos, cuando el título de anticuerpos no es paralelo a la actividad clínica, o cuando no disminuye con la terapia, o cuando es falsamente positivo, se concluye atribuyendo a los "otros anticuerpos frente a la superficie queratinocítica" la explicación del fenómeno.^8-10

En nuestro trabajo, la totalidad de los pacientes con pénfigo vulgar presentó anticuerpos circulantes tipo IgG (4, y en menos ocasiones, 1).^11,12

La explicación de la diferente localización de las lesiones según la presencia de unos anticuerpos u otros (antidesmogleína 3, antidesmogleína 1 o ambos) se ha razonado mediante la llamada "hipótesis de compensación de desmogleínas", según la cual en la mucosa encontramos expresión de desmogleína 3 en todo el grosor de la epidermis, mientras que la desmogleína 1 sólo aparece en capas superficiales. Por otra parte, en la piel, la desmogleína 3 sólo se expresa en capas basal-suprabasal de la epidermis mientras que la desmogleína 1 sigue estando presente en las capas superficiales y granulosa.

El antígeno implicado en el pénfigo foliáceo suele ser otra glucoproteína transmembrana de 160 kD, la desmogleína 1 (Dsg1) que se expresa en la epidermis, sobre todo en las llamadas zonas seborreicas (de ahí su otra denominación de pénfigo seborreico): cara, cuello y segmento superior del tronco. En las mucosas no se aprecian lesiones ante la presencia de antidesmogleína 1 ya que la Dsg1 sólo se expresa en la parte superficial y la Dsg3 lo hace en todo el epitelio mucoso.

El nivel de anticuerpos, como en el PV, también se relaciona con la intensidad de las manifestaciones clínicas. Las técnicas que detectan habitualmente estos anticuerpos por inmunofluorescencia directa o indirecta no diferencian en muchas ocasiones entre pénfigo vulgar y pénfigo foliáceo, problema que se solventa con las técnicas de ELISA.¹³

La IFI quizá sea aún la técnica más empleada para detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra distintos antígenos tisulares debido a que es una prueba rápida y económica, aunque presenta el inconveniente de la interpretación subjetiva.


La IFI tampoco diferencia pénfigo vulgar de pénfigo foliáceo

La técnica de ELISA es muy sensible y rápida,¹⁴ permite, y casi obliga, a analizar varios sueros problema al mismo tiempo empleando antígenos purificados.

En el presente trabajo, la medición por ELISA de Dsg1 y Dsg3 resultó ser muy sensible y específica (100 %) incluso en pacientes cuya IFI y clínica inicial se prestaban al error diagnóstico. Los pacientes con penfigoide, liquen plano, etc., a los que se les determinaron los niveles de Dsg1 y Dsg3, no mostraron en ningún caso positividad de las mismas.

Sin embargo, la aparición de Dsg1 en los casos de PV se ha relacionado claramente con el padecimiento de un fenotipo clínico más agresivo. Este hecho, patogénicamente, se ha intentado explicar como secundario a un epifenómeno, o como consecuencia del fenómeno denominado "ampliación del epítopo" con aparición sucesiva de antígenos según aumenta el daño y la destrucción tisular. En el mismo sentido, los casos de ELISA positivo pero a título bajo y con clínica muy activa se explican por la presencia de otros anticuerpos no dirigidos contra las desmogleínas o anticuerpos contra epítopos del dominio intracelular de la desmogleína (la técnica de ELISA detecta el ectodominio de dichos antígenos).

En 2005 aparecen los primeros estudios comparativos entre inmunofluorescencia indirecta y ELISA,¹⁵ los cuales detectan una discordancia entre la medición de antidesmogleínas y el fenotipo clínico, por lo que aconsejan realizar ámbas técnicas. Nosotros, sobre la base del presente estudio, apoyamos esta afirmación para aumentar la sensibilidad diagnóstica en casos de pénfigo de presentación atípica.

En 2006, Sharma¹⁶ encuentra correlación entre la presentación clínica y la medición de anticuerpos antidesmogleínas 1 y 3 en 27 pacientes, con algunas excepciones que atribuye a diferencias raciales o genéticas.

Debemos considerar que la técnica de ELISA mide anticuerpos contra desmogleínas totales y no sólo contra el extremo terminal patógeno.


Monitorización de anticuerpos en diferentes tratamientos

El resultado de los diferentes procedimientos terapéuticos se mide en primer lugar sobre la base de su eficacia clínica pero, como en otras enfermedades, se ha buscado un marcador serológico de actividad de la enfermedad.

En cuanto a los agentes alquilantes se destaca el uso de la ciclofosfamida,¹⁷ cuyos resultados se basan, desde la década de 1980, en el beneficio clínico. Los dos pacientes en los que pudimos medir los niveles de Ac antes y después del pulso de ciclofosfamida, ésta disminuyó de forma considerable, tanto por IFI como por ELISA.

La plasmaféreis elimina rápidamente los anticuerpos circulantes¹⁸ en suero pero debe ser seguida inmediatamente por inmunosupresión con pulsos de ciclofosfamida, de corticoides o de inmunoglobulinas para evitar el efecto rebote, que tiene dos fases: primero la redistribución desde el espacio extravascular y después el estímulo del clon productor de linfocitos B.

En nuestra serie determinamos en 11 casos la concentración de Ac por IFI y por ELISA tanto antes como después de la plasmaféresis. En 6 de 11 disminuyó el nivel de Ac, pero en otros 2 aumentó, quizá por un temprano efecto rebote, ya que se determinó entre el segundo y el tercer día de acabar la plasmaféresis.

Otra terapia emergente para estas enfermedades, las inmunoglobulinas intravenosas (IgIV), han aparecido ya con la disponibilidad de medir las antidesmogleínas, por lo que su medición es habitual en las publicaciones.^19-21

En 2002, Sami²² realiza uno de los pocos estudios de AcDsg luego de la terapia, en este caso con IgIV. En nuestros pacientes, medimos en 23 ocasiones el título de AcDsg1 y AcDsg3 justo antes y después de cada ciclo de IgIV, pero no encontramos disminución significativa en el título de anticuerpos (IFI o ELISA), a pesar de la mejoría clínica durante la administración de los ciclos.²³


Conclusiones

La determinación de anticuerpos antidesmogleína 3(Dsg3) –antidesmogleína 1 (Dsg1) en pacientes con pénfigo (vulgar o foliáceo) es más sensible que la inmunofluorescencia indirecta frente a anticuerpos antisustancia intercelular. La presencia de Dsg3 se asocía a la aparición de clínica mucosa en los casos de pénfigo vulgar. Mientras que la presencia de Dsg1 se asocia a la aparición de clínica cutánea en los casos de pénfigo vulgar y en todos los casos de pénfigo foliáceo.

Los niveles de Dsg3 se relacionan con el área de mucosa afectada en los casos de pénfigo vulgar. Los Dsg1 se relacionan con el porcentaje de superficie cutánea afectada en los casos de pénfigo vulgar y pénfigo foliáceo. Los títulos de Dsg1 y Dsg3 no descienden tras la realización de terapia con inmunoglobulinas intravenosas. En los casos en que medimos estas cifras tras la plasmaféresis, tampoco observamos descenso en la cifra de Dsg.

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