Autor: María Carmen Jiménez-Martínez Columnista Experto de SIIC Institución: Instituto de Oftalmología "Fundación Conde de Valenciana" Artículos publicados por María Carmen Jiménez-Martínez

Conclusión breve
La interleucina 6 es una de las citocinas responsables de la respuesta inflamatoria ocular y de las manifestaciones clínicas de la queratoconjuntivitis por adenovirus. Su producción local probablemente sea consecuencia de la interacción entre el virus y los receptores tipo toll.

Resumen

Los receptores tipo toll (RTT) desempeñan un papel importante en la respuesta inmune innata en las infecciones oculares, particularmente las producidas por adenovirus (Ad). Los objetivos de este estudio fueron determinar si la infección adenoviral induce citocinas proinflamatorias en células epiteliales corneales (CEC) humanas y evaluar la contribución de los RTT al microambiente proinflamatorio por las células epiteliales limbales (CEL) humanas. Métodos: Las CEC fueron aisladas de córneas humanas sanas y cultivadas en medio epitelial hormonal suplementado hasta su confluencia. Las CEL fueron obtenidas a partir de rodetes limbales humanos y cultivadas en medio KSFM hasta su confluencia. Posteriormente, las CEC fueron infectadas con Ad5 y cultivadas en diferentes tiempos (24 h, 48 h, 72 h). Las CEL fueron estimuladas con agonistas de RTT por 24 h. Los sobrenadantes de cultivo fueron recuperados y analizados por ELISA para determinar las concentraciones de interleucina (IL) 1b, IL-6, factor de necorsis tumoral alfa (FNT-α) e interferón alfa (IFN-α). Resultados: La infección de CEC por Ad5 indujo la producción de IL-6 desde las 24 h. No se detectó IL-1b, FNT-α o IFN-α en los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas en ningún tiempo de cultivo. La estimulación por agonistas de RTT en CEL indujo la producción de IL-6 a través de RTT8 > RTT4 = RTT2. Conclusiones: La infección por Ad5 indujo la producción de IL-6 por CEC. El RTT8 podría estar implicado con la producción de esta citocina en CEL.

Palabras clave
IL-6, queratoconjuntivitis, adenovirus, RTT, fisiopatología

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
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Especialidades
Principal: Oftalmología, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Inmunología, Medicina Interna, 

Enviar correspondencia a:
María Carmen Jiménez-Martínez, Instituto de Oftalmologia "Fundación Conde de Valenciana" Unidad de Investigación 4º piso, 06800, México, México

Patrocinio y reconocimiento
Agradecimiento: A la Sra. Verónica Romero Martínez, por el apoyo técnico recibido. Al proyecto CONACYT SALUD 2004-C01-096 y a la Fundación de Asistencia Privada Conde de Valenciana por haber financiado en parte este trabajo.

Il-6 Is a Cytokine Involved in the Immunopathogenesis of Adenoviral Keratoconjunctivitis. Potential Contribution by TLRs to Pro-Inflammatory Microenvironment, and Possible Clinical Implications

Abstract
Toll-like receptors (TLRs) play an important role in the innate immune response to ocular infections particularly by adenovirus (Ad). The objectives of this study were to determine whether adenoviral infection induces proinflammatory cytokines by human corneal epithelial cells (CEC) and to evaluate TLR contribution to the pro-inflammatory microenvironment by human limbal epithelial cells (LEC). Methods: CEC were isolated from human healthy corneas and grown in supplemented hormonal epithelial medium until confluence. LEC were obtained from human limbal rims, and cultured in KSFM medium until confluence. Then CEC were infected with Ad5 and cultured at different times (24 h, 48 h, 72 h). LEC were stimulated with TLRs-agonist for 24 h. Cultures supernatants were recovered and analyzed by ELISA to determine IL-1b, IL-6, TNF-a and IFN-a concentrations. Results: Ad5 infection of CEC induced the production of IL-6 since 24 h. Nor IL-1b, TNF-a, or IFN-a were detected in the culture supernatants of infected cells in any time of culture. TLRs-agonist stimulation of LEC induced IL-6 production through TLR8 > TLR4 = TLR2. Conclusions: Ad5 infection induced IL-6 production by CEC. TLR8 could be implicated in the production of this cytokine in LEC.

Key words
Il-6, keratoconjunctivitis, adenovirus, TLRs, physiopathology

Artículo completo
Introducción

Los receptores tipo toll (RTT) son una familia de glucoproteínas involucradas con la respuesta inmune innata, tienen la capacidad de reconocer estructuras moleculares conservadas entre patógenos,^1,2 funcionando como sensores que detectan micoorganismos invasores de manera temprana y activando mecanismos de respuesta inmunitaria natural que permiten su eliminación. (Tabla 1).







Aunque originalmente estas moléculas fueron descritas en células fagocíticas, en la actualidad se ha reconocido su expresión en prácticamente todos los tejidos y el ojo no es la excepción, pues se ha demostrado la presencia de los diferentes RTT descritos (RTT1-10) en córnea, conjuntiva y retina.^3,4

En la superficie ocular, los RTT han sido involucrados en la respuesta inmune ante virus, como en la queratoconjuntivitis por adenovirus.⁵ La infección ocular por adenovirus es muy importante clínicamente, ya que se presenta de manera epidémica y puede tener repercusiones en la transparencia corneal y complicaciones conjuntivales asociadas (Figura 1).







Aunque se ha sugerido que el RTT-9 induce la producción de citocinas proinflamatorias como la interleucina (IL) 1β por las células epiteliales corneales,? y que esta citocina podría favorecer los fenómenos inflamatorios responsables de las manifestaciones clínicas oculares observadas en estos pacientes,⁵ esto no ha sido demostrado aún, por lo que uno de los objetivos de este trabajo fue determinar el patrón de citocinas producido por células epiteliales corneales infectadas por adenovirus.

Cabe destacar que las células epiteliales corneales (CEC) son células diferenciadas terminalmente y que la regeneración del epitelio corneal depende de las células epiteliales limbales (CEL). En condiciones fisiológicas y después de una lesión, el mantenimiento del contenido celular se logra por esta población de células madre pluripotenciales localizadas en el epitelio basal del limbo esclerocorneal.⁶ Las CEL también expresan RTT,⁷ por lo anterior, es posible que las CEL participen en el microambiente proinflamatorio a través de la secreción de citocinas en respuesta a la interacción RTT-ligandos, de tal manera que otro de los objetivos de este estudio fue determinar el patrón de citocinas producido por células epiteliales limbales estimuladas con diversos agonistas de RTT.


Material y métodos

Obtención de células epiteliales corneales

Las CEC fueron obtenidas a partir de botones corneales humanos libres de infección viral provenientes de individuos sometidos a transplante de córnea secundario a queratocono. Las CEC fueron separadas del estroma siguiendo la metodología descrita por Jiménez-Martínez MC y col.⁵ Brevemente, las CEC fueron tratadas con dispasa (Roche, Alemania) durante 15 min a 37°C, y separadas de las estromales mediante una malla de nailon. Una vez obtenidas fueron expandidas en presencia de medio epidermal hormonal suplementado y suero fetal bovino al 10% (Gibco, Grand Island, EE.UU.). Cuando las células alcanzaron un 80%-90% de confluencia fueron utilizadas para los ensayos posteriores.


Obtención de células epiteliales limbales

Las CEL fueron aisladas a partir de tejidos limbo-corneales de donante cadavérico con serología negativa, obtenidos del Banco de Ojos del Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana-Cruz Roja, México, D.F. Los tejidos estuvieron conservados en OptisolTM-GS (Bausch & Lomb Inc, Rochester, EE.UU.) a 4º C hasta ser procesados para cultivo, siguiendo la metodología descrita por Luna-Baca GA y col.⁶ Brevemente, el tejido limbo-corneal fue fragmentado y tratado con dispasa por 45 min, posteriormente cada fragmento fue colocado con el borde epitelial hacia abajo dentro de una placa para cultivo celular y cubierto con 25 μl de suero fetal bovino durante 24 h. Después de ese tiempo, se adicionó a cada pozo medio KSFM suplementado, dejándose en cultivo en las condiciones de atmósfera, temperatura y humedad ya mencionadas.


Extracción de ADN y reacción en cadena de la polimerasa

Para asegurar que los botones corneales estuvieran libres de infección viral previa se realizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificación de adenovirus (Ad) o herpesvirus (HSV). La extracción de ADN se realizó siguiendo la metodología propuesta por el fabricante con el mini kit QIAamp (QIAGEN Sciences, Maryland, EE.UU.). Los cebadores para Ad fueron ADRJC1, 5’-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3’; secuencia antisentido ADRJC2, 5’-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3’, amplificando un producto de 140 pb; para HSV fueron ALE1 5’-TTATTGCCGTCATAGCGCGG-3’; secuencia antisentido ALE2 5’-GGCGACCTGTATAACGTGTT-3’, amplificando un producto de 278 pb. La PCR se realizó con el kit Omniscrpt Reverse Transcription (QIAGEN Sciences, Maryland, EE.UU.), y la amplificación, con un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co. Norwalk, EE.UU.). Los botones corneales positivos por PCR para Ad o HSV fueron eliminados del estudio.


Cultivo primario de células epiteliales corneales e infección por Ad5

Se realizaron cultivos celulares en ausencia o presencia de Ad5 (título de viral utilizado, aproximadamente 6.08 x 10⁸/100 μl partículas por inóculo). Las CEC fueron recuperadas en intervalos de 24 h hasta el tercer día. El sobrenadante (SN) de cultivo fue congelado a -70^oC hasta su utilización.


Cultivo primario de células epiteliales limbales y estimulación con agonistas de RTT

Las CEL fueron estimuladas en presencia o ausencia de diferentes agonistas de RTT (RTT1-9 agonist KIT, InvivoGen, San Diego, EE.UU.) durante 24 h, a 37ºC y 5% CO₂. Al terminar el período de cultivo, el SN fue recuperado y congelado a -70ºC hasta su utilización.


Determinación de citocinas por ELISA

El SN de los cultivos fue utilizado para determinar IL-1β IL-6, factor de necorsis tumoral alfa (FNT-α) e interferón beta (IFN-β) mediante un sándwich ELISA cuantitativo, según la metodología propuesta por el fabricante (R&D Systems, MN, EE.UU.). Los resultados fueron leídos en un lector de ELISA (TermoLabsystems, Helsinki, Finlandia) a 450 nm de longitud de onda y corrección de 540 nm.


Análisis estadístico

Se utilizó la prueba de la t de Student para la comparación entre dos grupos, considerándose un valor de p < 0.05 como estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó con el programa SigmaStat.


Resultados

Citocinas en sobrenadante de cultivo de células epiteliales corneales infectadas por Ad5

Se identificaron las citocinas proinflamatorias IL-1b, IL-6 y FNT-α, así como la citocina antiviral IFN-α, tanto en las CEC infectadas como en las no infectadas. Es interesante el hecho de que no se detectó en ninguno de los sobrenadantes IL-1b, FNT-α o IFN-α de las CEC sin infección, ni en las CEC infectadas. La única citocina detectada en SN fue IL-6 tanto en células infectadas como no infectadas. Se encontraron diferencias significativas desde las 24 h (p = 0.0007) y hasta las 72 h (p = 0.02) en donde las CEC infectadas por Ad5 mostraron mayor producción de IL-6 que las CEC no infectadas por Ad5 (Figura 2).







Patrón de citocinas en células epiteliales limbales estimuladas con agonistas de RTT

Puesto que no se detectaron citocinas en células terminalmente diferenciadas, CEC, se decidió determinar la producción de las citocinas proinflamatorias en las células que las originan (CEL) a través de la estimulación específica de RTT, utilizando agonistas reconocidos para éstos. Los resultados obtenidos mostraron que la estimulación con ssARN40 (ligando RTT8) indujo 4.8 veces más IL-6 en comparación que las células epiteliales limbales no estimuladas (control negativo). La producción de IL-1b no fue significativamente mayor que el control negativo en ninguno de los ligandos utilizados (Figura 3). La producción de FNT-α no pudo ser cuantificada.







Discusión

La participación de moléculas que reconocen patrones conservados entre patógenos, conocidas como receptores tipo toll (RTT), demostró tener importancia en la regulación de los fenómenos inflamatorios oculares inducidos por virus.^5,8 Aunque previamente habíamos sugerido hipotéticamente que la infección por adenovirus en células epiteliales corneales (CEC) generaba la producción de una cascada de citocinas en las que la IL-1b podría ser la responsable de los cambios inmunofisiopatológicos,⁵ en este trabajo demostramos que la citocina involucrada en estos fenómenos es en realidad la IL-6.

La participación predominante de IL-6 durante la infección de CEC es interesante, pues en los últimos años se ha sugerido que esta citocina puede favorecer los procesos proinflamatorios inducidos por virus, como ha sido demostrado en CEC infectadas por HSV.⁹ La IL-6 también tiene la propiedad de suprimir la función de las células reguladoras (Treg) y de activar células productoras de IL-17 (Th17).^10,11 Las células Treg tienen como actividad principal controlar la respuesta inmunitaria autorreactiva o autoinmune, mientras que las Th17 tienen como función preponderarte activar los procesos efectores inflamatorios.¹² De tal manera que la producción de IL-6 en células infectadas por adenovirus podría ser la responsable del fenómeno inflamatorio ocular y contribuir a la uveítis transitoria en pacientes infectados por adenovirus.

Por otra parte, en este estudio no encontramos producción de otras citocinas involucradas con el proceso inflamatorio como IL-1b, FNT-α o IFN-%alpha; en el sobrenadante de cultivo de las células epiteliales corneales infectadas por adenovirus. Estos resultados coinciden con informes previos en los que se propone que algunas células de la superficie ocular (epiteliales corneales o limbales) expresan RTT, pero éstos no son completamente funcionales.^13,14 Aunque lo anterior también podría explicarse porque las CEC son células completamente diferenciadas y su capacidad funcional podría estar restringida. Por esta posibilidad se decidió estudiar la producción de citocinas en las células que las originan (células epiteliales limbales), a través de la señalización por RTT.

Los resultados de la estimulación vía RTT mostraron que RTT8 (en mayor proporción), seguida de la estimulación vía RTT4 y RTT2 indujo una producción importante de IL-6 en células epiteliales limbales. Estos resultados coinciden con lo comunicado por Jin y col.,⁸ quienes demostraron un incremento significativo en la expresión de RTT8, RTT4 y RTT9 en córneas infectadas por HSV. Por otra parte, los resultados encontrados también son concordantes con los de Johnson y col.,¹⁵ quienes sugirieron por el modelo murino que la activación vía RTT2, RTT4 y RTT9 induce inflamación corneal.

Por último, tomando en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo y los datos disponibles en la literatura proponemos que los mecanismos moleculares involucrados en la generación de las manifestaciones clínicas durante la infección por adenovirus podrían tener la siguiente secuencia hipotética inmuno-fisiopatológica:

A. El adenovirus, al infectar CEC o CEL, puede interactuar con distintos ligandos intracelulares (RTT-3, RTT-7, RTT-8 y RTT-9), de éstos, sólo la activación por RTT8 podría inducir una producción importante de citocinas proinflamatorias, en particular IL-6. Esta citocina podría actuar como mediador de las reacciones inflamatorias de la superficie ocular, como se demostró en HSV,⁹ y suprimir la actividad de las células T reguladoras,^10-12 favoreciendo la uveítis transitoria.

B. La IL-6 podría estar involucrada también con la expresión de moléculas coestimulatorias (familia B7) en las CEC infectadas por Ad5 como se demostró en CEC infectadas por Ad,⁵ y en otros epitelios.¹⁶

C. La expresión de moléculas coestimulatorias en las CEC podría activar clones autorreactivos, como se demostró en la queratitis herpética,¹⁷ contribuyendo también con la uveítis moderada transitoria. Además, la expresión de este tipo de moléculas coestimulatorias (B7) por las CEC infectadas⁵ podría favorecer aun más la infección corneal por Ad, ya que estas moléculas podrían ser utilizadas como ligandos por el adenovirus para infectar más CEC, lo que se ha demostrado al menos para Ad3.¹⁸

D. El microambiente también juega un papel importante en la respuesta inmune antiviral, el TGF-β producido por las CEC infectadas,⁵ induce la producción de FGF por fibroblastos estromales.¹⁹ Ambas citocinas, TGF-β y FGF, podrían favorecer la remodelación corneal, como se informó en otros epitelios en donde la infección por adenovirus induce remodelación subepitelial,²⁰ lo que correspondería con las lesiones subepiteliales y las opacidades del estroma corneal que se observan clínicamente (véase la secuencia hipotética en la Figura 4).







En conclusión, los datos obtenidos en este estudio permiten sugerir que la IL-6 es un mediador importante del proceso proinflamatorio corneal durante la infección por adenovirus y que las células epiteliales limbales podrían contribuir a este microambiente a través de la señalización por RTT8.

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