CONTRIBUTION OF MOLECULAR AMPLIFICATION TECHNIQUES FOR DIAGNOSIS OF MENINGOCOCCAL DISEASE

Abstract
We submit the contribution of molecular techniques to the diagnosis of pediatric meningococcal disease from January 2001 to December 2005. Culture isolation and serogroup of Neisseria meningitidis was performed using traditional serology and biochemical methods. With regard to molecular techniques, we first used a traditional PCR with amplification of insertion sequence IS1106. On a second phase, it was substituted for Real Time PCR with detection of gene CtrA. Results: During the studied period, 148 meningococcal disease cases were diagnosed (63 female and 85 male), median age 4.7 years. Forty-eight patients were studied only by culture and N. meningitidis was isolated only in 22 cases (45.8%). The rest of the cases were studied by culture and PC R, microbiological confirmation being obtained in 78 cases (78%): five only by culture, 38 only by PCR and 35 by culture and PCR. Culture sensitivity in patients who had previously been treated with antibiotics was 13.5%, whereas PCR sensitivity was 67.5%. In patients with fulminant disease (septic shock in the first eight hours after the beginning of the disease), sensitivity was 73.3% for PCR and 33.3% for culture.

Key words
N. meningitidis, polymerase chain reaction, children, meningococcal disease

Artículo completo
Introducción

La enfermedad meningocócica es un grave problema de salud pública. Neisseria meningitidis es el agente causal de esta enfermedad que puede presentarse de forma endémica o epidémica. Actualmente, los brotes epidémicos suelen presentarse en los países en vías en desarrollo, donde alcanzan tasas de ataque superiores a los 500 casos por 100 000 habitantes.¹ En los países industrializados en que la enfermedad es endémica, N. meningitidis es –dada su prevalencia y alta letalidad,² que puede oscilar entre 4% y 10% de los casos^3-5– la principal causa de muerte por enfermedad infecciosa en niños. La incidencia de la enfermedad meningocócica varía entre países y regiones del mismo entorno. Así, en Europa se calcula una tasa promedio de 1.3 a 1.7 casos anuales por 100 000 habitantes, pero se encuentran variaciones tan amplias como 0.3 casos por 100 000 habitantes, en Italia, o 3.6 casos en Inglaterra o Gales.⁶ En Cataluña, la incidencia anual estimada es de 2.4 casos por 100 000.⁷

Uno de los factores que pueden influir en las diferencias de los casos informados, podría ser la falta de uniformidad de los distintos sistemas de declaración utilizados. La probabilidad de que todo caso de enfermedad meningocócica sea notificado y la probabilidad de que todo caso notificado sea verdaderamente una enfermedad menigocócica puede variar si los métodos de diagnóstico no son adecuadamente sensibles y específicos. Es conocida la amplia diferencia entre los casos declarados por sospecha clínica y los casos confirmados en el laboratorio de microbiología. La diferencia se debe fundamentalmente a la baja sensibilidad del cultivo tradicional, dado que N. meningitidis es un organismo muy lábil. Esta baja sensibilidad se incrementó en los últimos años debido a la administración generalizada de antibióticos en forma temprana, antes de remitir al paciente al centro hospitalario. Esta intervención es actualmente recomendada,⁸ por tanto es previsible que el número de pacientes remitidos al hospital de referencia con antibioticoterapia ya instaurada se incremente en los próximos años.

Las técnicas de amplificación molecular permiten la identificación de N. meningitidis con elevada sensibilidad y especificidad, incluso en muestras de pacientes previamente tratados con antibióticos. En los últimos años estas técnicas se generalizaron no sólo para la identificación del microorganismo sino también para su caracterización precisa: indentificación serológica de subgrupos,⁹ estudio de relaciones clonales¹⁰ y relación de la carga bacteriana con las manifestaciones clínicas de la enfermedad.¹¹

Presentamos la contribución de las técnicas moleculares en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad meningocócica en pacientes pediátricos atendidos en el Hospital Universitario de Sant Joan de Déu, de Barcelona, España.


Período de estudio

Se incluyen todos los pacientes menores de 18 años con diagnóstico clínico de enfermedad meningocócica invasiva atendidos en el Hospital Universitario Sant Joan de Déu desde enero de 2001 hasta diciembre de 2005.

El Hospital Sant Joan de Déu, es un hospital de referencia pediátrico (menores de 18 años) con 345 camas, 14 de ellas de cuidados intensivos, ubicado en el área metropolitana de Barcelona. La población pediátrica de esta área se estima en 200 000 habitantes. Debido a su condición de centro de alta tecnología muchos de los pacientes con enfermedad meningocócica son remitidos desde otras áreas geográficas. El Servicio de Urgencias atiende a más de 70 000 niños al año y la sección de Cuidados Intensivos ingresa 1 000 pacientes al año.


Definiciones

Se consideró el diagnóstico de enfermedad meningocócica según la definición y clasificación del Departament de Salut de Catalunya,¹² disponible en la web www.gencat.net/salut/depsan/units/sanitat/html/ca/professionals/spvemdo1.htm. En esta clasificación se considera caso sospechoso un cuadro clínico compatible sin confirmación por el laboratorio. El caso confirmado considera el cuadro clínico compatible con aislamiento del microorganismos o detección del ADN de muestras normalmente estériles como sangre, líquidos cefalorraquídeo, pleural, sinovial, pericárdico o líquido vesicular de las lesiones purpúricas.

La enfermedad se clasificó como fulminante, aguda y subaguda según su evolución desde el inicio de los síntomas hasta la presentación del shock séptico con asistencia hospitalaria:⁴ fulminante cuando el shock aconteció en las primeras 8 horas; aguda, entre 9 y 24 horas, y subaguda, más 24 horas, sin shock.


Identificación de los pacientes

Los pacientes se identificaron por revisión de los sistemas informatizados de resultados analíticos del Hospital y de la codificación de los informes de alta (CMBDAH con CIM-9-MC). En estas dos bases de datos se incluyen de forma sistemática todos los resultados analíticos (tipo de muestra, resultado del cultivo y de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sensibilidad antibiótica, serogrupo), así como datos epidemiológicos (edad, sexo, fechas de ingreso y de alta) y clínicos (diagnóstico al ingreso, intervenciones, comorbilidad, evolución clínica, diagnóstico al alta).


Estudios microbiológicos

El aislamiento por cultivo y serogrupo de N. meningitidis se realizó según metodos bioquímicos y serológicos tradicionales. La sensibilidad a los diferentes antimicrobianos se analizó con el método E-Test (AB Biodisk). Los criterios de sensibilidad fueron acordes con lo establecido por los Clinical Laboratory Standards Institute.¹³


Estudio por técnica de reacción en cadena de la polimerasa

Durante el período 1999-2000 evaluamos una técnica de PCR con hibridación del producto amplificado en placa ELISA y comprobamos la excelente sensibilidad y especificidad de la técnica.¹⁴ En el año 2001, la PCR se incorporó como estudio rutinario en los pacientes ingresados con sospecha de enfermedad meningocócica. Inicialmente se utilizó como diana un fragmento de la secuencia de inserción IS1106. En enero de 2004 se sustituyó esta PCR tradicional por otra PCR en tiempo real (PCR-TR) con detección simultánea de N. meningitidis y S. pneumoniae usando sondas TaqMan y primers del gen CtrA (específico de N. meningitidis) y del gen de la neumolisina (específico de S. pneumoniae).¹⁵ Para el diseño de los primers se utilizó el software Primer Express 2.0 (Applied Biosystem). La duración de la técnica PCR-TR desde la recepción de la muestra en el laboratorio de microbiología molecular es de 3 horas.


Análisis estadístico

Se determinaron las tasas de incidencia de enfermedad meningocócica según los casos diagnosticados sobre la población pedíatrica (menores de 18 años) del Hospital Sant Joan de Déu. La población de referencia de esta misma franja de edad se estimó según datos del censo publicado en la página web del Instituto Catalán de Estadística. Se calculó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo del cultivo y de la PCR considerando como referencia el diagnóstico clínico de alta hospitalaria. Para el análisis estadístico se utilizó la prueba de χ² cuando se cumplían las condiciones para su aplicación; en caso contrario, se usó la prueba exacta de Fisher. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 12.0 para Windows.


Resultados

Datos generales

Durante el período de estudio, se declararon 148 casos de enfermedad meningocócica en 63 niñas y 85 niños. La edad media de los pacientes fue de 4.7 años, con un intervalo de 1 mes a 17 años. De los 148 casos, 70 residían en el área de referencia del Hospital y fueron incluidos para el estudio de incidencia. El resto de los pacientes fueron remitidos desde otras áreas geográficas. La incidencia media anual por 100 000 niños menores de 18 años en nuestra área geográfica fue de 7.4 casos al año, destacándose en el año 2002 un pico de 11 casos por 100 000 niños (tabla 1).







Antes del ingreso en nuestro centro hospitalario 59 pacientes habían recibido antibioticoterapia.

La presentación clínica del total de casos atendidos fue: sepsis meningocócica en 59 pacientes (39.86%), meningitis en 29 (19.59%), sepsis con meningitis en 59 (39.86%) y, en un caso (0.67%), artritis meningocócica. Noventa pacientes requirieron ingreso en la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos: 38 pacientes con clínica de sepsis, 5 con meningitis y 47 con sepsis y meningitis. En 144, la historia clínica reflejaba el tiempo libre de síntomas hasta la presentación del shock con requerimiento de asistencia hospitalaria. En 18 de los 144 casos (12.5% del total) la presentación de la enfermedad fue fulminante, con un intervalo libre de síntomas hasta la presentación de shock séptico o signos meníngeos menor de 8 horas; en 96 casos (66.67%), la presentación fue aguda, y en 30 (20.83%), subaguda. Globalmente, fallecieron 8 pacientes (tasa de letalidad del 5.4%). Los pacientes con evolución subaguda de la enfermedad fueron los que presentaron la tasa de letalidad más alta (6.6%).

La evolución de los serogrupos de los casos confirmados muestra un amplio dominio del serogrupo B, 83.8% del total de casos, se destaca en los dos últimos años la desaparición del serogrupo C y la presencia de serogrupos no habituales en nuestra área geográfica como el A y el W135.


Confirmación microbiológica de los casos declarados. Contribución de la técnica de PCR

A pesar de la disponibilidad de la técnica de PCR para el estudio rutinario de todos los pacientes con sospecha de enfermedad meningocócica, solo 100 de los 148 pacientes fueron estudiados tanto por PCR como por cultivo.

La confirmación microbiológica en nuestro centro de los 48 pacientes estudiados únicamente por cultivo se logró sólo en 22 casos (45.8%), mientras que en los 100 pacientes en los que se agregó la PCR, el diagnóstico microbiológico se alcanzó en 78 casos (78%). Cinco pacientes tuvieron resultados positivos sólo del cultivo, 38 sólo por PCR y 35 por cultivo y PCR. El incremento del diagnóstico microbiológico en este grupo al añadir la técnica de PCR fue del 38% p < 0.01 (tabla 2). El incremento del diagnóstico al comparar el grupo de pacientes estudiados sólo por cultivo con el estudiado por las dos técnicas fue del 32.2%.







Es de destacar un caso de sepsis meningocócica con meningitis en el que se detectó por PCR coinfección por N. meningitidis y S. pneumoniae, por cultivo sólo se aisló el meningococo. Estos resultados fueron reproducibles en muestras consecutivas.

Se comparó la sensibilidad de la PCR y el cultivo según el antecedente de toma de antibióticos previa a la extracción de la muestra para estudio microbiológico. De los 100 pacientes estudiados por PCR y cultivo, en 37 existía el antecedente de antibioticoterapia previa a la extracción de las muestras para estudio microbiológico. La sensibilidad del cultivo en los pacientes pretratados fue del 13.5% (5 casos) mientras que la sensibilidad de la PCR fue del 67.5% (25 casos). Respecto de los pacientes sin tratamiento previo la sensibilidad del cultivo fue del 55.5% (35 de 63 casos) mientras que la de la PCR fue del 76.1% (48 de 63 casos). No se observaron diferencias significativas en la sensibilidad de la PCR según el antecedente o no de antibioticoterapia. Como era de esperar, el menor rendimiento del cultivo en los pacientes expuestos fue estadísticamente significativo p < 0.002.

Se comparó la sensibilidad del cultivo y de la PCR según la presentación fulminante (15 casos), aguda (68 casos) o subaguda (16 casos). En un caso no se conocía este antecedente. Es de destacar el incremento significativo de la sensibilidad de la PCR frente al cultivo en las formas fulminantes de la enfermedad, con sólo detección positiva por cultivo en cinco casos: 33.3% frente a 73.3% de la PCR (11 casos) p < 0.0001. En las formas de presentación aguda la sensibilidad del cultivo fue del 41.1% (28 casos) y la de la PCR 73.5% (50 casos) p < 00001. En el grupo con enfermedad subaguda observamos un menor incremento diagnóstico de la PCR: 43.7% cultivo (7 casos) y 68.7% PCR (11 casos) (tabla 2).


Discusión

Los datos que presentamos muestran una clara contribución de la detección por PCR del ADN de N. meningitidis para la confirmación microbiológica de los casos declarados de enfermedad meningocócica. El incremento encontrado es similar al comunicado en series anteriores.^14,16,17 Dadas las características pediátricas de nuestra serie es remarcable el escaso volumen de muestra necesaria para obtener este buen rendimiento. Otros aspecto interesante es la rapidez de la prueba. En el caso de la PCR tradicional que utilizamos en los primeros años, la duración de la técnica era de 5 horas, con trabajo manual de 3.5 horas, mientras que la duración por tecnología de PCR-TR se reduce a 3 horas, estando totalmente automatizadas las 2 últimas horas (fases de amplificación y detección del ADN ya extraído). Actualmente, es posible automatizar también la fase de extracción de ADN con robots con capacidad para procesar en pocos minutos un elevado número de muestras.¹⁸

Un hecho muy interesante en la práctica clínica es que el rendimiento de estas técnicas moleculares no queda significativamente reducido a pesar de la exposición previa a betalactámicos. Este hecho explica que la mayor diferencia encontrada entre la sensibilidad de la PCR y la del cultivo se observe en pacientes que habían recibido antibioticoterapia previa al procesamiento de la muestra (13.5% vs. 67.5%).

Algunos de los clásicos inconvenientes publicados sobre las técnicas moleculares eran su costo económico y la falta de universalidad del procedimiento para la detección en una misma serie de trabajo de las principales bacterias causantes de infección sistémica. Respecto del costo económico, en nuestro caso, los reactivos necesarios para el procedimiento por PCR-TR fueron significativamente más económicos que los tradicionales (30 euros vs. 3 euros). Respecto del segundo inconveniente, la detección simultánea de N. meningitidis y S. pneumoniae, nos permitió cubrir los dos principales agentes bacterianos causantes de sepsis y meningitis en el ámbito pediátrico en nuestro país. Sin embargo, otros agentes como S. agalactiae, E. coli, H. influenzae o Listeria monocitogenes deberían ser también estudiados. La detección del gen 16sRNA, común y específico de todas las bacterias prometía ser una vía interesante hace unos años, lamentablemente, la presencia de ADN residual bacteriano en el material y reactivos de laboratorio dificulta enormemente la utilidad de esta identificación genérica.^19,20 La sencillez y automatización de la tecnología PCR-TR abre una interesante vía para el estudio de diferentes genes de un amplio número de patógenos. Destaca en nuestra serie la coinfección en un paciente por N. meningitidis y S. pneumoniae. Las infecciones mixtas son conocidas desde hace años. En 1987 Downs y col. comunicaban que el 1% de las meningitis eran debidas a más de un patógeno²¹ y otros autores encontraron este hecho y señalaron cómo los métodos tradicionales de cultivo pueden subvalorar estas infecciones múltiples.^22,23

Observamos una incidencia estable de la enfermedad, la tasa encontrada en nuestra población infantil es ligeramente superior a la informada por otros autores en la población general (adultos y niños) de nuestra área durante la década del ’90. Así, Barquet y col. comunicaron una incidencia media anual de 5.47 casos por 100 000, y Cardeñosa y col., de 4.8.²⁴ Dado que nuestro estudio es estrictamente pediátrico y que es un hecho conocido la mayor incidencia en la población infantil podemos corroborar, como otros autores, la disminución de casos de esta enfermedad en los últimos años. Este descenso lo encontramos a pesar de haber mejorado el rendimiento del diagnóstico microbiológico con la introducción de la PCR en nuestra serie. Una de las causas que pueden explicar esta menor incidencia de la enfermedad respecto de años anteriores es la práctica ausencia del meningococo del grupo C en los últimos años. A mediados de los años ’90, la introducción de un clon con fenotipo C:2b:P1.2.5 significó un incremento significativo del serogrupo C que hacía temer una expansión de la enfermedad.^25,26 Este dato derivó en la recomendación universal de la vacunación contra el serogrupo C en nuestro país. Esta estratégia preventiva es por tanto la principal causa de la ausencia de este serogrupo. Las técnicas de amplificación molecular que hemos utilizado no permitían la clasificación serológica de subgrupos de las muestras positivas y esta deficiencia es un importante inconveniente para la monitorización de la enfermedad. Es por este motivo que en el año 2006 introdujimos la clasificación molecular serológica de subgrupos en muestra directa utilizando sondas y primers específicos de genes capsulares²⁷ y constatamos también con esta técnica la práctica ausencia del serogrupo C (datos no mostrados).

El procedimiento de PCR-TR permite cuantificar la carga bacteriana en la muestra si introducimos una serie de estándares de concentraciones conocidas. Diversos autores^11,16 utilizaron este proceder y detectaron altas cargas bacterianas en los pacientes más graves con cifras de hasta 10⁷-10⁸ copias/ml. Con esta elevada concentración de bacterias y considerando que la PCR tradicional (menos sensible que la PCR-TR) puede detectar < 10 copias/ml es totalmente plausible que la sensibilidad no se reduzca a pesar del tratamiento en los pacientes más graves.¹⁰ Por otra parte, el hecho de que la menor carga bacteriana se encuentre en los pacientes más estables podría explicar el menor incremento de la sensibilidad de la PCR en comparación con el cultivo en el grupo de pacientes no tratados con presentación subaguda (43.7% vs. 68.7%).

En conclusión, el estudio del ADN de N. meningitidis en muestra directa por técnicas moleculares es un complemento valioso del cultivo bacteriológico y contribuye a la mejora del diagnóstico microbiológico de esta enfermedad.

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