RECENT ADVANCES IN SCREENING FOR INBORN ERRORS OF METABOLISM

Abstract
Over the last few years, our understanding of the pathological and molecular basis of inborn errors of metabolism has vastly increased. The identification of pathological metabolites is the cornerstone of all available screening tests, both newborn and selective. The introduction of new technology (tandem mass spectrometry) has enabled a dramatic expansion of newborn screening programmes to detect more disorders at an early age, although not without problems. This article attempts to portray the latest developments in screening for inborn errors of metabolism without hopefully destroying too much of the euphoria!

Key words
inborn errors of metabolism, newborn screening, selective screening, tandem mass spectrometry

Artículo completo
Introducción

El término "errores congénitos del metabolismo" (ECM) fue acuñado por sir Archibald Garrod a comienzos del siglo XX.¹ Aunque él no tenía conocimientos de los genes ni de genética molecular, fue lo suficientemente astuto como para reconocer que la herencia autonómica recesiva podía explicar la aparición de alcaptonuria, un defecto en el metabolismo de la tirosina, en la población, sobre la base de su investigación de consanguinidad y distribución de casos dentro de las familias.² Pasarían 50 años antes de que se pudiera establecer el defecto enzimático en la alcaptonuria³ y otros 50 años antes de que se identificara la mutación responsable.⁴ Garrod siguió hasta reconocer como ECM otras enfermedades tales como la cistinuria y la pentosuria; sin embargo, la escala temporal para la dilucidación completa de la fisiopatología de estas enfermedades es similar al de la alcaptonuria. Desde ese momento, se ha identificado un número cada vez mayor de ECM, lo que culminó en la publicación del libro The metabolic and molecular bases of inherited disease, que, en su forma actual, describe más de 500 enfermedades individuales y se encuentra disponible en formato electrónico.⁵

El "descubrimiento" de una ECM sigue básicamente al descrito por Spranger⁶ para las colagenopatías. Primero, se describe la manifestación real del trastorno, es decir la descripción clínica inicial. En segundo lugar, se describe el curso natural y, en tercer lugar, se realizan intentos para comprender la etiología y la patogenia. Al estudiar la causa, podemos descubrir que un trastorno dado no es una entidad nosológica sino un conglomerado de enfermedades producidas por diferentes procesos patogénicos e iniciada por diferentes acontecimientos primarios como mutaciones.

Las ECM afectan las capacidades del organismo para interconvertir los nutrientes o utilizarlos en la producción de energía. Se deben a un deterioro de la actividad de las enzimas, los transportadores o los cofactores, lo que conduce a la formación de metabolitos anormales (sustratos) proximales al bloqueo metabólico o a la ausencia de productos necesarios (Figura 1). Se pueden producir subproductos anormales cuando se utilizan vías alternativas para transformar los metabolitos acumulados cuya concentración los convierte en sustratos de enzimas que no suelen participar en su metabolismo. La medición de alguno de estos metabolitos o de sus subproductos es la piedra fundamental de la confirmación bioquímica de una ECM.







Como mencionamos antes, las descripciones clínicas de las entidades patológicas anuncian el progreso en ciencia básica y tecnología necesario para definir desde el punto de vista bioquímico la patogenia mediante la determinación de los metabolitos en los líquidos corporales. La introducción de la cromatografía en papel por Dent, en 1947,⁷ para analizar aminoácidos en orina, fue fundamental para preparar el terreno para el diagnóstico y el tratamiento de la fenilcetonuria (FCU),⁸ un trastorno descrito por primera vez en 1935.⁹ Los adelantos en la cromatografía y la espectrometría de masas que culminaron en la espectrometría de masas en tándem (EMT) y la espectrometría de masas de tiempo de vuelo han permitido dar un gran salto en nuestra capacidad para medir los metabolitos en los líquidos corporales.

Cada ECM es rara, pero como su número es algo elevado, como grupo afecta el 1% al 2% de todos los recién nacidos vivos. Si se tienen en cuenta sólo los niños enfermos o una población hospitalizada, esta proporción es más alta. Por lo tanto, las ECM representan una carga importante para la salud pública, sobre todo en aquellos países cuyas enfermedades infecciosas y trastornos relacionados con la asistencia prenatal y posnatal inapropiada no son suprimidos adecuadamente o en los países donde es frecuente la consanguinidad familiar sustancial. Nuestro mayor conocimiento de las ECM ha permitido lograr grandes adelantos en el tratamiento. Como ahora estamos en posición de tratar muchas ECM, es comprensible la necesidad de mejorar el diagnóstico. El término "pesquisa" (screening), en este contexto, significa "establecer la ausencia o la presencia de una enfermedad" y se ha convertido en una palabra cotidiana en la pediatría general. Sin embargo, en este caso debemos definirlo mejor.

La pesquisa puede ser subdividida en una pesquisa "del recién nacido o neonatal" donde todos los recién nacidos vivos son evaluados para cierto número (limitado) de enfermedades y la pesquisa "selectiva" en la que se seleccionan los pacientes para investigaciones metabólicas dependiendo de una combinación de signos clínicos, anomalías en los parámetros de laboratorio de rutina (p. ej. gases en sangre, amoníaco, lactato o enzimas hepáticas) y, tal vez lo más importante, sobre la experiencia clínica y el conocimiento de médicos bien entrenados.

Esta breve revisión examinará en forma crítica los adelantos recientes en la pesquisa neonatal y selectiva.


Pesquisa neonatal para ECM

La pesquisa neonatal de rutina para ECM fue elaborada inicialmente por Robert Guthrie en la década de 1960 sobre la base de una prueba sencilla para la FCU que utilizaba gotas de sangre desecada.¹⁰ Este y otros autores continuaron elaborando muchos otros ensayos de pesquisa con el uso de gotas, pero pocos alcanzaron amplio uso. En muchos casos se debió a la escasa frecuencia de los trastornos que investigaban. En otros, el argumento a favor de la pesquisa fue debilitado por la heterogeneidad clínica del trastorno relacionado o la ausencia de un tratamiento efectivo. El examen del hipotiroidismo congénito es la pesquisa más practicada internacionalmente, seguida por la FCU. Otros trastornos evaluados con frecuencia incluyen galactosemia, enfermedad de la orina de jarabe de arce y drepanocitosis, aunque las ventajas son más marginales y el ritmo de la introducción generalmente ha sido lento.

Un cambio importante comenzó en la década de 1990 cuando Millington y su grupo exploraron el uso de la espectrometría de masas en tándem (EMT) en el análisis de aminoácidos y acilcarnitinas en gotas de sangre desecada.¹¹ En ese momento no era factible realizar una pesquisa masiva utilizando esta tecnología. Sólo cuando se introdujeron en el mercado la ionización por electroaerosol y programas informáticos apropiados para el manejo de los datos la pesquisa neonatal se pudo convertir en una propuesta viable.^12,13 Hasta la fecha, la denominada "pesquisa neonatal ampliada" que utiliza EMT está disponible en Estados Unidos, Europa y Australia y se ha ganado experiencia en la pesquisa de una amplia gama de trastornos (Tabla 1). Sin embargo, existen importantes diferencias en la forma en que se ha implementado (o no) la pesquisa con la EMT en distintos países e incluso en diferentes regiones de un mismo país.¹⁴







La base teórica para la pesquisa masiva se desarrolló en la década de 1960, en parte en respuesta a los problemas creados por proyectos iniciados sin considerar sus consecuencias completas. Una monografía de Wilson y Jungner¹⁵ sugirió 10 criterios para la pesquisa neonatal (Tabla 2) y estos principios han sido utilizados con frecuencia como punto de partida para los análisis ulteriores; sin embargo, la pesquisa neonatal nunca ha sido una cuestión totalmente cerrada. Un ejemplo es la pesquisa de la galactosemia. Uno de los criterios de Wilson y Jungner es que la enfermedad debe ser "tratable" y éste no es realmente un criterio apropiado. En la actualidad se sabe bien que aun cuando se los trate directamente desde el nacimiento, los pacientes con galactosemia tienen mal pronóstico en términos de desarrollo neurológico.¹⁶ ¿Entonces no se debe realizar la pesquisa de la galactosemia?







En los últimos años, se ha obtenido mucha información relacionada con las ventajas de la pesquisa neonatal con ETM; no obstante, mediante una evaluación crítica se demostró que es difícil.¹⁷ Las pruebas del beneficio son escasas. Existen muy pocas dudas de que la pesquisa sea clínicamente eficaz para la FCU y el hipotiroidismo, pero en la mayoría de los otros trastornos hay pocas pruebas firmes. La experiencia clínica señala un beneficio probable (usted conoce desde antes a qué enfermedad se enfrenta), pero no se ha investigado bien el tamaño del beneficio ni tampoco de los perjuicios posibles. Ahora se acepta ampliamente que la pesquisa con EMT de la deficiencia de la deshidrogenasa de acil-CoA de cadena intermedia (DACCIM), que tal vez sea el trastorno hereditario más frecuente de la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales, es exacta y eficiente, y reduce la morbimortalidad en todo el mundo,¹⁸ aunque el momento oportuno para la extracción de la muestra después del nacimiento puede afectar significativamente las concentraciones de octanoilcarnitina en los recién nacidos con deficiencia de DACCIM. Por el contrario, la pesquisa neonatal de la deficiencia de la deshidrogenasa de acil-CoA de cadena muy larga (DACCML) parece ser problemática. Los niños en los cuales la primera muestra es positiva pueden tener concentraciones normales de C14-1 acilcarnintina en las pruebas repetidas después de los primeros días de vida. Por lo tanto, se recomienda someter a pruebas de mutación a todos los recién nacidos que tengan un examen positivo para la deficiencia de DACCML.¹⁹

Se han presentado problemas para que los profesionales de asistencia de la salud y los padres acepten la pesquisa neonatal ampliada con EMT. La aceptación por parte de los padres sólo ha sido examinada recientemente²⁰ y estos autores arribaron a la conclusión de que aunque la pesquisa neonatal ampliada puede mejorar los resultados en salud de los niños afectados y puede reducir el estrés de sus familias, los resultados falsos positivos de la pesquisa pueden colocar a las familias en riesgo de mayor estrés y disfunción parental. Un estudio más reciente de la pesquisa neonatal estatal en los Estados Unidos aconsejó actuar con cuidado debido al número elevado de niños con resultados falsos positivos.²¹ Además, no es posible coaccionar a los padres para que permitan la pesquisa en su hijo, como lo demuestra un informe de Sewell y col.²² en el cual los padres de un niño con una deficiencia de DACCIM detectada en la pesquisa neonatal ignoraron este hecho, lo que con posterioridad condujo a que el niño sufriera una descompensación metabólica un año más tarde, situación que trata de evitar la pesquisa neonatal. En el momento del diagnóstico, los padres se encuentran ansiosos, confundidos y cuando el niño parece clínicamente normal, se niegan a aceptar que su hijo tenga una enfermedad metabólica. Tal vez el personal médico deba estar mejor informado sobre la deficiencia de DACCIM para que informe efectivamente a los padres sobre las consecuencias de un resultado positivo. Por cierto, la situación de falta de adhesión de los padres podría ser más profunda en los casos detectados con una pesquisa neonatal ampliada cuando el beneficio para el paciente no llega a ser óptimo.


Pesquisa selectiva

El término "pesquisa selectiva" se refiere a la búsqueda de una ECM sobre la base de los signos clínicos en pacientes "seleccionados". Esto implica que los médicos aseguran una selección apropiada de los pacientes y ordenan las pruebas de laboratorio necesarias. El problema principal aquí es que los signos y síntomas suelen ser inespecíficos, y por lo tanto se requiere un amplio espectro de investigaciones de laboratorio (Tabla 3).







La pesquisa selectiva tradicional para ECM comprende el uso de técnicas principalmente cromatográficas para identificar una acumulación anormal de metabolitos intermedios proximales al bloqueo enzimático. Las pruebas químicas sencillas en una muestra de orina de una micción aleatoria pueden dar la primera indicación y éste fue el primer paso que condujo a la definición de la FCU.⁹ No fue hasta fines de la década de 1940 que se introdujo la separación cromatográfica de aminoácidos en orina, con la cual se pudieron delinear la cistinuria, la enfermedad de Hartnup y el síndrome de Fanconi renal.⁷ El análisis de aminoácidos en plasma sólo se volvió factible con la introducción del analizador automático de aminoácidos a fines de la década de 1950. En 1966, Kay Tanaka y col. desempeñaron un papel decisivo en el uso de la cromatografía gaseosa acoplada con la espectrometría de masas (CGEM) para diagnosticar una acidemia isovalérica.²³

Actualmente, el laboratorio metabólico posee un arsenal de técnicas analíticas para diagnosticar ECM. Los adelantos en la cromatografía y en los programas informáticos proporcionaron la base para los análisis rápidos con alta resolución de los componentes individuales de las mezclas complejas. Los líquidos corporales son mezclas complejas y los análisis complicados como los ácidos orgánicos requieren muchos pasos de extracción antes del análisis. En los últimos años se ha utilizado el análisis de CGEM de los ácidos orgánicos en orina para detectar nuevas enfermedades, especialmente con la introducción del análisis de los enantiómeros. En la actualidad se pueden analizar las formas D y L de muchos metabolitos²⁴ y esto tiene fundamental importancia para diferenciar, por ejemplo, entre la aciduria D-2-hidroxiglutárica y L-2-hidroxiglutárica, una enfermedad neurodegenerativa hereditaria relativamente nueva.²⁵ La espectrometría de masas es el método elegido para la detección y la cuantificación de los metabolitos del metabolismo intermedio y, por ejemplo, condujo a la detección de defectos en la síntesis de leucotrienos.²⁶ Otros adelantos en la espectrometría de masas incluyen el "tiempo de vuelo" que podría utilizarse para investigar moléculas grandes como las proteínas glucosiladas.²⁷ Lamentablemente, existen metabolitos que no pueden ser detectados por medios convencionales, es decir no pueden ser detectados con la cromatografía de aminoácidos de rutina o con la GCEM de ácidos orgánicos en orina. Aquí se demostró que la espectroscopia por resonancia magnética (ERM) in vitro es sumamente útil en la detección de nuevas enfermedades.²⁸ Se puede utilizar la ERM tanto in vivo como in vitro. La demostración de una señal anormal en el encéfalo de un paciente seguida por la demostración con una ERM in vitro de la misma señal en la orina del paciente formó la base para la descripción de una enfermedad hereditaria hasta ahora desconocida del metabolismo de los polioles.²⁹ Se utilizó un escenario similar para definir el primer trastorno de la síntesis de creatinina³⁰ y la deficiencia de β-ureidopropionasa.³¹

Como sucede con la pesquisa neonatal, las técnicas de EMT han traído ventajas para la pesquisa selectiva. El breve tiempo de análisis y el volumen mínimo de la muestra necesarios son de máxima utilidad cuando nos enfrentamos a un paciente con una enfermedad crítica y una ECM (trastorno de los aminoácidos, acidemia orgánica o defecto de la oxidación de los ácidos grasos) o debemos excluirla. Los usos recientes de la EMT incluyen la pesquisa de trastornos del catabolismo de las purinas y las pirimidinas,³² la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X, mediante la determinación de las porciones de los lípidos,³³ la globotriaosilceramida para la enfermedad de Fabry,³⁴ y los fragmentos de oligosacáridos/mucopolisacáridos para los trastornos del almacenamiento lisosómico;³⁵ sin embargo, es incierto si estos métodos ganarán aceptación general.

Dado que la gran mayoría de las ECM no han sido incluidas aún en el programa de pesquisa neonatal ampliada, se calcula que la mayoría de los pacientes aún siguen sin diagnóstico o con un diagnóstico erróneo, a pesar de mejores métodos diagnósticos. Por lo tanto, la pesquisa selectiva basada en médicos bien entrenados que aseguren la selección apropiada de los pacientes y la tecnología actual correctamente utilizada sigue siendo de suma importancia para el diagnóstico de las ECM en la mayoría de los pacientes.


Pesquisa genética

El advenimiento de la tecnología del ADN recombinante señaló tal vez una meseta en nuestro conocimiento de las ECM. La actividad en este campo actualmente es más lenta ya que la mayoría de los genes asociados con las ECM ya han sido clonados. Los ADNc clonados condujeron a la clonación y el mapeo de los genes propiamente dichos y a veces al conocimiento de la regulación de su expresión. Se recolectaron mutaciones por la puntuación y se realizaron intentos por encarar las correlaciones genotipo-fenotipo que fracasaron miserablemente. El análisis de las mutaciones proporcionó un diagnóstico prenatal más exacto y seguro, pero al alto precio de asegurar la secuenciación de los genes y la detección de mutaciones. Los intentos por utilizar el análisis de las mutaciones para la pesquisa se han limitado sólo a una o dos ECM donde una única mutación explica a la mayoría de los pacientes enfermos (p. ej., DACCIM); sin embargo, se debe recordar que ¡no se detectarán todos los pacientes mediante el uso de este sistema!


Perspectivas

Los adelantos científicos y tecnológicos que describimos antes mostraron gran beneficio en los pacientes con ECM. No obstante, con nuestra capacidad siempre creciente para diagnosticar ECM en un estadio temprano y tal vez utilizar la tecnología avanzada para detectar nuevos trastornos, indudablemente surgen problemas. En esta sección final, se encararán algunos de estos problemas.

En sus más de 40 años de existencia y evolución, la pesquisa neonatal cambió espectacularmente. La pesquisa neonatal evolucionó de un programa que era considerado con cierta sospecha por el público hasta otro bien conocido y popular. Los programas se ampliaron desde el uso de un procedimiento bien conocido que detecta sólo un trastorno hasta el uso de un procedimiento múltiple ampliamente debatido (EMT) que puede detectar muchos trastornos. Esta nueva tecnología ha conducido a una amplia demanda para su uso constante y su expansión en los programas de pesquisa neonatal y la frustración por que no sea utilizada más. En varios de los nuevos trastornos detectados poe EMT, la información es incompleta y fragmentada, lo que conduce al desacuerdo sobre si las enfermedades individuales deben ser evaluadas de forma universal.³⁶

Con una gama creciente de trastornos que pueden ser detectados, y con la disponibilidad de nuevos tratamientos, es tentador evaluar la presencia de ciertos trastornos antes de que se conozca el resultado a largo plazo o a un plazo intermedio, lo que disminuye los criterios para la pesquisa. Se han observado algunos intentos recientes por estandarizar la pesquisa en distintos países, que han adoptado diferentes enfoques y, en algunos casos, la presión del público llevó a la introducción de la pesquisa para ECM. Como parece inevitable que a menudo se pueda implementar la pesquisa sin pruebas firmes de beneficio, la evaluación continua de la eficacia clínica es parte necesaria de cualquier programa de pesquisa.

La ampliación de la pesquisa neonatal más allá de la EMT con el uso de tecnología basada sobre ADN está ganando ímpetu.³⁷ Al considerar las micromatrices multigénicas como prototipo, existe el potencial de evaluar cualquier trastorno genético para el cual se haya identificado la mutación genética. Si los genes se encuentran disponibles, esta tecnología puede evaluar muchos trastornos fuera de las ECM, incluidos los trastornos por inmunodeficiencia, las distrofias musculares y los síndromes de sordera congénita.³⁸ Con una pesquisa directamente en el nivel genético se elimina la necesidad de esperar la acumulación del producto en el caso de una ECM. Una desventaja importante es que sigue siendo poco clara la correlación entre genotipo y fenotipo, y se requerirá un esfuerzo considerable para definir las relaciones genotipo-fenotipo para el uso de este enfoque en la pesquisa neonatal.

Como se mencionó antes, en la actualidad no es posible realizar la pesquisa de todas las ECM en el período neonatal, pero a pesar de los resultados desconocidos, se está ejerciendo presión para ampliar los programas de pesquisa. Algunos nuevos conceptos terapéuticos para algunos trastornos del almacenamiento lisosómico han sido instructivos para acelerar el progreso en el uso de EMT para la pesquisa neonatal de este grupo de trastornos.³⁹ La promesa inicial de utilizar proteínas lisosómicas "genéricas" (LAMP1) no se ha visto reflejada en estudios prospectivos. En la actualidad se están evaluando dos estrategias para la pesquisa: la medición de la actividad de las proteínas lisosómicas⁴⁰ y la determinación de la cantidad de proteínas.⁴¹ Ambas utilizan determinaciones múltiples y habitualmente realizan pruebas de "segundo nivel" en la misma muestra inicial. Esta perspectiva plantea algunas controversias que varían desde cómo y qué evaluar hasta los problemas asociados con cuándo comenzar el tratamiento (cuando existe).

El diagnóstico exitoso de una ECM en un paciente, cuando no es detectada por la pesquisa neonatal, depende de la experiencia clínica del médico que deriva. Las primeras descripciones históricas de los pacientes con ECM son ejemplos ilustrativos del modo en que un médico sagaz observó al paciente. En la actualidad, con la cantidad siempre creciente de ECM y también la variación fenotípica asociada con estos trastornos, la educación es de suma importancia. En esta era electrónica, Internet, los foros profesionales permanentes de intercambio por correo electrónico, las ediciones de libros en línea, las bibliotecas electrónicas y la disponibilidad de bases de datos de acceso libre proporcionan mucha información para ayudar a categorizar a los pacientes. Esta forma de comunicación abre caminos para otras investigaciones y estrategias terapéuticas a medida que se pueden reclutar pacientes con enfermedades raras de todo el mundo.

Todo esto sólo puede ser posible con los fondos apropiados. La mayoría de los centros para el diagnóstico y el tratamiento de las ECM residen en unidades de enseñanza universitarias y en comparación con otros departamentos académicos, la mayoría de las unidades pediátricas no tienen lobby efectivo. Al diagnosticarse más pacientes a una edad temprana, el enfoque multidisciplinario del diagnóstico y el tratamiento de las ECM requerirá apoyo y evaluación continuos. Establecer y mantener este nivel elevado de una forma efectiva que sirva a los niños y las familias requiere un esfuerzo prolongado planificado y concertado.

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