Autor: Adriana Dias Elpo Barbosa Columnista Experto de SIIC Institución: Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) Artículos publicados por Adriana Dias Elpo Barbosa

Conclusión breve


Resumen

Estudos prévios têm mostrado que o neuroesteróide isopregnanolona bloqueou o desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol. O objetivo do presente estudo foi investigar a influência da alopregnanolona sobre o desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol em camundongos. No primeiro experimento, o objetivo foi investigar o efeito da alopregnanolona (0.05, 0.10 ou 0.20 mg/kg) sobre a tolerância rápida ao etanol (1.5 g/kg). No segundo experimento, o efeito do flumazenil (2.0 mg/kg) sobre a influência da alopregnanolona na tolerância rápida ao etanol foi investigado. Os resultados mostram que o tratamento prévio com alopregnanolona interferiu no desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico etanol. Além disso, o tratamento prévio com flumazenil não interferiu na ação inibitória da alopregnanolona sobre o desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol.

Palabras clave
álcool, alopregnanolona, tolerância, ansiolítico, flumazenil

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: Farmacología, 
Relacionadas: Bioquímica, Medicina Interna, Neurología, Salud Mental, Toxicología, 

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Adriana Dias Elpo Barbosa, Universidade do Vale do Itajaí Centro de Ciências da Saúde Coordenadoria de Medicina, 89302-202, Itajaí, Brasil

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Effect of Allopregnanolone on Development of Rapid Tolerance to the Anxiolytic Effect of Ethanol

Abstract
It has been shown that the neurosteroid isopregnanolone blocks the development of rapid tolerance to the anxiolytic effect of ethanol. The aim of the present study was to investigate the influence of allopregnanolone on the development of rapid tolerance to the anxiolytic effect of ethanol in mice. In the first experiment, male Swiss mice were pretreated with allopregnanolone (0.05, 0.10 or 0.20 mg/kg) 30 min before administration of ethanol (1.5 g/kg). Twenty-four hours later, all animals were tested using the plus-maze apparatus. In the second experiment, the effect of pretreatment of mice with flumazenil (2.0 mg/kg) 15 min before the administration of allopregnanolone on rapid tolerance to the anxiolytic effect of ethanol was studied. The results show that pretreatment with allopregnanolone interfered with the development of rapid tolerance to the anxiolytic effect to ethanol. Furthermore, the pretreatment with flumazenil did not block the effect of allopregnanolone on the development of rapid tolerance to ethanol.

Key words
alcohol, allopregnanolone, tolerance, anxiolytic, flumazenil

Artículo completo
IntroduçãoDurante muitos anos, as pesquisas a respeito do álcool têm dedicado uma grande parte de sua atenção para o fenômeno da tolerância adquirida, a qual é definida como um processo adaptativo do organismo, onde os efeitos de uma droga diminuem após um período em que ela é administrada repetidamente.1 O nosso interesse em investigar o fenômeno da tolerância adquirida ao álcool, consiste na hipótese de que a tolerância ao álcool é um dos fatores associados com a dependência a esta droga, contribuindo assim para manutenção e agravamento da dependência da mesma. Sabe-se que o escalonamento de doses, decorrente do desenvolvimento da tolerância, pode aumentar a probabilidade de ocorrência de danos orgânicos. Neste sentido, é bastante reconhecido o potencial tóxico do álcool para diversos órgãos ou sistemas. Assim, o estudo da tolerância ao álcool e outras drogas de ação central tem contribuído para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento da dependência de drogas, e por isso, estudos têm procurado caracterizar os mecanismos envolvidos nesse efeito.A tolerância tem sido estudada em uma abordagem temporal, que permite classificá-la em aguda, rápida e crônica. A tolerância aguda é observada durante o curso de uma única administração do etanol, enquanto que a tolerância crônica é geralmente detectada após vários dias, semanas ou meses de repetida administração do etanol.1,2 A tolerância rápida, que é usualmente detectada entre oito e vinte e quatro horas após a primeira injeção do etanol,3-6 tem sido considerada um modelo preditivo da tolerância crônica, devido à similaridade observada em ratos nos dois tipos de tolerância.7,8Estudos têm demonstrado que o etanol em concentrações fisiologicamente e farmacologicamente relevantes afeta uma variedade de sistemas de neurotransmissores, tais como acetilcolina, monoaminas, aminoácidos e esteróides neuroativos.9,10 Essa droga também exerce importantes efeitos sobre membranas, canais iônicos, sistemas de segundos mensageiros e óxido nítrico.11-14 O efeito do etanol no receptor GABA-A pode contribuir para os seus efeitos ansiolítico e sedativo15 e o prejuízo da aprendizagem e da memória.16,17 Tem sido relatado que o desenvolvimento da tolerância e da dependência ao álcool parece estar associado com a redução da efetividade do GABA e/ou benzodiazepinas em algumas regiões do cérebro, em parte, devido a dessensibilização e/ou down-regulation do receptor GABA-A.18,19 Os neuroesteróides são esteróides que podem ser sintetizados de novo a partir do colesterol tanto no sistema nervoso central quanto no periférico.20,21 Em adição a sua bem conhecida ação genômica, apresentam ações não genômicas,22 por exemplo, a alopregnanolona, progesterona e epipregnanolona atuam como moduladores positivos do receptor GABA-A.23,24 Consistente com sua ação moduladora positiva do receptor GABA-A, a alopregnanolona possui efeitos ansiolítico, hipnótico, anticonvulsivante, relaxante muscular e anestésico.25-27 Estudos têm demonstrado que a alopregnanolona modula o receptor GABA-A em concentrações nanomolares e micromolares28 e suas concentrações variam com as flutuações hormonais do ciclo reprodutivo29-33 e em resposta a estressores fisiológicos e ambientais.Barbosa e Morato,4,34,35 tem demonstrado que o tratamento prévio com os neuroesteróides sulfato de pregnenolona ou sulfato de dehidroepiandrosterona (moduladores negativos do receptor GABA-A) facilitou a tolerância rápida, enquanto que a epipregnanolona (modulador positivo do receptor GABA-A) bloqueou a tolerância rápida a incoordenação motora e hipotermia induzido pelo etanol em camundongos. Estudos realizados por Debatin e Barbosa (2005), demonstraram que a administração prévia da isopregnanolona (modulador positivo do receptor GABA-A) bloqueou a tolerância rápida ao efeito ansiolítico induzido pelo etanol em camundongos quando testados no labirinto em cruz elevado. Com o intuito de estender nossos prévios estudos com a isopregnanolona,36 no presente estudo, foram investigados os efeitos da alopregnanolona (um potente modulador positivo do receptor GABA-A) na tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol, e a influência do flumazenil (um antagonista do receptor benzodiazepínico) sobre o efeito da alopregnanolona no desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol.Materiais e métodos AnimaisForam utilizados camundongos Suíços, machos, mantidos no biotério Setorial do Laboratório de Farmacologia da Universidade do Vale do Itajaí, com 3 a 3.5 meses de idade e peso entre 35-40 g, mantidos em ambiente com temperatura de 23 ± 1ºC, com ciclo de luz, claro/escuro, de 12 h (luz ligada às 6 h), tendo livre acesso a água e comida. O presente estudo procurou seguir as recomendações do Guia de Uso e Cuidado com Animais Laboratoriais do National Institutes of Health (NIH) dos Estados Unidos e o protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética para Uso de Animais da Universidade do Vale do Itajaí (n°. 319/2004).DrogasAs seguintes drogas foram utilizadas: etanol absoluto p.a. Merck (grau de pureza 99.8%), diluído em solução fisiológica (NaCl 0.9%) a 14% (p/v), em todos os experimentos; alopregnanolona (3a-hidroxi-5a-pregnan-20-one) (Research Biochemicals International; EUA); flumazenil (etil-8-fluor-5,6-diidro-5-metil-6-oxi-4H-imidazol [1,5-alfa]-[1,4]benzodiazepínico-3-carboxilato) (Roche) e preparada nas concentrações apropriadas, em solução fisiológica; A solução fisiológica (salina) foi preparada com NaCl (Merck) em água destilada, na concentração de 0.9%. Todas as soluções foram livremente preparadas e administradas por via intraperitoneal (i.p.) e todos os volumes injetados foram de 1 ml/kg de peso corporal, exceto para o etanol que foi ajustado de acordo com a dose utilizada.Teste no aparelho do labirinto em cruz elevadoO labirinto em cruz elevado é um aparelho feito de madeira, elevado 56 cm do chão, constituído por dois braços abertos (30x5 cm) e dois braços fechados (30x5x30cm), opostos entre si com uma proteção de acrílico com 0.5 cm de altura ao redor dos braços abertos, para minimizar a queda dos animais. O aparelho foi mantido em uma sala parcialmente escura, iluminada com luz vermelha da intensidade de 44 lux. Antes de ir para o labirinto em cruz elevado, os animais foram colocados em uma arena de madeira (40x40 cm) por 5 minutos para se habituarem com o ambiente do teste. Em seguida, os animais foram colocados no labirinto em cruz elevado durante 5 minutos para o registro das medidas comportamentais que consiste em verificar a freqüência de entrada nos braços abertos (FEA) e fechados (FEF) e o tempo de permanência nos braços abertos (TPA) e fechados (TPF).O modelo do labirinto em cruz elevado é baseado, entre outros fatores, na aversão natural que roedores apresentam pelos braços abertos do labirinto, pois quando ratos são forçados a permanecerem nesses braços, mostram manifestações comportamentais e fisiológicas de medo, tais como congelamento, defecação e aumento de corticosteróides plasmáticos e como uma conseqüência, permanecem um tempo maior nos braços fechados. A proporção da exploração total nos braços abertos determina uma medida de ansiedade, de tal modo que o aumento nas porcentagens de entradas e de tempo nestes braços é considerado como indicativo de ação ansiolítica de drogas.Procedimento experimentalExperimento 1. Efeito da alopregnanolona sobre a tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol. No dia 1 do experimento, três grupos com 20 camundongos foram pré-tratados com salina e três grupos com 20 camundongos foram pré-tratados com alopregnanolona (0.05; 0.10 ou 0.20 mg/kg), respectivamente. Após 30 minutos, cada grupo foi dividido em dois subgrupos com 10 camundongos, recebendo cada um 1.5 g/kg de etanol ou salina, respectivamente e os animais retornaram para suas gaiolas-moradia. No dia 2, todos os animais foram tratados com a dose de 1.5 g/kg de etanol, e a resposta ansiolítica foi avaliada.Experimento 2. Efeito da administração prévia do flumazenil sobre o bloqueio da alopregnanolona na tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol. No dia 1 do experimento, dois grupos com 20 camundongos foram pré-tratados com salina e dois grupos com 20 camundongos foram pré-tratados com flumazenil (2.0 mg/kg), respectivamente, e após 15 minutos, cada grupo foi dividido em dois subgrupos com 10 camundongos, recebendo cada um 0.20 mg/kg de alopregnanolona ou salina. Trinta minutos após as administrações, os respectivos grupos receberam 1.5 g/kg de etanol ou salina, respectivamente, retornando posteriormente para suas gaiolas-moradia. No dia 2, todos os animais foram tratados com a dose de 1.5 g/kg de etanol, e a resposta ansiolítica foi avaliada.Análise estatísticaOs resultados foram avaliados através da ANOVA de uma e duas vias. O teste post hoc empregado foi o teste de Tukey. O valor de p < 0.05 foi considerado como significativo e os resultados representam as médias ± E.P.M.ResultadosOs resultados do experimento 1 estão representados na figura 1. No dia 2, a administração prévia de alopregnanolona nas doses de 0.10 e 0.20 mg/kg, foi capaz de bloquear o desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol. Entretanto, houve uma redução do efeito ansiolítico, de forma significativa, nos grupos controle administrados com etanol em ambos os dias sugerindo que a dose de 1.5 g/kg de etanol produz tolerância rápida. A ANOVA considerou efeito significante os fatores tratamento com etanol: (Fig. 1A: FEA % [F(1,36) = 26.34; p < 0.0001] e TPA % [F(1,36) = 17.58; p < 0.0002]; Fig. 1B: FEA % [F(1,36) = 23.61; p < 0.0001] e TPA % [F(1,36)= 13.45; p < 0.0003]; Fig 1C: TPA % [F(1,36) = 7.89; p < 0.010]) e o pré-tratamento com alopregnanolona (Fig 1B: FEA % [F(1,36) = 14.65; p < 0.0005] e TPA % [F(1,36) = 17,78; p < 0.0002]; Fig 1C: FEA % [F(1,36) = 15.87; p < 0.0004] e TPA % [F(1,36) = 19.32; p < 0.0001]). A análise post hoc (teste de Tukey) confirmou que o tratamento prévio com alopregnanolona nas doses de 0.10 e 0.20 mg/kg bloqueou a tolerância rápida ao etanol comparada aos grupos controles. Contudo, a dose de 0.05 mg/kg teve apenas um bloqueio parcial sobre o desenvolvimento da tolerância rápida (Fig.1A).


Figura 1. Efeito da isopregnanolona no desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol em camundongos. Seis grupos receberam salina (S) e outros seis grupos receberam alopregnanolona nas doses de 0.05 (A), 0.10 (B) ou 0.20 (c) mg/kg, i.p., 30 minutos antes da administração de salina (S) ou etanol (E; 1.5 g/kg, i.p.) no dia 1, mas não foram submetidos ao teste. A tolerância rápida aos efeitos do etanol foi observada no dia 2, quando todos os animais foram tratados com etanol (EE) na dose 1.5 g/kg, i.p. Os E.P.M. da porcentagem de entrada nos(resultados representam as médias braços abertos e o tempo de permanência nos braços abertos de 10 animais por grupo. * p < 0.05 comparado ao respectivo grupo controle (ANOVA + Tukey).
A figura 2 ilustra o efeito da administração prévia de flumazenil sobre o bloqueio da alopregnanolona na tolerância rápida ao etanol. No dia 2, a administração prévia de alopregnanolona na dose de 0.20 mg/kg bloqueou a tolerância rápida e, observou-se uma redução do efeito ansiolítico nos grupos controle administrados com etanol em ambos os dias. A administração de flumazenil, não alterou o bloqueio da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol promovido pela alopregnanolona. A ANOVA considerou efeito significante os fatores tratamento com etanol: (Fig. 2: FEA % [F(1,72) = 25.67; p < 0.0001] e TPA % [F(1,72) = 16.75; p < 0.0002] e o pré-tratamento com alopregnanolona (Fig 2: FEA % [F(1,72) = 15.23; p < 0.0004] e TPA % [F(1,72) = 18.35; p < 0.0002]. A análise post hoc (teste de Tukey) confirmou que o tratamento prévio com alopregnanolona (0.20 mg/kg) bloqueou a tolerância rápida quando comparada ao respectivo grupo controle. Contudo, a administração prévia de flumazenil antes do tratamento com alopregnanolona não interferiu no bloqueio da tolerância rápida ao etanol.


Figura 2. Efeito da administração prévia do flumazenil sobre o bloqueio da alopregnanolona na tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol. Os animais foram divididos em dois grupos, um injetado com flumazenil (2.0 mg/kg, i.p.) e o outro com salina. Após a primeira administração metade de cada grupo foi tratado com alopregnanolona (0.2 mg/kg, i.p.) e a outra com salina. Quarenta e cinco minutos após a primeira injeção os grupos foram re-divididos e tratados com etanol (1.5 g/kg, i.p.) ou salina, mas não foram submetidos ao teste. A tolerância rápida aos efeitos do etanol foi observada no dia 2, quando todos os animais foram tratados com etanol na dose 1.5 g/kg. Os E.P.M. da porcentagem de entrada nos(resultados representam as médias braços abertos e o tempo de permanência nos braços abertos de 10 animais por grupo. * p < 0.05 comparado ao respectivo grupo controle (ANOVA + Tukey).
DiscussãoNo presente estudo, a administração aguda de alopregnanolona, um potente modulador positivo do receptor GABA-A,23 antes da administração do etanol significantemente bloqueou o desenvolvimento da tolerância rápida ao feito ansiolítico do etanol. Estes resultados são consistentes com estudos prévios sobre a influência da isopregnanolona na tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol em camundongos36 e também corroboram com os resultados sobre a interferência dos neuroesteróides nas tolerâncias rápida e crônica aos efeitos de incoordenação motora e hipotermia induzido pelo etanol.4,34,35As doses de alopregnanolona utilizadas no presente estudo não produziram qualquer efeito residual na performance dos animais no segundo dia. Além disso, o efeito deste neuroesteróide parece ser farmacodinâmico e não farmacocinético, uma vez que os nossos resultados e trabalhos prévios têm mostrado que a administração aguda de neuroesteróides não interfere com a farmacocinética do etanol em camundongos e ratos.4,35-37 Entretanto, pesquisas tem demonstrado que a administração de etanol aumentou os níveis de alopregnanolona e alotetrahidrodeoxicorticosterona no hipocampo e no córtex cerebral de ratos.38,39 Estudos realizados por Barbosa e Morato4 mostraram que o muscimol, um agonista do receptor GABA-A, bloqueou o desenvolvimento da tolerância a incoordenação motora induzida pelo etanol, enquanto que agonistas e antagonistas do receptor GABA-B, bloquearam e estimularam, respectivamente a tolerância.40 Além disso, Barbosa e Morato4,35,36 também mostraram que os neuroesteróides exercendo influencia modulatória positiva e negativa nos receptores GABA-A podem bloquear ou estimular a tolerância rápida ao etanol. Portanto, drogas que atuam no sistema receptor GABA-A podem interferir no desenvolvimento da tolerância rápida aos efeitos do etanol.O etanol influencia o funcionamento de vários neurotransmissores e receptores acoplados a canais iônicos41 e seus efeitos sobre a função do complexo receptor GABA-A têm sido extensivamente estudado.42,43 Alguns efeitos comportamentais e farmacológicos do etanol (associados ao receptor GABA-A) são similares aos exibidos pela alopregnanolona.42,44,45 Estudos realizados por Martin-García e col.45 mostraram que a alopregnanolona administrada no hipocampo diminuiu o consumo de etanol em ratos. Assim, a interação da alopregnanolona com os efeitos comportamentais e neuroquímicos do etanol tem recebido considerável atenção. A administração crônica de etanol tem sido associada com uma diminuição na sensibilidade das respostas mediadas pelo receptor GABA-A.42,46,47 Pesquisas também demonstram que a administração crônica de alopregnanolona produziu uma down regulation deste receptor.48 Além disso, estudos mostram que a remoção dos precursores de neuroesteróides pela ovarectomia não afetou diretamente a neuroadaptação dos receptores GABA-A associados a exposição crônica de etanol.49 Baseado nestas evidências, poder-se-ia pensar que o tratamento com alopregnanolona no primeiro dia, aumentasse a down regulation do complexo receptor GABA-A promovido pelo etanol, assim aumentando a tolerância ao etanol no segundo dia do experimento. Entretanto, observou-se o contrário, a tolerância induzida pelo etanol foi bloqueada pela alopregnanolona. Então, parece que a influência da alopregnanolona na tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol não parece estar relacionada a alterações na down regulation dos receptores GABA-A. Portanto, outros mecanismos podem estar envolvidos no desenvolvimento da tolerância rápida ao etanol.O tratamento com o flumazenil, um antagonista do receptor benzodiazepínico, previamente à administração da alopregnanolona, não interferiu no bloqueio da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol promovido pela alopregnanolona. Assim, este resultado sugere que o efeito deste neuroesteróide em nosso modelo não parece estar ligado ao sítio do receptor benzodiazepínico. Estes resultados são consistentes com estudos prévios demonstrando que a administração prévia de flumazenil não bloqueou o efeito ansiolítico da alopregnanolona. 50,51 Entretanto, Fernández-Guasti e Picazo52 mostraram que a administração de flumazenil bloqueou o efeito ansiolítico promovido por este neuroesteróide.Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que a alopregnanolona influencia no desenvolvimento da tolerância rápida ao efeito ansiolítico do etanol, possivelmente por um mecanismo que envolve o complexo receptor GABA-A. Estudos estão em andamento a fim de verificar o possível mecanismo de ação.

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