Nutritive Bases for the Culture of Microorganisms: Part 2 - Main Quality Characteristics

Abstract
Nutritive bases for the microbial growth, as nutrient sources, should comply with a group of essential characteristics, specially as sources of nitrogenous compounds derived from proteins, such as aminoacids, peptides and polypeptides; as well as sources of vitamins and carbohydrates. Other group of characteristics includes physico-chemical parameters such as pH, apparent density, organoleptic (color) and technological (yield) properties. Biological and sanitary characteristics are fundamental for their functionality in culture media, among them, the biological reactivity that includes indole, acethylmethylcarbinol and hydrogen sulphide production and the presence of fermentable carbohydrates; the microbial limit and the growth promotion of specific microorganisms.

Key words
nutritive bases, peptones, extracts, hydrolysates, hydrolysis

Artículo completo
Las bases nutritivas empleadas para el cultivo microbiano deben reunir una serie de carácterísticas esenciales como aportadoras de nutrientes, en especial de componentes nitrogenados de origen proteico, tales como aminoácidos, péptidos y polipéptidos, macroelementos y microelementos, así como vitaminas y carbohidratos. Otro grupo de indicadores comprende características fisicoquímicas como pH, densidad aparente, propiedades organolépticas (color) y tecnológicas (rendimiento). Los índices biológicos y sanitarios son fundamentales para su funcionalidad en los medios, entre ellos, la reactividad biológica, que incluye la producción de indol, acetilmetilcarbinol y gas sulfhídrico y la presencia de carbohidratos fermentables; el límite microbiano y la promoción del crecimiento de microorganismos específicos.^1-3Análisis fisicoquímico de los hidrolizados de proteínasEl análisis químico de los hidrolizados proteicos es complejo debido a que éstos son productos químicamente indefinidos.Pérdida por desecaciónLos componentes que fundamentalmente aportan sólidos al producto son las sustancias nitrogenadas, carbohidratos, sales y otros compuestos de origen orgánico. El resto corresponde a la humedad. El límite de este indicador se encuentra normalmente en valores iguales o inferiores al 8% (para el clima tropical),⁴ aunque muchos fabricantes lo establecen como < 5%.^5-7 Ernster⁸ obtuvo el hidrolizado de soja con un contenido de humedad de 2% a 8%. Otros, como Panreac,⁹ informan valores de pérdida por desecación de hasta 10% para bases nutritivas tales como el hidrolizado enzimático de caseína, peptona de gelatina, proteosa peptona y triptosa. Mayores niveles de humedad conllevan a la pérdida de estabilidad y a la disminución de la vida útil del producto. El exceso de humedad favorece las interacciones químicas de los hidrolizados a altas temperaturas con la aparición de oscurecimiento en su color.La Tabla 1 muestra la pérdida por desecación (PD) de diferentes peptonas, hidrolizados y extractos proteicos producidos por varias empresas a nivel internacional.^5,7,9-22Tabla 1 Nitrógeno totalEl conjunto de indicadores característicos del contenido de las distintas formas en que se puede encontrar el nitrógeno en las bases nutritivas es de mayor importancia en el diseño y evaluación de estos productos, ya que, precisamente, el objetivo fundamental de la mayoría de las bases es aportar este tipo de compuestos a los microorganismos.Como se desprende de lo anterior, es importante conocer el contenido de nitrógeno total en los hidrolizados proteicos. Normalmente se determina por el método de Kjeldahl.^3,23-24 La estimación del contenido de nitrógeno total en los hidrolizados proteicos, comparada con su contenido en el sustrato, evidencia la eficiencia del proceso hidrolítico.⁶ Para obtener el porcentaje de proteínas, péptidos o aminoácidos, se realiza el cálculo multiplicando el valor de nitrógeno total por el factor de conversión estándar 6.25. Sin embargo, este factor varía en función del sustrato proteico a hidrolizar. Así, por ejemplo, para leche, gluten y gelatina su valor es de 6.38, 5.7 y 5.55, respectivamente.²⁵ Jones²⁵ propuso el factor 5.71 y Morr²⁶ confirmó el valor 5.7 para las proteínas de soja, pero Rham²⁷ encontró más conveniente para las proteínas de soja el factor 6.25.El contenido de nitrógeno total (Nt) en las bases nutritivas oscila entre un 5% y un 20% (Tabla 1).Nitrógeno amínicoEl término “nitrógeno amínico” se asigna al nitrógeno de los grupos aminos libres de los aminoácidos, péptidos, polipéptidos y proteínas.²⁸ El conocimiento sobre la cantidad de nitrógeno amínico permite extraer conclusiones sobre la composición y la estructura de las moléculas de las proteínas y caracterizar los productos de la hidrólisis de dichas proteínas. El aumento del nitrógeno amínico permite evaluar la dinámica de los procesos hidrolíticos, así como estudiar la actividad de las enzimas proteolíticas.La bibliografía científica brinda varios métodos para la determinación de nitrógeno amínico como un indicador de gran utilidad para el monitoreo de la marcha de los procesos de hidrólisis y establecimiento de la eficacia final de estos procesos.³ Morris Quevedo y col.²⁹ describen la validación del método potenciométrico para la determinación de nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de microalga Chlorella vulgaris.Los hidrolizados de proteínas se caracterizan por diferentes niveles de nitrógeno amínico (Na) (Tabla 1) como resultado de la aplicación de los procesos hidrolíticos a diferentes sustratos proteicos. Varios proveedores de los hidrolizados y extractos de naturaleza proteica informan diferentes niveles de este indicador. Sus valores oscilan desde 0.6% para el extracto de malta²⁰ hasta el 7.6% para la peptona de carne.⁹Grado de hidrólisisSegún Bridson⁶ el grado de hidrólisis (DH) se puede expresar como la relación entre el nitrógeno amínico resultante de la hidrólisis y el contenido de nitrógeno total de la proteína: DH (%) = (Na del hidrolizado-Na de la proteína) x 100/Nt de la proteína.La relación entre el nitrógeno amínico y el nitrógeno total se emplea frecuentemente como indicador de la calidad de hidrolizados proteicos,^3,30 ya que indica relativamente el grado de hidrólisis alcanzado durante el proceso de obtención de los mismos. Dicha relación (Tabla 1) oscila entre 10% y 58% dependiendo de la naturaleza de la base nutritiva y de su proceso de obtención.AminoácidosLos aminoácidos juegan diferentes papeles en el metabolismo microbiano, pero se emplean, fundamentalmente, en la síntesis proteica. Las peptonas e hidrolizados proteicos se utilizan para el cultivo de microorganismos que requieren de altas concentraciones de uno o varios aminoácidos. Las propiedades químicas y fisicoquímicas de los hidrolizados proteicos se deben, en un alto grado, al contenido de aminoácidos. Es por eso que la determinación de la composición aminoacídica de estos productos reviste suma importancia. En la Tabla 2 se muestra la recopilación de la composición aminoacídica de varios productos comercializados por diferentes empresas en el ámbito internacional.^{5,7,10-12,15,18-20,22,31}Tabla 2 Los aminoácidos son empleados como fuentes de nutrientes en medios de cultivo sintéticos. La L-cistina y la cisteína se incluyen en la composición de medios para la detección de microorganismos productores de gas sulfhídrico.³²Cloruro de sodioEl contenido de cloruros, expresado como cloruro de sodio, depende en gran medida de la utilización de distintas sustancias, como el ácido clorhídrico, para los ajustes de pH durante el proceso de obtención de los hidrolizados proteicos y del método de purificación de los hidrolizados. Olofsson y col.,³³ utilizaron para los ajustes de pH el hidróxido de sodio y el ácido fosfórico. Zubkova y col.³⁴ y Strashnenko y col.³⁵ recomendaron el uso de resinas de intercambio iónico con estos fines. Los hidrolizados ácidos, obtenidos por hidrólisis química o digestión pépsica a pH 2.0 requieren considerables cantidades de HCl, elevando con ello el contenido de cloruro de sodio en el producto final hasta 30%-40%. Para el resto de las bases nutritivas (Tabla 1), normalmente, los valores del contenido de cloruros (Cl), en forma de cloruro de sodio, se encuentran en el rango de 0.1%-13.2%.Las bacterias, como otros organismos vivos, son afectadas por la concentración de las materias disueltas en el agua que las rodea, que origina una determinada presión osmótica.³⁶El cloruro de sodio a bajas concentraciones no inhibe muchas bacterias, quedando éstas inhibidas a altas concentraciones de esta sal, a excepción de los estafilococos.Macronutrientes y micronutrientesLos componentes inorgánicos son esenciales en la composición de muchos de los medios de cultivo. De forma semicuantitativa se pueden agrupar de la siguiente manera: macroelementos, utilizados en g/l (Na, K, Cl, Ca, Mg, P, S, Fe) y microelementos, empleados en µg/l (Al, Ba, Co, Zn, Mn, Br, B, Cu, Co, Mo, V, Sr, Cr, Pb, entre otros).^6,20Debido a las muy bajas concentraciones en las que los minerales son añadidos al medio de cultivo, no siempre estos elementos están presentes en la formulación en forma de sales. En estos casos se asume que estos elementos son aportados por los demás ingredientes, tales como los hidrolizados, peptonas, extractos y el agar. El contenido de los minerales en las bases nutritivas varía dependiendo del método de obtención, el tipo de sustrato proteico y el agente hidrolizante empleado (Tabla 3).^{7,10,11,20,22,31}Tabla 3 Los fosfatos juegan un papel primordial como buffer y también como fuentes de fósforo para el metabolismo microbiano (Tabla 3).⁶Otros indicadores de la composición químicaEn las bases nutritivas se determinan otros indicadores de menor impacto práctico que han sido descritos por diferentes autores. Entre ellos se pueden mencionar el perfil de pesos moleculares^37,38 y el contenido de cenizas (Tabla 1).pH de las peptonas, hidrolizados y medios de cultivoLos medios de cultivo deben tener determinada concentración de iones de hidrógeno, para la medición de la cual se utiliza el indicador de hidrógeno: el pH. Para la mayoría de los microorganismos patógenos el pH óptimo se encuentra en el rango de 7.2 a 7.4; excepto para el vibrio de cólera (8.0-8.6) y Mycobacterium (6.2-6.8).³⁹ La mayoría de las bases nutritivas se caracterizan por valores de pH entre 6.8 y 7.2, excepto las destinadas para el cultivo de hongos, como la peptona micológica y el extracto de malta, cuyos valores de pH son 5.4 y 5.6, respectivamente.⁶ La Tabla 1 brinda una recopilación de los rangos de pH para diferentes bases nutritivas producidas por varias empresas en el mundo.Para evitar que durante el crecimiento de los microorganismos los metabolitos ácidos o básicos cambien el pH del medio, la formulación debe poseer una capacidad buffer determinada, o sea, contener sustancias capaces de neutralizar los cambios de pH provocados por la acumulación de los productos del metabolismo microbiano.Van Slyke⁶ definió la capacidad buffer como la efectividad de la solución de minimizar el cambio de pH como resultado de la adición de una cantidad estándar de ácido o base, ß₁ = d_a/d_pH o ß₂ = d_b/d_pH, donde d_a o d_b son los milimoles de ácido o base requeridos para cambiar el pH en una unidad d_pH.Densidad aparente del polvoEntre los requisitos de calidad que evalúan los polvos como producto final, se encuentra la densidad aparente.German⁴⁰ define el término “densidad aparente” como el peso de un volumen de polvo, expresado comúnmente en g/cm³ y determinado por un método específico. La densidad aparente refleja la masa total del producto correspondiente a una unidad de volumen ocupado por el material y varía con la distribución de tamaño de partículas y con la porosidad de éstas.⁴¹Es importante tener en cuenta este elemento sobre todo para el diseño del envase y del equipamiento empleado en las operaciones de llenado y envase, ya que es uno de los indicadores fundamentales de las propiedades físicas de los productos.^42,43Rendimiento del productoEl rendimiento del producto, expresado en porcentaje, se determina comúnmente en las bases nutritivas relacionando el contenido de sólidos totales en el producto final con el peso de sustrato proteico destinado al proceso hidrolítico.²A modo de resumen es válido destacar que el conjunto de los ensayos fisicoquímicos reflejados en la presente revisión, unido a la evaluación microbiológica, permite garantizar una caracterización profunda de las bases nutritivas.Características organolépticasEl color es el parámetro organoléptico fundamental evaluado para las bases nutritivas deshidratadas y se determina por observación visual.²Evaluación microbiológicaLa evaluación microbiológica de los hidrolizados de proteínas y de las demás bases nutritivas comprende la determinación de la reactividad biológica (producción de gas sulfhídrico, indol, acetilmetilcarbinol y presencia/ausencia de carbohidratos fermentables), la promoción del crecimiento de los gérmenes microbianos y el límite microbiano.^6,44Muchas de estas pruebas juegan un papel fundamental en la identificación de las especies microbianas por su metabolismo y por la presencia de determinadas enzimas.^45-47Producción de gas sulfhídricoEl gas sulfhídrico es el producto de la degradación de los aminoácidos sulfurados, como la cistina, que es un aminoácido esencial que contiene azufre en su estructura, por los microorganismos (Salmonella typhi-murium) de forma aerobia.⁴⁶Producción de indol a partir del triptófanoEl indol constituye uno de los productos del metabolismo de un aminoácido esencial, el triptófano, el cual es el único que tiene en su estructura de forma natural el anillo indol.⁴⁶ La producción de indol por determinados microorganismos (Escherichia coli) indica la presencia de este aminoácido. Con la acción de la enzima triptofanasa, las bacterias son capaces de degradar el triptófano, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. En este principio se basa la identificación bioquímica de las bacterias. El indol reacciona con el paradimetilaminobenzaldehído, presente en el reactivo de Kovac’s, hasta producir un anillo rosado.Carbohidratos fermentablesEn la práctica microbiológica el principio de fermentación de los hidratos de carbono, basado en los estudios sobre levaduras llevados a cabo por Pasteur hace más de 100 años, se utiliza para la identificación de los organismos capaces de acidificar el medio como resultado de la fermentación.⁴⁶Acetilmetilcarbinol. Reacción de Voges-ProskauerEl ensayo de acetilmetilcarbinol o acetoína se utiliza para distinguir diferentes organismos coliformes. La prueba se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol en diacetilo en presencia de KOH y del oxígeno atmosférico. Posteriormente, el diacetilo se convierte en un complejo de color rojo, catalizada esta conversión por el a-naftol y la creatinina.⁴⁶Según Bridson,⁶ los resultados de la evaluación biológica tienen prioridad sobre los de la evaluación química. Así, si resultan aceptables los ensayos químicos e inaceptables los biológicos, se rechaza el producto; aceptándose el hidrolizado en el caso inverso.Límite microbianoLas bases nutritivas son productos microbiológicamente controlados, ya que es de suma importancia conocer los niveles estimados del número de microorganismos mesofílicos aerobios viables, mohos y levaduras.El Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos de Cuba define el producto microbiológicamente controlado como aquel que puede contener microorganismos, dentro de ciertos límites previamente establecidos, que no afectan negativamente el desempeño del producto a través de la vida de estante esperada, cuando se almacena en condiciones recomendadas.⁴⁸Varias empresas productoras de bases nutritivas establecen los niveles de la contaminación microbiana permisibles para cada producto, según las condiciones reales de la producción (Tabla 4).^5,7,15,16,22Tabla 4 Con el objetivo de garantizar un adecuado límite microbiano de las peptonas, en su proceso de obtención, se recomienda ejecutar un paso de tratamiento térmico, preferiblemente no prolongado, para evitar la aparición intensa de la reacción de Maillard, que da lugar a la aparición de los compuestos de color carmelitoso.^49-52Densidad microbiana en el tiempoEntre las características fundamentales de los hidrolizados y extractos proteicos se encuentra la evaluación de su desempeño ante diferentes microorganismos. El crecimiento de los organismos unicelulares conlleva al aumento ordenado de todos sus componentes, produciendo la multiplicación celular que, a su vez, conduce a un aumento en el número de individuos, dando lugar a una población o a un cultivo.⁵³ Este proceso se puede representar a través de la curva de crecimiento microbiano, que consta de cuatro fases: lag, exponencial, máxima estacionaria y de declinación.Unas de las técnicas más sensibles y rápidas para la determinación de la masa celular se basa en la capacidad de las células microbianas de absorber la luz que incide sobre ellas. La cantidad de la luz absorbida es proporcional a la concentración de las células presentes (a bajos niveles de absorbancia), debido al tamaño constante de las células microbianas en las poblaciones. A causa de ello, el caldo de cultivo adquiere una ligera opalescencia o turbidez en las concentraciones bacterianas de 10⁷. El posterior incremento de la concentración de células microbianas provoca una mayor turbiedad y, por consiguiente, una menor cantidad de la luz es transmitida a través del medio. Jenkins⁵⁴ define la absorbancia como el logaritmo del cociente entre la intensidad de la luz incidida y la intensidad de la luz transmitida.Las bases nutritivas a emplear en cada medio deben ser seleccionadas teniendo en cuenta numerosos factores como el microorganismo a cultivar, la flora acompañante, el propósito del medio. Los indicadores microbiológicos son los que finalmente definen la posibilidad de emplear las bases nutritivas en los medios específicos.

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