Antioxidant Effect of a Natural Origin Mixture with Potential Use in Vitiligo

Abstract
Oxidative stress has been proposed as a part of the pathological mechanisms of melanocyte degradation in vitiligo. It has been demonstrated a redox disruption in affected areas. New therapeutically approach based on these facts has been proposed recently. A novel combination of natural extracts (Pimenta racemosa, Cucumis melo, and Citrus aurantifolia) has been successfully tested in a double blind clinical assay in vitiligo. In the present manuscript it has been tested this mixture in in vitro assays, basically in the inhibition of phospholipids oxidation and related assays on redox mediator, involving in vitiligo physiopathology. The sample showed an antioxidant effect when assayed on spontaneous lipid peroxidation test in phospholipids. In addition the extract acted as a scavenger of H₂O₂, and free radicals, in particular hydroxyl radical by a mechanisms involving iron quenching. A photoprotective effect of the sample has been also demonstrated. In summary, our results shown that the modification of melanocyte redox environment may explain, at least in part, the favorable clinical effects of this natural combination in vitiligo.

Key words
oxidative stress, Cucumis melo, Citrus aurantifolia, Pimenta racemosa, vitiligo, antioxidant

Artículo completo
Introducción

Son numerosos los fenómenos que se proponen para explicar el origen del vitiligo. La falta de pigmentación cutánea en estas personas puede ser debida a múltiples factores que ocasionan la disfunción o la destrucción de los melanocitos. Esta complejidad de factores sugiere que el vitiligo es un síndrome más que una enfermedad definida, cuya etiología exacta se desconoce.

Resultados de estudios recientes proponen que el estrés oxidativo podría ser un fenómeno importante en la fisiopatología del vitiligo, ya que se demostró un desequilibrio tisular del sistema oxido-reducción, con la consiguiente producción de radicales libres,^1-6 que conduce a la lesión del melanocito. La acumulación de peróxido de hidrógeno en la epidermis de pacientes con vitiligo y la disminución significativa de la enzima catalasa trae como consecuencia que la capacidad de los melanocitos para sintetizar melanina disminuya o se pierda.⁸

Estos hallazgos aportan una nueva visión sobre la enfermedad, sobre la base de que los melanocitos no desaparecen sino que están funcionalmente anulados. Es por lo anterior que surge un nuevo concepto terapéutico basado en lograr un equilibrio de antioxidantes en la epidermis afectada que pueda revertir el estado no funcional de los melanocitos.

Una nueva formulación de origen natural cuyos principios activos provienen básicamente de extractos vegetales de Pimenta racemosa, Cucumis melo y Citrus aurantifolia fue recientemente ensayada en pacientes con vitiligo. La formulación en crema de estos extractos vegetales se estudió en un ensayo clínico experimental, aleatorizado y a doble ciego en 100 pacientes con vitiligo vulgar estable y se demostró un incremento de la pigmentación, tanto en la zona acrómica seleccionada como en áreas distantes en función del tiempo de tratamiento.⁷ La actividad antioxidante de sus componentes es parte de los mecanismos de acción que se atribuyen a la efectividad clínica de esta combinación.

De acuerdo con estos antecedentes, el propósito de esta investigación es estudiar en modelos experimentales in vitro los efectos antioxidantes/prooxidantes de extractos de Pimenta racemosa, Cucumis melo, Citrus aurantifolia y su combinación, sobre especies reactivas de oxígeno (ERO) de interés en la fisiopatología del vitiligo y sobre los fosfolípidos de membrana.


Materiales y métodos

Todos los ensayos se realizaron en el Centro de Estudios para las Investigaciones y Evaluaciones Biológicas (CEIEB), en el Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL), de la Universidad de La Habana, Cuba.

Las plantas objeto de esta investigación fueron identificadas desde el punto de vista botánico, para lo cual muestras de ellas fueron herborizadas y contrastadas con ejemplares de un herbario de referencia. Se colectaron los frutos de Cucumis melo y Citrus aurantifolia y las hojas de Pimenta racemosa en las regiones de Maracay y Valencia (Estados Aragua y Carabobo, respectivamente, de Venezuela) entre los meses de febrero y marzo de 2007. Los extractos acuosos de los principios activos se conservaron en refrigeración (4 °C) hasta el momento del ensayo. La mezcla de extractos que se utilizó en los ensayos de la actividad antioxidante guardó las mismas proporciones que las descritas en la formulación experimental del fitomedicamento (patente solicitada).


Actividad enzimática


La actividad de la enzima catalasa se siguió mediante la variación de la D.O. (λ = 240 nm) que tiene lugar durante la descomposición del H₂O₂ por acción de la enzima. La actividad enzimática se siguió a 25ºC y pH 7.0, expresada en U/l/min.⁹


Capacidad secuestradora del radical hidroxilo

Se basó en la generación de radicales OH por la reacción entre Fe³⁺-EDTA, H₂O₂, ácido ascórbico y la detección de los daños que éste origina al azúcar 2-desoxi-d-ribosa. Los productos de degradación de la desoxirribosa reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBA) a pH bajo, rinden un cromógeno. El extracto a ensayar, colocado en el medio de reacción, compite por el OH.¹⁰


Capacidad secuestradora de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)

Consistió en la medición a 517 nm de la reducción del radical libre estable DPPH. La absorbancia característica de este radical posee un color violeta intenso y disminuye en presencia de un antioxidante; se cuantificó la capacidad de captura de radicales libres de los extractos mediante la determinación del grado de decoloración que provocaron en una solución etanólica de DPPH.¹¹


Capacidad reductora de hierro férrico (FRAP)

Consistió en medir la capacidad de la muestra para reducir el hierro férrico a ferroso. A un pH bajo se colocó en el medio de reacción el complejo Fe³⁺-TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina), este complejo en presencia de agentes reductores se reduce a Fe²⁺-TPTZ que desarrolla un color azul intenso con un máximo de absorción a 593 nm. Las condiciones del ensayo favorecieron la reducción del complejo y se ajustaron para que la formación de color sólo ocurriera por efecto de la muestra que se añadió y no por artefactos. Los estudios se realizaron estableciendo comparaciones con una solución patrón de vitamina C.¹⁰


Efecto inhibidor de la peroxidación lipídica en homogeneizado de cerebro

Se utilizaron ratas Sprage-Dawley macho de 200-250 g procedentes del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (Bejucal, La Habana), avaladas con certificado de salud según examen bacteriológico, virológico, parasitológico y patológico. Los cerebros se obtuvieron luego de anestesiar a las ratas con uretano, 10 mg/kg de peso, y exponer la cavidad toráxica y abdominal para ser perfundida con NaCl 0.9%. En homogeneizador de cuchillas (Edmun Buller, Alemania) se homogeneizaron 10 g de cerebro en solución amortiguadora salina 50 mM pH 7.00 durante 15 min a 1 000 g. Para la determinación se utilizó el homogeneizado diluido y se añadió la muestra en diferentes proporciones, se incubó 60 min a 37ºC y se determinó la concentración de malonildealdehído (MDA) como medida de la oxidación de fosfolípidos de membrana.

La concentración de MDA en el homogeneizado de cerebro se determinó por el método de Esterbauer y Cheeseman, basado en la reacción de MDA con N-metil-2-fenil-indol a 45ºC, la cual genera un cromóforo estable que absorbe a 586 nm.¹³ El contenido total de proteínas se determinó por el método de Bradford,¹⁴ que emplea como cromógeno azul brillante de Coomassie G-60. Para el cálculo de las concentraciones se empleó una curva de calibración que usó como sustancia de referencia albúmina de suero bovino.

Todos los reactivos empleados fueron de calidad analítica y provenían de los laboratorios Sigma (St. Louis, EE.UU.). Para el manejo y cuidado de los animales de laboratorio se siguieron los procedimientos éticos institucionales que están en correspondencia con las normativas éticas internacionales. A tales efectos se obtuvo la aprobación del comité de ética del Instituto (CEIEB-IFAL) para el desarrollo del protocolo.

Se calcularon diferentes parámetros descriptivos para las variables analizadas (media y desviación estándar, para los valores paramétricos, y mediana, valor mínimo y máximo, para los valores no paramétricos). Para comparar los tratamientos experimentales, teniendo en cuenta la variable en cuestión, se utilizó un ensayo de homogeneidad de varianza (ensayo de Levene) y posteriormente un ANOVA de clasificación simple y el ensayo de Duncan o el ensayo de Kruscal-Wallis, seguido del ensayo de Dunet para determinar las diferencias entre tratamientos. Se establecieron los criterios de correlación entre las variables. Los datos se procesaron utilizando el paquete estadístico Statistica (versión 6) para Windows®.


Resultados

Con la finalidad de detectar picos de interés analítico en la mezcla de principios activos se procedió a la obtención de espectros en la región UV-visible (200-900 nm). Los picos de mayor interés se encontraron en la región ultravioleta. Las mayores absorbancias se localizaron en 226 nm con 2.518; 254 nm con 1.820 y a 322 nm con 0.926 (10 μl de muestra en 1.5 ml de solución amortiguadora fosfato). Por otra parte, no se encontraron compuestos con valores de absorbancias relevantes en la zona de 400 a 900 nm.

La actividad catalasa fue de 180 U/mg de proteínas. La evaluación de la capacidad de captura de radicales libres (Tabla 1) mostró que en el ensayo de DPPH la concentración de la mezcla que alcanza un 50% de decoloración de DPPH fue de 5.6%, estos valores de actividad estuvieron muy próximos al detectado para el compuesto tomado como referencia (rutina). La relación entre la concentración y el porcentaje de decoloración fue lineal (r = 0.86, p < 0.05). Para el secuestro de radicales OH la concentración inhibitoria media fue de 0.0026%, muy cercana al del compuesto tomado como referencia (dimetilsulfóxido). La relación entre la concentración y el efecto protector de la desoxirribosa fue lineal (r = 0.96, p < 0.01).

Resultado de la media de tres experimentos con varianza entre ellos menor del 5%. Valores con letras diferentes como supraíndice difieren significativamente p < 0.05 dentro del mismo ensayo. DPPH: 2,2-difenil-1-picril hidrazilo; DMSO: dimetilsulfóxido; PRATB: productos reactivos con el ácido tiobarbitúrico.

Se observó una correspondencia lineal (r = 0.98, p < 0.001) entre la concentración de extracto y su actividad reductora de hierro (Tabla 2). Teniendo en cuenta la proporción en que se utiliza la mezcla de estos principios activos en la formulación usada en el tratamiento del vitiligo, la capacidad reductora equivalente a ácido ascórbico se calculó en 200 μM. De igual modo se apreció una correlación exponencial (r = 0.75, p < 0.05) entre el incremento de la concentración de la mezcla de principios activos y la inhibición de la peroxidación (Tabla 2) de fosfolípidos aislados de cerebro.

Resultado de la media de tres experimentos con varianza entre ellos menor del 5%. Valores con letras diferentes como supraíndice difieren significativamente p < 0.05 dentro del mismo ensayo. Trolox: 2-carboxi-2,5,7,8-tetrametoxi-6 cromanol.

Discusión

Aunque el estudio espectroscópico de la mezcla de principios activos se realizó con el objetivo de definir las zonas de posible interferencia con los ensayos posteriores, se destaca la amplia área de cobertura en la absorbancia de las radiaciones UV desde 200 a 340 nm, a una dilución de 1/150. La protección UV que puede ejercer esta mezcla en las regiones UVB (280 a 320 nm) y UVA corta o II (320-340 nm) podría contribuir al efecto terapéutico observado para este extracto. La exposición a radiaciones UVA y UVB se ha utilizado en el tratamiento del vitiligo, sin embargo su efectividad real según los ensayos clínicos es baja (ej. sólo el 8% de los pacientes tratados con UVA repigmentan en un 90% y la pigmentación es tenue y no homogénea).¹⁵ Por otra parte, los tratamientos con UVB originan efectos adversos como quemaduras, prurito y xerodermia.¹⁶ De acuerdo con la valoración del comportamiento fotoprotector del extracto ensayado es evidente que los efectos de repigmentación que ejerce no se deben a la exposición UV, lejos de ello, la protección de la piel de estos factores generadores de estrés oxidativo en zonas donde los mecanismos naturales de fotoprotección (melanina) están deficientes, podrían contribuir a la recuperación redox de los melanocitos no funcionales.

En estudios recientes se planteó que el estrés oxidativo está involucrado en la patogénesis del vitiligo estable y activo, comprobándose el desequlibrio acentuado o el deterioro del sistema antioxidante.^2,6 La evaluación de la actividad antioxidante de la mezcla de principios activos fue realizada in vitro luego de un estudio clínico previo donde se obtuvo un 90% de efectividad en cuanto al incremento de la cantidad de puntos clínicos de pigmentación.⁷

En la valoración del extracto ensayado se encontró actividad secuestradora de peróxido de hidrógeno, lo que puede estar dado por la presencia de catalasa u otras enzimas con actividad similar a ella. Se sabe que el peróxido de hidrógeno afecta la pigmentación de la piel por óxido-reducción¹⁷ y se ha demostrado que en la epidermis de pacientes con vitiligo hay disminución de la actividad catalasa asociada a una mayor concentración de peróxido de hidrógeno.^5,18-19 Por otra parte, diversos estudios hallaron que la actividad catalasa en suero no está afectada al comparar suero de pacientes normales y con vitiligo; sin embargo, los tratamientos más recientes incluyen la seudocatalasa para favorecer la pigmentación.^18,20

Se ha comprobado además que la catalasa reduce de manera significativa y selectiva la muerte de los melanocitos que provienen de pacientes con vitiligo, reforzando el papel del estrés oxidativo en la patogénesis de esta enfermedad.²¹ La remoción del H₂O₂ parece tener un papel trascendental en esta patología, por ejemplo en la eliminación de H₂O₂ por seudocatalasa PC-KUS normaliza y activa la expresión de la proteína butil-colinesterasa (sumamente afectada en pacientes con vitiligo activo).²² Se conoce adicionalmente que la ruta de la pro-opiomelanocortina derivada de péptidos (POMC) ejerce funciones reguladoras relacionadas con la pigmentación. La POMC se encuentra en muy bajas concentraciones en pacientes con vitiligo y es afectada esencialmente por las altas concentraciones de H₂O₂ que están presentes en la piel del paciente con vitiligo (10^-3 M).¹⁷

Teniendo en cuenta los elementos anteriores y el potente efecto secuestrador de H₂O₂ de la mezcla de principios activos, parece probable que parte importante de los mecanismos por los cuales ésta ejerza su efectividad clínica sea por esta vía.

En relación con la actividad de captura de radicales libres, se apreció que la mezcla de principios activos fue efectiva en la captura del radical DPPH, con una actividad similar al flavonoide de referencia (rutina), a esta actividad contribuyen todos los extractos analizados (datos no mostrados), aunque el extracto con actividad más potente fue el de Pimenta racemosa. El radical OH es el radical libre más lesivo para las moléculas biológicas. Se forma esencialmente a partir de O₂- y H₂O₂ a través de las reacciones de Haber-Weiss y Fenton; éstas requieren trazas de metales de transición como catalizadores. En este caso el hierro tiene un papel protagónico in vivo. Para el OH no existen secuestradores específicos in vivo, de modo que es capaz de reaccionar con proteínas, ADN, ácidos grasos poliinsaturados de membranas y casi todas las moléculas biológicas con las que contacta. Los resultados de la determinación de la capacidad secuestradora de este radical mostraron un efecto dependiente de la concentración e indican que unido al resultado del ensayo de DPPH, parte del mecanismo de acción de esta mezcla de principios activos transita con la captura de radicales libres, en este particular OH.

Los ensayos in vitro permiten un acercamiento al mecanismo de acción antioxidante de los compuestos que se investigan; sin embargo, se conoce que in vivo éstos pueden resultar más complejos. Por ejemplo, el propio caso de la curcumina y la tetrahidrocurcumina (probablemente presentes en la mezcla de principios activos por contener extracto de Cucumis melo) se demostró in vivo que secuestran radicales libres que se generan durante la hiperglucemia e inducen enzimas antioxidantes (que incluyen enzimas destoxificadoras como la glutatión-S transferasa).²³

El efecto reductor de los antioxidantes del Fe³⁺ a Fe²⁺ es típico de sustancias como el ácido ascórbico. El método FRAP permitió conocer el potencial reductor de los principios activos y su equivalencia con el poder reductor del ácido ascórbico. Como pudo apreciarse, la mezcla de principios activos tiene una importante actividad reductora. El potencial reductor de los extractos que componen la mezcla de principios activos se comportó de la forma siguiente: Pimenta racemosa > Cucumis melo > Citrus aurantifolia (datos no mostrados).

En los homogeneizados de cerebro tiene lugar un proceso de autooxidación enzimática debido a su riqueza en fosfolípidos y hierro. Al ensayar la mezcla de principios activos sobre éstos se obtuvo un efecto inhibidor de la peroxidación lipídica. Este efecto fue dependiente de la concentración, obteniéndose un 33.54% de inhibición con la concentración máxima ensayada. Este efecto inhibidor de la peroxidación lipídica puede relacionarse con los efectos observados en la clínica. Se sabe que los melanocitos de pacientes con vitiligo tienen una sensibilidad incrementada a agentes externos que promueven la peroxidación. En estudios con pacientes con vitiligo generalizado estable o activo se encontraron concentraciones incrementadas de MDA en suero.^2,3,25 En este sentido, la inhibición que ejerce la mezcla de principios activos sobre la peroxidación lipídica podría relacionarse con una actividad farmacológica favorable en los pacientes con vitiligo.

Los extractos vegetales (Pimenta racemosa, Cucumis melo y Citrus aurantifolia) que componen la formulación contienen polifenoles, terpenoides y otros compuestos químicos con actividad antioxidante que podrían sustentar su acción farmacológica.

Se puede concluir que la protección UV que puede ejercer la mezcla de principios activos en las regiones UVB y UVA corta podría contribuir al efecto terapéutico. Por otro lado, esta formulación presenta efectos inhibidores de la peroxidación lipídica espontánea de fosfolípidos de cerebro de rata. Presenta además actividad catalítica frente al H₂O₂ con actividad secuestradora de OH, uniéndose al hierro de forma que impide la formación de este radical.

Dados estos resultados, parece probable que el efecto farmacológico de la mezcla de principios activos ensayada transite por un mecanismo que implica un mejoramiento del sistema antioxidante en el entorno del melanocito.

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