Clinical and Molecular Study of Adenovirus Causing Sporadic Conjunctivitis in Mexico

Abstract
Objective: To identify adenoviruses (Ad) responsible for sporadic conjunctivitis in a Mexican population. Methods: Fifty-three patients were studied to evaluate the parameters compatible with a diagnosis of follicular conjunctivitis. Samples of the inferior conjunctival fornix scraped from each patient were processed to identify Ad by means of generic PCR. The adenovirus types were identified both by nested-PCR-RFLP and Multiplex-PCR techniques. Results were analyzed using descriptive statistics and Chi square analysis. Results: Severe chemosis had a statistically significant relationship with data from the positive generic PCR (p < 0.01). The nested-PCR-RFLP allowed the identification of Ad3 (subgenus B) in 11 studied samples, whereas the multiplex-PCR revealed the presence of Ad1 in two samples and Ad2 in 16 samples, both pertaining to subgenus C. Statistical analysis of clinical data correlated the presence of pharyngitis with the Ad pertaining to the subgenus C (p < 0.05). Conclusions: There are not reports of sporadic infection by Ad in Mexico. This article shows that the presence of severe chemosis and pharyngitis represents exploratory data that could identify a true infection by Ad. Types belonging to subgenus B and C were identified by means of PCR-RFLP and multiplex-PCR.

Key words
adenovirus, follicular conjunctivitis, keratoconjunctivitis, ocular infections

Artículo completo
Introducción

Los adenovirus (Ad) son la principal causa de diferentes cuadros clínicos como la conjuntivitis folicular, la queratoconjuntivitis epidémica y la fiebre faringoconjuntival. Las manifestaciones clínicas pueden ser leves y ocasionales o llegar a ser graves y crónicas, pueden permanecer por varios meses y así constituir una causa importante de ausentismo escolar y laboral. En las manifestaciones leves se pueden mencionar la sensación de cuerpo extraño, dolor, fotofobia, quemosis, irritación ocular –comúnmente manifestada como ojo rojo–, lagrimeo, disminución de la agudeza visual y visión borrosa. Entre las manifestaciones clínicas más graves se encuentran la formación de seudomembranas, ptosis, infiltrados subepiteliales, iridociclitis y disminución importante de la agudeza visual.^1,2

Se identificaron 51 tipos de adenovirus que se agrupan en 6 subgéneros (A-F) de acuerdo con sus características fisicoquímicas, capacidad oncogénica, patrones de hemoaglutinación y homología en el ADN.^1,3 Los tipos identificados como responsables de la mayoría de los casos de conjuntivitis foliculares son: Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7, Ad11, Ad13, Ad14, Ad15, Ad21y Ad34.⁴ Los agentes más frecuentes de casos esporádicos son Ad3 y Ad4, mientras que los casos epidémicos se atribuyen a los tipos pertenecientes al grupo D (Ad8, Ad19 y Ad37).^5-8 Los adenovirus del subgénero C (Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6) son responsables de infecciones de las vías respiratorias.^1,9

El objetivo de este estudio fue realizar una revisión sistemática de los pacientes que acudieron al servicio de oftalmología integral de nuestra institución, con signos y síntomas compatibles con conjuntivitis folicular y correlacionar las manifestaciones con los tipos esporádicos de adenovirus identificados mediante pruebas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR-anidada y análisis de restricción enzimática (RFLP).


Matrial y métodos

Pacientes

El protocolo fue revisado y aprobado por el comité científico y de bioética de la institución. La muestra comprendió 53 pacientes con sintomatología compatible con un diagnóstico probable de conjuntivitis folicular. Se incluyeron pacientes mayores de 15 años y que hubieran firmado un consentimiento informado. Se hizo un registro de cada paciente y se obtuvieron los siguientes datos: nombre, edad, dirección, teléfono, diagnóstico inicial, ojo afectado, dolor, ardor, fotofobia, prurito, sensación de cuerpo extraño. A la exploración física se registró la presencia de membrana, seudomembrana o su ausencia, ojo rojo –incluyendo sacos superior e inferior–, quemosis y la presencia o ausencia de hemorragias subconjuntivales. Las manifestaciones extraoculares exploradas fueron: la existencia de descarga nasal anterior, adenomegalias (cervicales anteriores, submandibulares y periauriculares) y faringitis. Se tomó control fotográfico de los casos graves con cámara digital. Todos los cuestionarios y las exploraciones físicas fueron llevada a cabo por un solo médico entre el día 0 y el día 2 del diagnóstico. El análisis estadístico se realizó con estadística descriptiva y la correlación entre los datos clínicos y los hallazgos de laboratorio mediante análisis de chi cuadrado.


Muestras clínicas

Se analizaron muestras de raspado de saco conjuntival inferior utilizando un hisopo de arginato de calcio, el cual se introdujo posteriormente en un medio de trasporte que contenía 50 mg/ml de gentamicina, 500 U de penicilina-estreptomicina/ml, fungizona 1 mg/ml y 5% albúmina sérica bobina (Sigma Chemical, St. Louis, EE.UU.) en un buffer de Hank.


Extracción de DNA

La extracción de ADN se realizó con el mini kit QIAamp según protocolo de Quiagen (Qiagen, Sciences, Maryland, EE.UU.). El material genético fue almacenado a -20°C hasta su identificación.


PCR genérica

Los oligonucleótidos ADRJC1 y ADRJC2 fueron usados para amplificar un producto de PCR de 140 pb (Tabla 1). Este amplificado corresponde a una región muy conservada del ADN que codifica para la proteína que constituye los capsómeros de todos los adenovirus. Fueron usados como controles Ad1, Ad2 y Ad5, aislados de pacientes con infección respiratoria aguda, proporcionados gentilmente por la Dra. Irma López Martínez, del Laboratorio de Infecciones Respiratorias del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológica de la Secretaría de Salud (México, D.F.) Cada reacción fue hecha según el protocolo de Elnifro y col.¹⁰ en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co., Norwalk, Connecticut, EE.UU.). Los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa al 1.5% teñidos con bromuro de etidio (1 μg/ml). Se usó como marcador estándar de pesos moleculares el Ready-Load 100 bp DNA Ladder (Invitrogen Co, LT Carlsbad, EE.UU.).







Tipificación de adenovirus por PCR anidada-RFLP

Con el fin de identificar los tipos responsables de la infección, las muestras positivas en la PCR genérica se procesaron para PCR anidada según el protocolo de Saito-Inagawa y col.⁴ Los oligonucleótidos AdnU-S´ y AdnU-A (Tabla 1), amplifican una secuencia del gen de la proteína exón que comparten los adenovirus Ad1-8, Ad11, Ad14, Ad19, Ad37, Ad40 y Ad41. Los amplificados se sometieron al análisis de restricción (RFLP), con las enzimas Eco130I (StyI), BsuRI (HaeIII) (Fermentas Inc. Glen Burnie, EE.UU.) y Hinf I (Promega Co., Madison, EE.UU.); los protocolos de digestión se realizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los productos de digestión fueron corridos en electroforesis, en un gel de agarosa al 1%, 50 voltios/2 horas y teñidos con bromuro de etidio. Como marcadores estándar de pesos moleculares se usó el Low Mass Ladder (Invitrogen) y X174DNA/Hae III (Promega).


PCR múltiple específica para el subgénero C

Se usaron oligonucleótidos que reconocen el gen que codifica para el filamento de los adenovirus Ad1, Ad2 y Ad5 del subgénero C. El oligonucleótido AdCF, es común en los tres Ad y los oligonucleótidos Ad1R, Ad2R y Ad5R (Tabla 2) pertenecen al ADN que codifica el filamento de los serotipos correspondientes. La PCR múltiple permitió la obtención de los amplicones de 630 pb, 455 pb y 204 pb, correspondientes a los tipos Ad1, Ad5 y Ad2, respectivamente. Cada reacción fue hecha según el protocolo Adhikary y col.⁸ Las reacciones se realizaron en un termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer Co. Norwalk, EE.UU.). Los productos de amplificación fueron separados en gel de agarosa al 1.5% y teñidos con bromuro de etidio (1 μg/ml). Como marcador estándar de pesos moleculares se usó el Low Mass Ladder (Invitrogen).







Resultados

Se encuestaron y revisaron 53 pacientes (73 ojos). Todos presentaron manifestaciones clínicas de conjuntivitis folicular o queratoconjuntivitis epidémica, compatibles con infección por Ad. Quince pacientes tuvieron afectado el ojo derecho (28.3%), 18 el ojo izquierdo (33.9%) y 20, ambos ojos (37.74%). El promedio de la clasificación subjetiva de dolor fue de 4.06 (desvío estándar [DE] 2.94) fotofobia 4.30 (DE 2.98), ardor 4.58 (DE 3.20), prurito de 5.72 (DE 3.28).


PCR genérica

Muestras de 29 pacientes fueron positivas en la PCR genérica para adenovirus. En la Figura 1 se muestra el amplificado de 140 pb, representativo de un resultado positivo para esta prueba. Al comparar las manifestaciones clínicas de ojo rojo, lagrimeo, ojo afectado, la presencia o ausencia de hemorragia subconjuntival, lagrimeo, adenomegalias, faringitis y sensación de cuerpo extraño no se encontró una relación estadísticamente significativa entre estos datos con los obtenidos en la PCR genérica.







Tipificación de adenovirus por PCR anidada-RFLP

Este método permitió la identificación de Ad3 en 11 de las muestras positivas para el PCR genérico. La Figura 2 muestra el resultado representativo de la PCR anidada de tres muestras. La Figura 3 ejemplifica los productos de la PCR anidada tratados con las enzimas de restricción. Los perfiles de restricción obtenidos sólo permitieron la identificación del tipo Ad3. Los serotipos correspondientes al subgénero C no pudieron ser identificados debido a que el patrón de corte con las enzimas es similar para los adenovirus pertenecientes a este grupo, por lo que se usó una PCR múltiple para reconocerlos.












PCR múltiple

Se pudo identificar dos tipos Ad1 y dieciséis tipos Ad2. La Figura 4 muestra un ejemplo de los productos de amplificación obtenidos en esta prueba, en ella se observa un amplificado de 630 pb y dos de 204 pb, correspondientes a Ad1 y Ad2.







Se observó que los pacientes en los que se identificaron virus del subgénero C estaban relacionados con los cuadros clínicos de vías respiratorias (p < 0.05).


Discusión

Existen informes sobre la epidemiología de los tipos de adenovirus en México. Pizarro y col. identificaron por neutralización los anticuerpos de los tipos Ad1, Ad2 y aislaron Ad2 como responsable de un brote faringo-conjuntival en una casa de cuna.^11,12 En muestras de 8 029 pacientes diagnosticados con infección respiratoria aguda, López y col. demostraron por inmunofluorescencia indirecta, que 94 fueron positivas para adenovirus.¹³

Sin embargo, no informaron los genotipos responsables. Recientemente, Mejía López y col. identificaron por métodos moleculares adenovirus asociados con conjuntivitis en una pequeña muestra de pacientes mexicanos.¹⁴

En este trabajo comunicamos la identificación de Ad2 como responsable del 55.1% de los casos estudiados. El Ad2 es un tipo perteneciente al subgénero C, tiene un tropismo particular por epitelios de vías respiratorias, es responsable al menos del 5% de las infecciones respiratorias agudas (IRA) a nivel mundial. Los tipos Ad1, Ad2, Ad5 y Ad6 conforman el grupo.^1,2 Los tipos Ad3 y Ad7 (subgénero B), especialmente este úlitmo, son responsables de cuadros faringo-conjuntivales y casos esporádicos de cuadros respiratorios graves. Este serotipo está asociado a manifestaciones clínicas de daño pulmonar grave, con fatales consecuencias.^15,16

El tipo Ad3 es uno de los más comunes distribuidos a nivel mundial. Se lo ha informado como responsable principal en cuadros respiratorios, de fiebre faringo-conjuntival y queratoconjuntivitis epidémica.^17-19

En nuestro estudio, el Ad3 representó el 37.9% en las muestras que resultaron positivas en la PCR genérica. La faringitis fue predominante en las manifestaciones clínicas exploratorias en nuestros pacientes (p > 0.05), de lo que podemos deducir que los adenovirus Ad1, Ad2 y A3 identificados pudieron ser parte del cuadro farigo-conjuntival que se caracteriza en estos tipos. La quemosis fue otra de las manifestaciones clínicas que correlacionó con una infección verdadera por Ad (p < 0.01). El resto de las manifestaciones clínicas investigadas no brindan orientación clínica para inferir la etiología.


Conclusiones

En este estudio se pudo demostrar la presencia de Ad3 (subgénero B) informado frecuentemente como un tipo esporádico en períodos de verano y de los serotipos Ad1 y Ad2 pertenecientes al subgénero C, los cuales son característicos en infecciones respiratorias por adenovirus.

Al ser nuestro instituto un centro de referencia, este trabajo es un indicador de los tipos de adenovirus responsables de casos esporádicos en la población. El seguimiento en la identificación de estos virus permitirá mostrar qué tan esporádicos son estos genotipos o si en verdad están relacionados con brotes endémicos en nuestro país.

Bibliografía del artículo
1. Schmitz H, Wigand R y Heinrich W. Worldwide epidemiology of human adenovirus infections. Am J Epidemiol 117:455-466, 1983.
2. Horwitz MS. Adenoviruses, p2155 In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM y col (ed). Fields Virology. 3a Ed. Philadelphia. Lippincott Raven Publishers, 1996.
3. De Jong JC, Wermenbol AG, Verweij-Uijterwaal MW, Slaterus KW, Wertheim-Van Dillen P, Van Doornum GJ y col. Adenoviruses from human immunodeficiency virus-Infected Individuals, including two strains that represent new candidate serotypes Ad50 and Ad51 of species B1 and D, respectively. J Clin Microbiol 37:3940-3945, 1999.
4. Saitoh-Inagawa W, Oshima A, Aoki K, Itoh N, Isobe K, Uchio E y col. Rapid diagnosis of adenoviral conjunctivitis by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol 34:2113-2116, 1996.
5. Shiao S, Aoki K, Isobe K, Tsuzuki WL, Itoh N, Toba K y cols. Genome analysis of adenovirus type 3 isolated in Japan. J Clin Microbiol 34:313-416, 1996.
6. Shepetiuk SK, Norton R, Kok T e Irving LG. Outbreak of adenovirus type 4 conjunctivitis in South Australia. J Med Virol 41:316-318, 1993.
7. Jernigan JA, Lowry BS, Hayden FG, Kyger SA, Conway BP, Groschel DH y col. Adenovirus type 8 epidemic keratoconjunctivitis in an eye clinic: risk factors and control. J Infect Dis 167:1307-1313, 1993.
8. Adhikary AK, Numaga J y Kaburaky T. Rapid detection and typing of oculopathogenic strain of subgenus D adenoviruses by fiber-based PCR and restriction enzyme analysis. Invest Ophthalmol Vis Sci 42:2010-2015, 2001.
9. Kajon AE, Suárez MV, Avendaño LF, Hortal M y Wadell G. Genome type analysis of South American adenoviruses of subgenus C collected over a 7-year period. Arch Virol 132:29-35, 1993.
10. Elnifro EM, Cooper RJ, Klapper PE y Bailey AS. PCR and restriction endonuclease analysis for rapid identification of human adenovirus subgenera. J Clin Microbiol 38:2055-2056, 2000.
11. Pizarro SC y Ortega PO. Investigación de anticuerpos hacia los adenovirus II. Anticuerpos específicos de tipo. Rev Lat-amer Microbiol 5:153-158, 1962.
12. Pizarro E y Reséndiz Lara J. Aislamiento de adenovirus tipo 2. Estudio de un brote en la casa de cuna. Rev Invest Salud Pública XXVII:233-243, 1967.
13. López Martínez I, Flores León R y Fuentes Rosas E. Infecciones respiratorias agudas (IRAS) de Etiología Viral en México. Epidemiología 18:41, 2001. Secretaría de Salud. México www.dgepi.salud.gob.mx/boletin/2001/sem41/edit41.pdf.
14. Mejía López H, Matías Florentino M y Vélez Montoya R. Identificación por métodos moleculares de adenovirus asociados a conjuntivitis. Arch Soc Esp Oftalmol 81:375-382, 2006.
15. Kajon AE, Mistchenko AS, Videla C, Hortal M, Wadell G y Avendaño LF. Molecular epidemiololgy of adenovirus acute lower respiratory infections of children in the south cone of South America (1991-1994). J Med Virol 48:151-156, 1996.
16. Similä S, Linna O, Lanning P, Heikkinen E y Ala-Houhala M. Chronic lung damage cause by adenovirus type 7: a ten-year follow-up study. Chest 80:127-131, 1981.
17. Darougar S, Grey RH, Thaker U y McSwiggan DA. Clinical and epidemiological features of adenovirus keratoconjunctivitis in London. Br J Ophthalmol 67:1-7, 1983.
18. Guo DF, Shibata R, Shinagawa M, Sato G, Aoki K y Sawada H. Genomic comparison of adenovirus type 3 isoltes from patients with acute conjunctivitis in Japan, Australia and the Philippines. Microbiol Immunol 32:833-842, 1988.
19. Kim YJ, Hong JY, Lee HJ, Shin SH, Kim YK, Inada T y cols. Genome types analysis of adenovirus type 3 and 7 isolated during successive outbreaks of lower respiratory tract infections in children. J Clin Microbiol 41:4594-4599, 2003.