Conclusión breve
Muitas mutações podem contribuir para a presbiacusia e para a deficiência auditiva em geral, e a deleção mitocondrial mtDNA4977 associada a presbiacusia e a mutação mitocondrial A1555G relacionada ao uso de antibióticos aminoglicosídeos, podem ser apenas uma delas.

Resumen

Introdução: A presbiacusia é a causa mais comum de deficiência auditiva, geralmente associada ao envelhecimento e a mutação mitocondrial A1555G é a principal alteração associada a surdez ocasionada pelo uso de aminoglicosídeos. Objetivo: Investigar a prevalência da deleção mitocondrial de 4977 pares de bases em pacientes com presbiacusia e da mutação A1555G em neonatos. Material e métodos: Estudo de casos em cem pacientes com presbiacusia e em cem neonatos com audição normal. O DNA foi extraído de amostras de leucócitos e primers específicos foram designados para amplificar o gene do citocromo b e as regiões que abrangem a deleção de 4 977 pb e a mutação A1555G do DNA mitocondrial, usando a técnica da reação em cadeia da polimerase e do polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição. Resultados: Uma região do gene do citocromo b foi amplificada confirmando a presença do DNA mitocondrial em todas as amostras do estudo. A deleção mitocondrial mtDNA4977 não foi identificada em todos os pacientes com presbiacusia, assim como a mutação A1555G nos neonatos. Conclusões: Estes resultados não descartam a possibilidade da existência de outras mutações que possam ocasionar presbiacusia ou a deficiência auditiva associada ou não ao uso de aminoglicosídeos e reforçam a importância de se identificar as causas genéticas subjacentes a fim de propiciar melhor compreensão das doenças auditivas na população brasileira.

Palabras clave
presbiacusia, deficiência auditiva, aminoglicosídeos, DNA mitocondrial, deleção mtDNA4977, mutação A1555G

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Especialidades
Principal: Genética Humana, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Medicina Interna, Neurología, Otorrinolaringología, 

Enviar correspondencia a:
Vânia Belintani Piatto, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, 15035-180, São Paulo, Brasil

Patrocinio y reconocimiento
Agradecemos aos pacientes que sem os seus consentimento e cooperação, este estudo não seria possível. Esta contribuição é extremamente importante para permitir a continuidade das pesquisas científicas a fim de proporcionar um futuro melhor aos brasileiros. Agradecemos a nossa amiga e tradutora Cecília Meneguette Ferreira, por seu considerável auxílio.

Study of Mitochondrial Mutations Associated with Sensorineural Hearing Loss in Brazilian Patients

Abstract
Introduction: Presbycusis -generally associated with aging- is the most frequent cause of hearing loss, and mitochondrial A1555G mutation is the main change associated with deafness caused by the use of aminoglycoside antibiotic. Objective: To investigate the prevalence of mitochondrial 4 977 bp deletion in patients with presbycusis and the prevalence of A1555G mutation in neonates. Material and methods: Case study on one hundred patients with presbycusis and one hundred neonates with normal hearing. DNA was extracted from leukocyte specimens and specific primers were designed to amplify cytochrome b gene and regions including mtDNA 4977 bp deletion and A1555G mutation, by PCR technique and restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique. Results: A region of the cytochrome b gene was amplified and the presence of mtDNA was documented in all study specimens. Deletion of mtDNA4977 was not identified in any patient suffering from presbycusis, neither was A155G mutation found in neonates. Conclusions: These results do not allow ruling out the existence of other mutations causing presbycusis or hearing loss, associated or not with the use of aminoglycoside antibiotics, and to reinforce the importance of identifying the underlying genetic causes in order to contribute to a better understanding of hearing loss in the Brazilian population.

Key words
presbyacusis, hearing loss, aminoglycosides, mitochondrial DNA, mtDNA4977 deletion, A1555G mutation

Artículo completo
Introdução

Nos países desenvolvidos, sabe-se que de cada 750 nascimentos, uma criança tem a possibilidade de apresentar deficiência auditiva do tipo sensorioneural e, estima-se que uma em cada 1 000 crianças seja afetada por surdez grave ao nascer ou até o término do período pré-lingual. Também, uma em cada 1 000 crianças torna-se surda antes de alcançar a idade adulta. A prevalência continua a aumentar e alcança índices de 50% em octogenários. Apesar desse aumento da prevalência e da importância da perda auditiva em idosos, os estudos são realizados, em sua maioria, nas formas de surdez pré-lingual.^1,2

Aproximadamente, 60% de todas as causas de surdez pré-lingual podem ser atribuídas a fatores genéticos. Desse modo, a etiologia genética passa a ter cada vez mais relevância nos casos de deficiência auditiva e/ou surdez. Os 40% restantes estão entre as mais diversas etiologias.^3,4 Cerca de 75% a 85% dos casos de surdez pré-lingual não-sindrômica manifestam-se como formas autossômicas recessivas. Formas autossômicas dominantes correspondem a cerca de 15% a 25% dos casos e os restantes 1% a 3%, são heranças mendelianas ligadas ao cromossomo X.^4,5 Também são descritas formas herdadas exclusivamente da mãe, correspondendo à herança mitocondrial, em cerca de 0.5% a 1% das causas genéticas de deficiência auditiva sensorioneural, mas podendo ocorrer mutações espontâneas.^4,5

A relação entre doença mitocondrial e deficiência auditiva foi estabelecida em 1986, pelo estudo de um paciente com miopatia mitocondrial e deficiência auditiva.⁶ A mitocôndria, uma organela citoplasmática encontrada em células dos mamíferos, possui o seu próprio DNA - o DNA mitocondrial, descoberto em 1966,^7-9 sendo totalmente sequenciado, em 1981,¹⁰ e constituído por uma estrutura circular fechada, com 16 569 pares de bases e 37 genes. Como as mitocôndrias têm a função de disponibilizar energia para as células, sob a forma de ATP, os órgãos que a requerem em grande quantidade são os mais comumente acometidos de mutações no DNA mitocondrial, não ocasionando, portanto, malformações, mas sim alterações funcionais nas células afetadas, como células nervosas, musculares, endócrinas, ópticas e auditivas.¹¹ Sendo a cóclea, um órgão com grande consumo de energia, mutações no DNA mitocondrial das células ciliadas podem ocasionar deficiência auditiva do tipo sensorioneural, bilateral e progressiva, com variações no grau e na idade da instalação.¹²

Mutações mitocondriais, especialmente nos genes 12S rRNA e tRNA^Ser(UCN), são conhecidas por serem umas das mais importantes causas de deficiência auditiva sensorioneural não-sindrômica, em algumas populações.¹³ Dentre todas essas mutações, uma substituição de bases nitrogenadas A→G, na posição 1555 no gene 12S rRNA do DNA mitocondrial, é de particular interesse como a principal causa de surdez relacionada ao uso de antibióticos aminoglicosídeos. Foi identificada, em 1993, em um estudo que, primeiramente, a descreveu como uma mutação que ocasionava surdez não-sindrômica e foi a primeira análise molecular genética relacionada à ototoxicidade induzida por aminoglicosídeos.¹⁴ Outros estudos demonstraram que a deficiência auditiva progressiva, associada à idade, é ocasionada por uma deleção mitocondrial de 4977pb (denominada del mtDNA⁴⁹⁷⁷) sendo, comumente, relacionada a presbiacusia, de ocorrência espontânea e sem história familial.¹⁵

Os antibióticos aminoglicosídeos são drogas bactericidas usadas no tratamento de infecções por bactérias Gram-negativas. Essas drogas têm alta afinidade por moléculas de RNA e, geralmente, a atuação é direcionada à ligação ao RNA ribossômico bacteriano, causando erros na tradução ou uma terminação prematura da síntese protéica. Esses erros na tradução protéica resultam nos efeitos bactericidas, observados pelo uso de antibióticos aminoglicosídeos. O uso dessas drogas é limitado pela nefrotoxicidade e ototoxicidade sendo essa, de natureza hereditária.¹⁶ Vários estudos têm proposto que a mutação A1555G, pela substituição das bases nitrogenadas, cria um novo par de bases C-G, tornando a estrutura secundária do 12S rRNA humano, estritamente semelhante à região correspondente do 16S rRNA da E. coli sendo, essa, referida como a região decodificante do rRNA bacteriano e um importante local de ação dos antibióticos aminoglicosídeos. Sendo assim, a ligação de aminoglicosídeos à região decodificante, resulta em erros na tradução protéica com concomitante morte bacteriana e, quando há a mutação, pelas alterações no gene 12S rRNA humano que o tornam de estrutura semelhante ao rRNA bacteriano, ocorre também a ligação dos aminoglicosídeos no DNA mitocondrial das células cocleares, potencializando seu efeito tóxico na orelha interna, ocasionando deficiência auditiva.^16,17 Estudos recentes a apontam como uma causa frequente de surdez hereditária não-sindrômica em pacientes de vários países industrializados, com uma prevalência de 0.5% a 2.4%,^18-26 tendo sido encontrada, também, em alguns pacientes nos quais não havia exposição aparente aos aminoglicosídeos.^18,27,28 No Brasil, foi determinada a frequência de 2% da mutação em pacientes surdos com e sem exposição aos aminoglicosídeos.²⁹

Estudos morfológicos, bioquímicos e moleculares demonstram que a fosforilação oxidativa normalmente declina com a idade. Além disso, deleção no DNA mitocondrial tem sido encontrada em uma variedade de tecidos de humanos, com idade avançada, e em tecidos de pacientes com doenças degenerativas.^30,31 Está claro que, deleções no DNA mitocondrial no coração humano, por exemplo, são idade-dependente, conforme estudo no qual se verificou que em indivíduos com menos de 30 anos, há 0% de deleção; na faixa etária de 31-40 anos, o índice de deleção é de 33%; na faixa etária de 31-40 anos, há 25% de deleção; de 51-60 anos, o índice é de 63% e de 61-70 anos, o índice alcança 75% confirmando que, as células com estas mutações acumuladas no seu interior, vão se tornando bioenergeticamente deficientes.³² A presbiacusia é caracterizada por uma deterioração progressiva, insidiosa e bilateral da sensibilidade auditiva, geralmente associada à idade, apresentando um padrão de curva descendente, com perda acima de 2 000 Hz aos exames audiométricos de tom puro, nos estágios iniciais. Aproximadamente, 23% da população entre 65 e 75 anos de idade e 40% da população, acima dos 75 anos, é acometida, sendo esta, a forma mais comum de deficiência auditiva nos Estados Unidos.³³ Desde que o conceito de deficiência auditiva associada à idade foi introduzido no final do século XIX, extensivos estudos têm sido realizados para o diagnóstico etiológico, patológico, histológico e epidemiológico da presbiacusia e, embora, seja comum em países industrializados, é rara em outros países podendo, esta diferença, ser atribuída a diferenças ambientais, dietéticas e fatores genéticos.^34-42


Objetivos

Investigar a frequência:

- da mutação mitocondrial mtDNA del⁴⁹⁷⁷, com o teste da Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction), em amostra de pacientes com presbiacusia documentada pelos exames realizados no Ambulatório de Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia.

- da mutação mitocondrial A1555G, com o teste da Reação em Cadeia da Polimerase (Polimerase Chain Reaction-Restriction Fragment Lenght Polymorphism - PCR-RFLP), em amostra de neonatos.


Casuística e métodos

De acordo com as Normas Regulamentadoras de Pesquisa em Seres Humanos, Resolução 196/96 do Ministério da Saúde, o projeto referente ao presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, SP (CEP-FAMERP).

Pacientes, de ambos os sexos, encaminhados ao Ambulatório de Otorrinolaringologia, com queixa de dificuldade auditiva foram avaliados por um otorrinolaringologista do Setor de Surdez, e submetidos à anamnese para investigar idade de início da perda auditiva, presença ou não de outros casos na família e excluir a possibilidade de causas ambientais: infecções materno-fetais, complicações perinatais, meningites, trauma acústico, diabetes. Os exames físicos, otorrinolaringológico e sistêmico, foram realizados para se excluir sinais sugestivos de formas sindrômicas de perda auditiva (dismorfismo crânio-facial, alterações tegumentares, anomalias de origem branquial, cardíaca, tireoidianas, distúrbios da visão, miopatias associadas ou não a diabetes, distúrbios de marcha, etc.). Após esta avaliação clínica, os pacientes realizaram os exames complementares, descritos a seguir, nos respectivos setores do Hospital de Base, pois este processo faz parte do protocolo de investigação para a surdez, em todos os pacientes com queixa de distúrbio da audição que são encaminhados ao ambulatório de Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia: avaliação laboratorial (provas de função renal, análise de urina, hormônios tireoidianos, glicemia), avaliação cardíaca (eletrocardiograma, RXTX PA e Perfil), oftalmológica (nos pacientes com suspeita de alterações visuais), audiométrica (realizada pela fonoaudióloga do Serviço de Fonoaudiologia - Setor de Surdez, onde foram o feitos os exames: audiometria tonal convencional, audiometria eletrofisiológica - audiometria de tronco do encéfalo e pesquisa de emissões otoacústicas), tomografia computadorizada de crânio (com estudo de mastóide e orelha).

Foram selecionados neonatos, de ambos os sexos, dos quais foi coletado sangue, imediatamente após ligadura do cordão umbilical, em tubos Vacutainer^® contendo anticoagulante (EDTA), realizado no Centro Obstétrico do Hospital de Base de São José do Rio Preto, SP (FUNFARME).

Os pacientes, então selecionados para o estudo, no período de Setembro a Outubro de 2006, foram divididos em dois grupos, com os respectivos critérios de inclusão e número da amostra:


Grupo I - Da Presbiacusia - 100 pacientes

a) diagnóstico comprovado por meio de audiometria tonal convencional;

b) ausência de qualquer outra anormalidade somática ou laboratorial, após realização dos exames físico geral e complementares.

c) ausência de síndromes genéticas aparentes, investigadas pelo exame físico genético-clínico.

d) presença ou não de outros casos na família.

e) idade acima de 45 anos.


Grupo II - Dos Recém-nascidos - 100 neonatos

a) nascidos no período do estudo, de parto natural ou cirúrgico.

c) índice de Apgar > 7 no 1º minuto.

d) sem malformações congênitas aparentes.

Foram estabelecidos os seguintes critérios de exclusão para cada grupo:

Grupo I - Pacientes com histórico de infecções materno-fetais, complicações perinatais, meningites, trauma acústico, traumatismo crânio-encefálico, sinais sugestivos de formas sindrômicas de perda auditiva, alterações nas análises laboratoriais, nos exames físicos geral e específico e aqueles nos quais se definiu a etiologia da deficiência auditiva ou apresentaram, após a audiometria tonal convencional, deficiência auditiva condutiva.

Grupo II - Recém-nascidos com malformações congênitas e/ou sinais sugestivos de formas sindrômicas de perda auditiva, alterações no teste de emissões otoacústicas, índice de Apgar < 7 no 1º minuto.


Investigação molecular

O DNA foi extraído das amostras de sangue periférico nos pacientes do Grupo I e do cordão umbilical, nos neonatos (Grupo II), usando o GFX^TM Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc.), de acordo com o protocolo do fabricante.

Para se detectar a deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷, fragmentos do DNA mitocondrial, que abrangem a região da deleção, foram amplificados pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Polimerase Chain Reaction) sendo utilizados dois pares de iniciadores ou primers, que são oligonucleotídeos sintéticos cuja seqüência dos mesmos e as condições para a reação da PCR foram de acordo com as descritas na literatura.³⁶ O par 1 foi sintetizado de modo que abrangesse as seguintes posições do DNA mitocondrial: primer foward (F1), posição de 8225 a 8247 e o primer reverse (R1), posição de 13574 a 13551. O comprimento do nucleotídeo flanqueado pelos primers F1-R1 (par 1) é de 5 350 pb no DNA mitocondrial normal. E, o primer foward do par 2 (F2), foi sintetizado de modo que abrangesse as posições 13176 a 13198 e o primer reverse (R2), as posições de 13724 a 13705. O tamanho esperado do fragmento amplificado pela PCR usando os primers F2-R2 (pair 2) é de 549 pb no DNA mitocondrial não deletado. Um fragmento de 373 pb é amplificado, pelos primers F1-R1 (par 1), na presença da deleção de 4977 pb, comumente observado no DNA mitocondrial mutante. A deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷ ocorre entre duas sequências diretas repetidas (ACCTCCCTCACCA) no DNA mitocondrial, nas posições 8470-8482 e 13447-13459.

Para se detectar a mutação A1555G,⁴³ fragmentos do DNA mitocondrial, que abrangem a região da mutação, foram amplificados pela técnica PCR. Para esta reação foi sintetizado um par de iniciadores ou primers cujas seqüência dos oligonucleotídeos e as condições para a reação da PCR foram de acordo com as descritas na literatura.⁴³

Como produto da reação da PCR, foi amplificado um fragmento de 643 pb o qual, posteriormente, foi submetido à análise de restrição pela técnica do Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP - Restriction Fragment Lengt Polymorphism), utilizando-se a enzima BsmAI⁴³ (New England Biolabs)^®, por 2 horas a 55ºC. A digestão enzimática do fragmento de amostras normais para a mutação A1555G produz dois fragmentos de 413 pb e 230 pb, devido o reconhecimento do sítio de restrição da enzima BsmAI. As amostras com a mutação produzem apenas o fragmento de 643 pb, pois não há o reconhecimento do sítio da enzima, devido a substituição das bases nitrogenadas A→G, na posição 1555 do DNA mitocondrial.

Todas as amostras também foram analisadas para amplificação de determinada região do gene do citocromo b. Esta região específica, uma área altamente conservada do genoma mitocondrial, atua como um controle para verificar a presença do DNA mitocondrial, nas amostras do estudo. Com primers específicos para esta região, um produto de 161 pb é esperado ser amplificado após técnica da PCR.³⁴

Todos os primers utilizados para a realização das PCR abrangem regiões, da sequência mitocondrial codificada, do Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence⁴⁴ e todas as reações de PCR foram processadas em ciclador de temperatura (Eppendorf^®, Modelo Mastercycler Personal, EUA).

Os produtos de ambas as reações, PCR e RFLP, foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE 1X, contendo brometo de etídio, na concentração de 0.5 μg/ml, submetidos à iluminação ultravioleta, para confirmar o sucesso da reação e o gel, fotodocumentado.


Análises estatísticas

Foram calculadas porcentagens (%) com os desvios padrões (DP) das mesmas, sendo os resultados expressos em %(DP_%).


Resultados

Do total de 100 pacientes brasileiros com presbiacusia, 61 (61%, DP_% = 4.87) são do gênero masculino e 39 (39%, DP_% = 4.87) do gênero feminino. Em relação à faixa etária, a idade variou de 48 a 76 anos para o gênero masculino, sendo a média de 70.35 anos (DP m = 1.02) e para o gênero feminino a idade variou de 54 a 89 anos, sendo a média de 74.03 anos (DP m = 1.06). Em relação a amostra de neonatos, 57 (57%, DP_% = 4.95) são do gênero masculino e 43 (43%, DP_% = 4.95) do gênero feminino.

Os resultados, a seguir, são apresentados conforme obtidos após realização das técnicas moleculares: extração de DNA genômico (nuclear e mitocondrial) e técnica da PCR/RFLP, com posterior eletroforese em gel de agarose.


Extração do DNA genômico

Foi possível a extração do DNA, à partir de leucócitos de sangue periférico e de cordão umbilical, de todas as amostras do estudo (100%).


Técnica da PCR para amplificação do gene do citocromo b

Realizada para se confirmar a presença ou não de DNA mitocondrial nas amostras. Foi possível a amplificação do gene do citocromo b, em um fragmento de 161 pb, confirmando-se a presença de DNA mitocondrial em todas as amostras de ambos os grupos do estudo (100%).


Técnica da PCR para amplificação do fragmento que abrange a região da deleção de 4977 pb, nas amostras dos pacientes com presbiacusia

Realizada para se verificar a presença ou não da deleção. Não foi identificado, em todas as amostras (100%), o fragmento de 373 pb que seria amplificado caso houvesse a deleção. Portanto, observou-se o fragmento de 5 350 pb indicando que as amostras do estudo não apresentam a referida deleção.


Técnica da PCR para controle de amplificação, nas amostras dos pacientes com presbiacusia

Realizada como controle de amplificação da PCR, que abrange a região da deleção, a fim de se confirmar a presença ou não da deleção nas amostras pois, o produto desta PCR, um fragmento de 549 pb, se amplifica nos genomas mitocondriais normais, o que não ocorre nos deletados. Foi possível a amplificação do fragmento de 549 pb confirmando-se, portanto, a ausência da deleção de 4 977 pb em todas as amostras do estudo (100%).


Técnica da PCR para amplificação do fragmento que abrange a região da deleção A1555G, nas amostras dos neonatos

A reação da PCR permitiu a amplificação do fragmento de 643 pb do DNA mitocondrial, que abrange a região da mutação, em todas as amostras analisadas (100%).


Técnica da RFLP para identificação da mutação A1555G, nas amostras dos neonatos

A mutação mitocondrial A1555G não foi identificada nas amostras do estudo (100%) pois, após a digestão enzimática, observou-se os fragmentos de 413 pb e 230 pb, os quais se amplificam na ausência da mutação.


Discussão

Este estudo permitiu, pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), realizar a análise molecular do DNA mitocondrial a fim de investigar a frequência da deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷ em pacientes brasileiros com presbiacusia e pela técnica PCR/RFLP, investigar a frequência da mutação A1555G em amostra de neonatos com teste de emissões otoacústicas normal.

Desde que o conceito de deficiência auditiva associada à idade foi introduzido no final do século XIX, extensivos estudos têm sido realizados para o diagnóstico etiológico, patológico, histológico e epidemiológico da presbiacusia e, embora seja comum em países industrializados, é rara em outros países podendo, essa diferença, ser atribuída a diferenças ambientais, dietéticas e fatores genéticos.^15,33,37

Uma vez que é impossível de se analisar a deleção comum do envelhecimento de amostras extraídas do osso temporal de indivíduos vivos, alguns estudos têm utilizado a técnica da PCR para verificar a presença de deleções no DNA mitocondrial, não apenas em amostras arquivadas de osso temporal humano,^15,37,38,40 mas também em leucócitos humanos,^36,45 como realizado no presente estudo, mesmo podendo não refletir a quantidade de mitocôndrias existentes no tecido sensorial auditivo.³⁶

Em estudos realizados foram encontradas a deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷ e a mutação mtDNA A3243G em pacientes japoneses com surdez sensorioneural, revelando que é possível a identificação de deleções e/ou mutações no DNA mitocondrial pela análise em leucócitos, encontrando, respectivamente, a frequência de 75% (45/60)³⁶ e 15% (3/20)⁴⁵ nos casos analisados.

O número de pacientes com presbiacusia do presente estudo, 100 casos, foi muito superior aos estudos realizados tanto em cortes histológicos de cóclea humana ou de roedores como em leucócitos humanos, variando de 3 a 60 casos.^{15,34,36,40,45} A metodologia utilizada no presente estudo foi semelhante às descritas na literatura,^34,36 permitindo a amplificação do DNA mitocondrial não-deletado e da região específica do gene do citocromo b, uma área altamente conservada do genoma mitocondrial atuando como um controle para verificar a presença de DNA mitocondrial nas amostras.

Mas, mesmo com uma casuística maior e metodologia rigorosamente semelhante aos estudos de referência^34,36 não foi encontrada a deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷ em todas as amostras analisadas, diferentemente dos estudos revisados que encontraram a deleção em uma frequência de 47% a 66% dos casos, incluíndo análises em cortes histológicos de cóclea e em leucócitos, conforme referido anteriormente.^{16,34,36,40,45} Exceção ao único estudo descrito¹⁵ no qual os autores analisaram cortes histológicos arquivados de osso temporal de três pacientes com presbiacusia, encontrando um paciente sem a deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷.

As diferenças nos resultados moleculares obtidos no presente estudo poderiam ser explicadas por algumas razões que talvez justificassem o porque destes pacientes com presbiacusia não apresentarem a deleção: as diferentes classificações da presbiacusia, a sua heterogeneidade genética e o fato de a mesma ser um processo multifatorial influenciado por fatores hereditários e variáveis ambientais³⁴ além de, a composição étnica da população brasileira ser altamente heterogênea, resultando em diferentes índices de prevalência entre as regiões brasileiras, justificando, conforme descrito na literatura, que a presbiacusia faz parte de processos multifatoriais podendo ocorrer diferenças etiológicas entre diferentes sociedades.^34,38,46

Provavelmente, a susceptibilidade ao acúmulo de deleções mitocondriais varia entre indivíduos e entre diferentes populações. Em algumas pessoas o acúmulo de deleções, durante o processo de envelhecimento, talvez possa ocorrer mais lentamente contribuíndo, juntamente com outras alterações mutagênicas no DNA mitocondrial tais como as lesões induzidas pelos radicais livres, para a perda da produção bioenergética mitocondrial. Sendo assim, a quantidade de deleções e o limiar para a expressão das doenças mitocondriais podem variar entre indivíduos e populações.⁴⁷

Em continuidade às pesquisas que identificaram que mutações no gene da conexina 26 (Cx26) ocasionam deficiência auditiva em uma significante proporção de casos, em populações de diversos países europeus, a descoberta de outras mutações tornou possível a identificação etiológica molecular em muitos pacientes propiciando, além da reabilitação precoce, o aconselhamento genético. Entretanto, tem sido interessante observar que a frequência de genes e mutações que ocasionam deficiência auditiva tem variado, significantemente, entre as populações. A mutação 35delG, no gene da Cx26, por exemplo, tem uma alta prevalência entre surdos de origem européia^48,49 enquanto é praticamente ausente em japoneses, coreanos ou mongolianos.^50,51

Do mesmo modo, a frequência de mutações mitocondriais também difere entre as diversas populações, sendo a mutação A1555G encontrada, principalmente, em pacientes com deficiência auditiva de transmissão materna, embora tem sido identificada, esporadicamente, em pacientes com herança autossômica recessiva. Em ambos os modos de transmissão evidencia-se grandes diferenças nas origens étnicas, conforme estudos recentes que a apontam como uma causa frequente de deficiência auditiva hereditária não-sindrômica, associada ou não ao uso de antibióticos aminoglicosídeos em populações do continente asiático^{18,25,28,43,52,53} de países árabes²⁶ e da África do Sul,⁵⁴ sendo rara na maior parte da população européia e americana.^55,56

Estudo realizado em 32 asiáticos com deficiência auditiva e em 100 controles Americanos (63 surdos e 37 ouvintes) encontrou a mutação em 87.5% do grupo asiático surdo, não a encontrando em nenhum dos indivíduos do grupo controle concluindo, que a mutação não é prevalente em população de origem não asiática.⁵⁶ Esse resultado foi confirmado em estudo na Grécia no qual a mutação não foi encontrada em 106 casos⁵⁷ e, em 202 pacientes, com deficiência auditiva não-sindrômica de início precoce, no Reino Unido.¹³ Da mesma forma, no presente estudo, não foi encontrada a mutação mitocondrial A1555G nos 100 neonatos com teste de emissões otoacústicas normal. Este resultado demonstra que a mutação não é uma causa comum de deficiência auditiva na presente amostra estudada.

Nos EUA foram realizados dois rastreamentos da mutação em neonatos. No primeiro, utilizando sangue de cordão umbilical de 1 773 recém-nascidos, foi observado apenas um portador da mutação.⁵⁸ No segundo rastreamento em 25 neonatos, com alterações no teste de emissões otoacústicas, não foi encontrada a mutação.⁵⁹ Na Argentina, rastreamento realizado em 300 recém-nascidos e em 712 indivíduos ouvintes, também não foi encontrada a mutação A1555G.⁶⁰ Esses estudos referem a baixa prevalência nas populações americanas, mas não descartam a necessidade da investigação molecular em testes de rastreamento neonatais, principalmente, em países nos quais há uso rotineiro de aminoglicosídeos.

A metodologia para identificação da mutação A1555G foi semelhante a descrita na literatura,⁴³ incluindo a amplificação de uma específica região do gene do citocromo b, uma área altamente conservada do genoma mitocondrial, que serviu com um controle de amplificação para se verificar a presença do DNA mitocondrial em todas as amostras analisadas, tanto nos pacientes com presbiacusia como nos neonatos.³⁴ Apesar do número de casos diferirem com alguns estudos da literatura e, mesmo não tendo sido encontrada a mutação A1555G, confirmou-se os resultados de estudos que também não a encontraram em grupos étnicos não asiáticos ou árabes.^55-60

No Brasil foi realizado um único estudo em 5 famílias com casos de deficiência auditiva, no qual foi determinada a prevalência de 2% (4 casos) da mutação A1555G. Desses casos positivos, apenas 1 estava associado a uma suposta exposição aos aminoglicosídeos e não foi encontrada a mutação no grupo controle constituído por afro-brasileiros, "brancos" e de origem asiática (japoneses ou chineses).²⁹ Tais resultados, diferentes do presentes estudo, podem ser explicados pela composição étnica altamente heterogênea da população brasileira, devido a miscigenação entre vários grupos étnicos; podendo resultar, portanto, em diferentes índices de prevalência nas várias regiões brasileiras.

Muitas mutações podem contribuir para a presbiacusia e para a deficiência auditiva, em geral, e a deleção mitocondrial mtDNA4977 associada a presbiacusia e a mutação mitocondrial A1555G relacionada ao uso de antibióticos aminoglicosídeos, podem ser apenas uma delas. A identificação de causas subjacentes da presbiacusia e da deficiência auditiva associada ou não ao uso de aminoglicosídeos é fundamental para auxiliar na terapêutica, principalmente em UTI neonatal, além de propiciar o aconselhamento genético e reabilitação precoce, permitindo a inclusão ou re-inclusão destes pacientes em suas atividades sociais e profissionais, além de propiciar um convívio familiar digno a todos estes pacientes.


Conclusão

As técnicas moleculares PCR e PCR/RFLP, com o protocolo utilizado, são métodos de fácil execução para rastreamento, respectivamente, da deleção mitocondrial mtDNA⁴⁹⁷⁷ e da mutação A1555G colaborando, portanto, para a investigação molecular da presbiacusia e da deficiência auditiva.

Há a necessidade de um estudo multicêntrico para se determinar a atual prevalência da deleção mtDNA⁴⁹⁷⁷ na população brasileira e, também, para investigar outras mutações que possam estar associadas ao envelhecimento e a presbiacusia, assim como, há considerável interesse na determinação da prevalência da mutação mitocondrial A1555G e na investigação de outras mutações que possam ocasionar deficiência auditiva associada ou não ao uso de aminoglicosídeos, por meio dos testes moleculares, conforme realizado no presente estudo, os quais podem ser um valioso complemento aos rastreamentos audiométricos neonatais.

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