Autor: Vanessa Salete de Paula Columnista Experto de SIIC Institución: Fundação Oswaldo Cruz Artículos publicados por Vanessa Salete de Paula

Conclusión breve
Nesta revisão, o desenvolvimento de métodos de biologia molecular para o estudo desta virose, tanto para fins de diagnóstico como para estudos de epidemiologia molecular são discutidos.

Resumen

Dados epidemiológicos, sorológicos e moleculares permitem um melhor conhecimento da circulação do HAV na população e podem contribuir para o controle desta doença. Nesta revisão, o desenvolvimento de métodos de biologia molecular para o estudo desta virose, tanto para fins de diagnóstico como para estudos de epidemiologia molecular são discutidos. Quatro métodos diferentes de extração do RNA do HAV foram comparados. A partir da padronização do RT-PCR, foi realizada a detecção do RNA do HAV em amostras de soro de casos de hepatite sem o marcador anti-HAV IgM para definir o diagnóstico precoce de hepatite A na fase pré-soroconversão e esclarecer de casos de hepatite sem etiologia conhecida. O seqüenciamento nucleotídico de isolados de HAV mostrou que a maioria das cepas brasileiras é classificada no genotipo I, com co-circulação dos subgenótipos IA e IB, também mostramos um caso de infecção mista descrito pela primeira vez na literatura. Para facilitar a genotipagem de isolados de HAV, padronizamos a técnica de "heteroduplex mobility assay" o que simplificou nosso trabalho com a mesma eficiência. A detecção do RNA do HAV como ferramenta diagnóstica possibilitou também a identificação de casos de co-infecção de hepatite A em pacientes portadores de hepatite C.

Palabras clave
Hepatite A, diagnóstico molecular, PCR, genotipagem

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: Diagnóstico por Laboratorio, 
Relacionadas: Bioquímica, Epidemiología, Infectología, Medicina Interna, Salud Pública, 

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Vanessa S. de Paula, Fundação Oswaldo Cruz, Río de Janeiro, Brasil

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Os procedimentos foram feitos de acordo aos padrões éticos de experimentação em seres humanos da Declaração de Helsinque e aprovados pelo comitê de ética da Fundação Oswaldo Cruz. Agradecimentos: Ao CNPq e a FAPERJ pelo financiamento dos projetos, a Dra. Ana Maria Coimbra Gaspar, ao Dr. Christian Niel e a Dra. Livia Melo Villar pela orientação e colaboração nos projetos de pesquisa.

Artículo completo
Revisão

O vírus da hepatite A (HAV) é o único membro do gênero Hepatovírus, da família Picornaviridae,¹ apresenta simetria icosaédrica, não é envelopado, apresenta um diâmetro de 27 a 32 nm.² O genoma do HAV é formado por uma fita simples de RNA de polaridade positiva, constituído por aproximadamente 7 478 nucleotídeos, seguido por uma cauda poli (A) de 40 a 80 nucleotídeos.^3-5 Como todos os picornavírus, seu genoma pode ser dividido em três regiões distintas: uma região 5’ não-codificante (5’ NCR) compreendendo aproximadamente 10% do genoma; uma região codificante com uma única fase de leitura aberta (ORF), que codifica as proteínas virais estruturais e não estruturais e uma região 3’ não-codificante (3’ NCR), com aproximadamente 60 nucleotídeos, que possui uma cauda poli (A).^5-7

O primeiro critério utilizado para caracterizar os diferentes genótipos isolados da hepatite A foi o mesmo desenvolvido por Rico-Hesse e colaboradores (1987) para diferenciar isolados de poliovírus.⁸ Neste estudo, a região da junção VP1/2A foi selecionada para fazer a comparação das seqüências analisadas. A escolha desta região foi porque esta codifica a proteína VP1, que é a maior do capsídeo, corresponde a 40% da superfície do vírion e possui sítios de ligação para anticorpos neutralizantes.⁹ Além disso, esta região codifica a proteína não estrutural 2A, que tem função de protease nos poliovírus e catalisa a clivagem do precursor da poliproteína na junção P1/P2.¹⁰ Essa região genômica também despertou interesse porque entre os outros picornavírus inclui seqüências características de sorotipos, sendo assim, o sorotipo de um isolado poderia, a princípio, ser identificado apenas por análise de seqüência genômica.

Uma variabilidade genética superior a 20% foi encontrada na junção VP1/2A, entre as 247 bases estudadas equivalentes à cerca de 5% do genoma. Assim, as cepas do HAV foram classificadas em 3 genótipos. Em 1992, Robertson e colaboradores compararam seqüências de 152 isolados de diferentes partes do mundo. Neste estudo, foram analisados 168 nucleotídeos da região VP1/2A, compreendendo os nucleotídeos de 3.024 ao 3.191 da cepa HM-175. Os isolados foram divididos em sete genótipos, denominados de I a VII, sendo que os genótipos I e III foram divididos em subgenótipos A e B com 86 a 92.5% de identidade. Os genótipos I, II, III e VII agrupavam somente cepas de HAV humanas. O genótipo III incluía cepas de HAV humanas e a cepa PA 21, isolada de macaco. De acordo com essa nova classificação, muitas cepas humanas foram classificadas nos genótipos I e III, tendo somente uma cepa identificada para cada um dos dois outros genótipos, o II e o VII. Os genótipos IV, V e VI continham somente cepas símias. Este trabalho influenciou a pesquisa da variabilidade do HAV durante pelo menos 10 anos.

Porém, utilizando esta metodologia¹¹ para genotipagem do HAV, três variantes genéticas relatadas recentemente, na região VP1 (posições 25 e 28) e na região VP3 (posição 72), não foram detectadas.^12,13 Esta observação indica que o tradicional método de genotipagem pode não refletir sempre a variabilidade antigênica do vírus. Como uma alternativa, foi proposta recentemente a utilização da seqüência completa da região VP1 (900 nucleotídeos) para a construção de árvores filogenéticas ao invés do pequeno fragmento de 168 nucleotídeos utilizado anteriormente.^12,14

A análise filogenética da região VP1 completa revelou a presença de seis genótipos distintos. Nesta análise demonstrou-se que os genótipos II e VII eram dois subgenótipos do mesmo tipo.(IIA e IIB).^12,15

Até o momento as diferentes cepas de HAV humanas coletadas em regiões geográficas distintas, independentes da região estudada para a análise da variabilidade do HAV, apresentam características antigênicas comuns, tais como: um único sorotipo e reatividade similar aos anticorpos monoclonais contra o HAV. Isso favorece a eficácia de uma vacinação em massa, contribuindo para que no futuro seja possível a erradicação da doença.

O genótipo I é o mais abundante no mundo, particularmente o genótipo IA, que inclui cepas de HAV da América do Norte, China, Japão União Soviética e Tailândia.^8,11 Em estudos prévios verificou-se que todas as cepas analisadas da América Central e do Sul pertenciam ao subgenótipo IA, sugerindo que há circulação de uma população endêmica entre estes países.^16-18 Entretanto, estudos recentes relatam a circulação concomitante de subgenótipos IA e IB no Brasil.^19-21,25

O genótipo IB contém cepas provenientes da Jordânia, África do Norte, Austrália, Europa e Japão.¹¹ A co-circulação dos genótipos IA e IB também foi relatada na África do Sul.²⁶ Na Europa tem sido observado o genótipo IA, IB e III, devido aos isolados de HAV derivarem de múltiplos genótipos, provavelmente representando vírus de outras regiões.^11,27

A maior parte do restante dos isolados de HAV estão segregados no genótipo III, que possui dois subgenótipos (IIIA e IIIB).¹¹ A cepa viral protótipo do genótipo IIIA, foi originalmente isolada de macacos capturados do Panamá.²⁸ Cepas relacionadas com este genótipo têm sido coletadas de humanos com hepatite A na Índia, Siri Lanka, Nepal, Malásia e Estados Unidos.^11,29,30

O genótipo IIA é representado por uma cepa isolada em Sierra Leona em 1988, enquanto o genótipo IIB é representado por uma cepa isolada da França em 1979.^11,31 Os genótipos IV, V e VI também são representados por uma única cepa proveniente de uma espécie de “macaco do velho mundo”, oriundos da Filipinas, Quênia e Indonésia, respectivamente.¹¹

As manifestações clínicas pela infecção pelo HAV são geralmente brandas ou assintomáticas em crianças menores de 10 anos^32,33 e a partir desta idade observa-se que a doença se manifesta de forma mais grave, principalmente em adultos e idosos.³⁴ O período de incubação do vírus varia de 15 a 50 dias, com média de 30 dias.³⁵ Durante esta fase, o indivíduo permanece assintomático, apesar da replicação viral, e por esse motivo este é o período de maior transmissão viral devido à maior quantidade de vírus nas fezes.

O diagnóstico clínico da hepatite A aguda não permite diferenciá-la de outras formas de hepatites virais. Portanto é necessário um diagnóstico específico que é confirmado através da detecção de anticorpos anti-HAV da classe IgM,^4,36 geralmente feito por ELISA (teste competitivo), com vários kits disponíveis no mercado.³⁷ Embora existam seis genótipos de HAV, estes constituem apenas um sorotipo, não interferindo no diagnóstico sorológico. Esses anticorpos surgem precocemente na fase aguda da doença, seu título se eleva rapidamente, atingindo níveis séricos máximos de 3 a 5 semanas a partir da sintomatologia e normalmente desaparecem após três a seis meses do quadro clínico. A positividade do teste anti-HAV IgM em geral dura cerca de quatro meses, podendo chegar a 6 meses em 5% dos casos, e raramente, persiste por mais de 12 meses. Geralmente as ezimas séricas se normalizam antes da negativação dos IgM.³⁸

O anticorpo anti-HAV da classe IgG pode ser detectado simultaneamente à doença aguda ou a partir de uma a duas semanas e substitui os anticorpos da classe IgM. Seu título se eleva gradualmente, alcançando altos níveis durante a fase convalescente e permanece por toda a vida conferindo imunidade contra reinfecção.

Os testes para detecção de anti-HAV totais são utilizados fundamentalmente para determinar o estado imune de um indivíduo após a vacinação ou infecção. Na ausência de anti-HAV IgM o anticorpo detectado é uma imunoglobulina do tipo IgG, indicando infecção prévia ou resposta vacinal. Os anticorpos da classe IgA, possuem um importante papel na resistência intestinal contra algumas infecções virais. Na infecção pelo HAV estes anticorpos são encontrados nas fezes durante a fase aguda, persistindo alguns meses durante a fase de convalescença, no entanto, estes anticorpos não são encontrados em todos os pacientes e sua importância na recuperação clínica e na imunidade protetora é desconhecida.³⁹ Através de testes de radioimunoensaios, Stapleton (1991) demonstrou a presença de anti-HAV IgA em amostras de saliva obtidas de indivíduos 56 dias após o aparecimento de icterícia.

O diagnóstico bioquímico da hepatite A é estabelecido pela medição de níveis séricos de enzimas hepáticas intracelulares alanina-aminotransferase (ALT) e aspartato-aminotransferase (AST) e pela determinação dos níveis séricos de bilirrubina.

Técnicas de detecção de ácidos nucléicos são mais sensíveis do que testes imunoenzimáticos para detecção do HAV em diferentes tipos de amostras. O HAV tem sido detectado principalmente por transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR).^22,24 A amplificação do RNA viral por RT-PCR é atualmente o método mais sensível e amplamente usado para detecção do HAV RNA. Estudos demonstram que a detecção do RNA do HAV por “nested” PCR é clinicamente aplicável para o diagnóstico de infecções pelo HAV.^23,40-43 Entretanto, a disponibilidade de testes sorológicos bastante sensíveis para o diagnóstico da hepatite A que detectam anticorpos específicos das classes IgM e IgG no soro, torna menos necessária a implementação da técnica de PCR para a detecção do RNA do HAV na rotina de laboratórios. O uso do PCR tem importante papel no auxílio do diagnóstico em casos agudos de etiologia desconhecida e em surtos epidêmicos.^24,40 Outra ferramenta importante é a técnica de seqüenciamento de ácidos nucléicos realizados nos produtos de PCR para confirmação e caracterização do vírus, permitindo a demonstração da heterogeneidade genômica do HAV.¹¹

Em 1998, a variabilidade genética do HAV no Brasil (Rio de Janeiro) começou a ser estudada, pois apenas três amostras brasileiras de vírus HAV haviam sido anteriormente genotipadas e os dados constavam de um estudo de epidemiologia molecular realizado no CDC (Atlanta, GA-USA) realizado com amostras que tinham sido coletadas na década de 1980 para o controle da poliomielite.¹¹ Poucos estudos sobre a variabilidade do HAV tinham sido descritos, a principal dificuldade do estudo da variabilidade do HAV era a detecção do HAV no soro devido à falta da padronização de extração de RNA do HAV. E muitos autores acreditavam que o HAV apresentava curto período virêmico e também porque o vírus era eliminado nas fezes em geral antes do aparecimento dos sintomas. Em 2000, Bower e colaboradores⁴⁴ publicaram um artigo mostrando que a duração da viremia era maior do que se suspeitava inicialmente. Este fato, juntamente com a baixa positividade no ensaio PCR, nos levou a determinar o melhor método de extração e a padronizar a técnica de PCR, na tentativa de melhorar o nível de detecção do RNA do HAV nas amostras de soro e de fezes. Até então, poucos artigos haviam sido publicados utilizando a técnica de PCR, tanto para o diagnóstico como para a pesquisa do HAV. A implantação da técnica de transcrição reversa (RT) associada à PCR, representou um avanço no diagnóstico de vírus em geral. Para a implantação desta metodologia no diagnóstico e pesquisa da hepatite A, avaliamos as quatro técnicas de extração do RNA (Trizol, guanidina, proteinase K e sílica) mais utilizadas na virologia.²² Os métodos foram avaliados com o objetivo de melhorar a detecção do RNA do HAV por PCR e comparar a eficiência de detecção em amostras de soro e fezes. Foi observado que os diferentes métodos de extração apresentam sensibilidades diferentes quando utilizados para a detecção do RNA do HAV nas amostras de fezes e de soro. O método utilizando guanidina foi o mais eficiente, é um reagente eficiente na eliminação dos inibidores encontrados nas fezes e que podem interferir na reação de PCR. A extração com proteinase K também apresentou uma alta positividade, porém uma das amostras que foi positiva na extração utilizando a guanidina foi negativa quando extraída pela proteinase K. Existem vários tipos de inibidores nas fezes que podem interferir na amplificação do RNA viral, e os diferentes reagentes utilizados para a extração podem inibir diferentes substâncias presentes nas amostras.^45,46 Por este motivo, a sensibilidade dos métodos de extração podem variar dependendo do reagente que esta sendo utilizado.

Quando os quatro métodos de extração foram comparados para as amostras de soro, os melhores resultados foram com a proteinase K. Provavelmente, esta técnica foi a mais eficiente, devido ao uso da proteinase K, seguida pela extração de fenol clorofórmio que reduz a concentração de proteínas e componentes da membrana que podem inibir a atividade da Taq polimerase. Outros estudos com o vírus da hepatite C e o vírus da hepatite E também mostraram que este método é o mais eficiente na extração do RNA em amostras de soro.^47,48 Os resultados obtidos com extração feita com o Trizol confirmaram que esta técnica pode ser utilizada para a extração de amostras de soro, como já havia sido demonstrado anteriormente.⁴² Esta técnica é uma das mais utilizadas no diagnóstico de rotina devido à rapidez, entretanto, a presença de uma grande quantidade de lipídios no soro pode interferir na extração pelo método do Trizol e conseqüentemente na amplificação, levando a resultados falsos positivos.

Entre os métodos testados, os utilizando a sílica e a guanidina foram os menos eficientes para a extração do RNA do HAV em amostras de soro. A sílica é um reagente bastante utilizado para extração viral em amostras de soro e fezes.^49,50 Contudo, requer o preparo de tampões com diferentes pHs, várias centrifugações e é necessário que as soluções sejam pipetadas cuidadosamente para que o RNA seja removido das partículas de sílica.

A escolha no método de extração para ser utilizado nos testes de rotina de um grande número de amostras deve levar em conta a rapidez, a simplicidade do método, o custo e, principalmente, a sensibilidade do diagnóstico molecular do HAV. Neste trabalho, a média de tempo para a extração das amostras variou de 120 a 150 minutos. Entretanto, nenhuma técnica de extração foi eficiente para as amostras de soro e para as amostras de fezes. Depois do kit comercial da marca QIAGEN para extração do RNA viral, a proteinase K foi o método mais eficiente para a extração das amostras de soro e a guanidina para a extração das amostras de fezes. A escolha do método apropriado de extração é um passo importante para o sucesso e para a validação da técnica de PCR nas amostras clínicas. Além disto, o número de amostras positivas foi maior no soro do que nas fezes, provavelmente devido à presença de inibidores nas fezes, este fato nos levou a concluir que o soro é uma amostra clínica adequada para a detecção do RNA do HAV e além disto, é mais fácil trabalhar com amostras de soro do que de fezes. Baseando-se nestes resultados, passamos a trabalhar somente com amostras de soro para o diagnóstico e pesquisa molecular do HAV.

Após o estabelecimento da melhor metodologia para extração e padronização das condições de PCR, observamos que a sensibilidade dos nossos testes de PCR aumentou visivelmente, de 10% para 47% de positividade entre as amostras testadas. A otimização desta tecnologia abriu novas perspectivas para o estudo da biologia molecular do HAV.

Durante a padronização da técnica de PCR para o HAV, foi observado que, em alguns casos, era possível detectar o RNA do HAV em pacientes sem marcadores sorológicos para hepatite A; estes dados mostraram que a pesquisa do genoma do HAV pode representar uma ferramenta importante nos esclarecimentos de casos de hepatite aguda sorologicamente caracterizada como NANBNC, uma vez que 8% das amostras diagnosticadas no Centro de Referência Nacional para Hepatites Virais (CRNHV) durante o ano de 2000 de pacientes com hepatite aguda foram inicialmente classificadas como hepatite NANBNC com base nos resultados sorológicos. Embora a grande maioria dos casos que chegam ao CRNHV seja diagnosticada com eficiência, o uso do PCR para o diagnóstico do HAV nos casos de hepatites NANBNC pode auxiliar no esclarecimento dos casos sem etiologia conhecida, pois em 26% (12/46) das amostras NANBNC foi detectado o RNA do HAV.²³ Entre os pacientes que retornaram ao CRNHV para uma nova coleta de sangue, observou-se a presença do marcador anti-HAV IgM e a soroconversão para anti-HAV total, confirmando o diagnóstico precoce da hepatite A.

Neste estudo, também foi observado que durante os surtos ocorridos no orfanato e na escola pública do Rio de Janeiro, 38 de 261 crianças do orfanato e 157 de 250 das crianças da escola não apresentaram nenhum marcador sorológico para a hepatite A. Utilizando a técnica da PCR foi possível detectar o RNA do HAV em 5 de 38 (13%) amostras no orfanato e em 19 de 157 (12%) amostras da escola pública. A detecção precoce do RNA do HAV em surtos pode ser útil em situações epidêmicas para uma avaliação mais precisa da extensão da disseminação viral e para que medidas de controle sejam adotadas precocemente, pois uma criança assintomática e sem marcadores sorológicos pode estar infectada e transmitindo o vírus para outras crianças e adultos suscetíveis.

A duração da viremia do HAV foi recentemente estimada entre 39 e 391 dias por Bower e colaboradores (2000)⁴⁴ e entre 45 e 256 dias por Costa-Mattioli e colaboradores (2002).¹² Neste estudo não pudemos determinar a duração da viremia, pois não tínhamos informação sobre a data do início dos sintomas.

Testes moleculares para a detecção precoce de ácidos nucléicos do HIV e HCV já foram implementados nos bancos de sangue de vários paises. No futuro, o risco de infecção pelo HAV através do sangue e principalmente de hemoderivados poderá ser reduzido utilizando técnicas similares.^51,52 Até o momento existem poucos dados avaliando o número de amostras que são anti-HAV IgM negativa e RNA positiva, cujo sangue pode ser potencialmente infeccioso. O nosso trabalho mostrou a importância do uso de técnicas moleculares para o diagnóstico da hepatite A e a necessidade de analisar mais de uma amostra para o esclarecimento de casos de hepatite sem etiologia conhecida, principalmente em paises endêmicos.

Após os estudos das mudanças epidemiológicas da infecção pelo HAV e a padronização da técnica de PCR para o diagnóstico, estudos de epidemiologia molecular que pudessem retratar o impacto destas mudanças na população e colaborar para uma melhor definição de estratégias de um programa de vacinação seriam imprescindíveis. Começamos então, o estudo da epidemiologia molecular do HAV no Brasil, uma importante ferramenta para o conhecimento do genótipo das amostras circulantes tanto no Brasil como nos demais países, uma vez que poucos dados existiam a respeito na América do Sul.

O primeiro estudo de variabilidade genética do HAV foi realizado com as amostras do Rio de Janeiro provenientes de surtos e casos esporádicos.¹⁹ Neste estudo, 250 amostras de soro de pacientes com hepatite aguda do CRNHV foram investigadas, entre estes pacientes 46% (116) apresentavam anti-HAV IgM, e entre estas foi possível detectar o RNA do HAV em 54. Entre as 134 amostras negativas (sem anti-HAV IgM), detectamos o RNA viral em 17 (13%). Em paralelo, analisamos um segundo grupo de amostras que haviam sido coletadas no surto do orfanato, e em um total de 35 amostras anti-HAV IgM, 17 foram positivas para RNA. Trinta amostras dos dois estudos, entre as que foram positivas no PCR, foram parcialmente seqüenciadas. Embora a variabilidade entre as seqüências nucleotídicas das cepas do HAV seja relativamente baixa, a analise de 168 nucleotídeos na região VP1/2A permite a classificação do HAV em 7 genótipos diferentes.¹¹ Utilizando esta região para a analise filogenética das amostras do Rio de Janeiro, observamos que todas as amostras foram classificadas no genótipo I, sendo que a maioria das amostras humanas seqüenciadas em diferentes lugares no mundo pertence a este mesmo genótipo.¹¹ Contudo, entres as amostras do genótipo I, 21 foram classificadas no sub genótipo IB e 9 no subgenótipo IA. Esta co-circulação de dois sub genótipos em um mesmo país havia sido descrita anteriormente na África do Sul 26, na França.⁵³ No orfanato os isolados não apresentaram a mesma seqüência nucleotídica e foram classificados nos dois subgenótipos presentes no Rio de Janeiro, estes fatos mostrou que no mesmo surto estava co-circulando diferentes cepas do HAV, provavelmente vindas de diferentes fontes de infecção.

Em um estudo envolvendo amostras de soro outras regiões brasileiras provenientes de diferentes estados brasileiros foram seqüenciadas e classificadas no genótipo I, 231 no subgenótipo IA e apenas uma no genótipo IB²⁰ na Amazonia brasileira, das 81 amostras sequenciadas apenas 3 foram classificadas no genótipo IB. Estudos anteriores mostraram que a maioria das amostras da América do Sul e Central pertence ao genótipo IA.^{11,16-18,54,55} Este estudo mostrou que as amostras brasileiras apresentam grande similaridade com outras cepas da América do Sul. No Pará, Maranhão, Goiás e Minas Gerais, Amazonas observamos grupos com cepas idênticas ou com alta homologia entre as cepas, sugerindo um possível surto ou a infecção relacionada a uma mesma via de transmissão do HAV. Por outro lado, os isolados dos estados do Rio de Janeiro, Bahia, Paraná e Rio Grande do Norte não ficaram agrupados. Como estes estados recebem um grande número de turistas do Brasil e de outros países, aumenta a possibilidade da circulação de diferentes cepas. Provavelmente o genótipo IB apresente curso de infecção mais curto em relação ao genótipo IA, pois a maioria dos casos esporádicos é classificada no genótipo IA, e apenas nos surtos encontramos uma proporção similar de amostras IA e IB.²¹

Entre as 232 amostras seqüenciadas, 230 apresentaram uma substituição de Leucina para Isoleucina na posição 42 da proteína 2A quando comparadas com a cepa padrão HAS-15. Esta substituição pode ser uma característica geográfica das amostras brasileiras, pois esta já foi descrita anteriormente em um paciente norueguês que adquiriu a infecção no Brasil, mostrando assim a ligação epidemiológica entre pessoas que viajam para áreas endêmicas.^54,56

Os estudos da variabilidade genética nos mostraram que no Brasil circula um genótipo de HAV com dois subgenótipos diferentes e que, até o momento, não existem amostras humanas diferentes que possam escapar à neutralização dos anticorpos vacinais.

A analise filogenética do HAV deste estudo utilizou a junção VP1/2A do genoma viral. O genótipo I inclui a grande maioria das cepas humanas já conhecidas, este genótipo pode ser dividido em dois subgenótipos, IA e IB. Baseando-se nestas informações adaptamos o teste de “heteroduplex mobility assay” (HMA) para ser utilizado como uma técnica alternativa ao seqüenciamento do HAV para genotipagem das amostras.²⁴ Pelo fato de todas as amostras brasileiras terem sido classificadas no genótipo I, esta técnica foi padronizada para distinguir as amostras de HAV entre subgenótipo IA, subgenótipo IB e genótipo não-I. Neste estudo, demonstramos que a técnica de HMA pode ser utilizada como um método de genotipagem, porém isolados de outros genótipos de II-VI não foram testados, pois estes genótipos não foram descritos na América do Sul. Contudo, a técnica poderá ser eficiente também para a classificação dos outros genótipos, devido a distância genética entre os genótipos serem maior que entre os sub genótipos. Esta técnica foi utilizada com sucesso para a caracterização genética de isolados de HIV,⁵⁷ vírus do sarampo,⁵⁸ vírus Norwalk-like,⁵⁹ citomegalovírus,⁶⁰ HCV⁶¹ e novos vírus de influenza.⁶² Entretanto, a capacidade deste método de diferenciar os genótipos através da visualização de bandas de heteroduplex no gel de poliacrilamida, não garante que uma amostra do mesmo sub genótipo que apresente um padrão de banda homoduplex tenha a mesma seqüência que a amostra utilizada como padrão. Mesmo assim, esta técnica pode ser utilizada em casos de surtos epidêmicos com o objetivo de identificar quais os subgenótipos são responsáveis pela infecção.

Para a validação da técnica de HMA, 48 amostras com genótipos previamente conhecidos através do sequenciamento, todos os genótipos foram confirmadas no HMA, porém, uma das amostras, AUX-23, de uma menina de 15 anos trabalhando no orfanato, apresentou um padrão não usual de bandas heteroduplex com os dois sub genótipos, sugerindo a presença dos dois sub genótipos na mesma amostra de soro. Para melhor investigarmos este caso, 20 clones desta mesma amostra foram seqüenciados para confirmar a suspeita de dupla infecção pelo HAV. Entre os clones seqüenciados, 11 foram classificados no subgenótipo IA e 9 no sub genótipo IB. Este caso foi o primeiro relato no mundo de co-infecção em um mesmo indivíduo por duas cepas de HAV. Duas condições foram necessárias para que este fato ocorresse, primeiro, a presença de dois subgenótipos na mesma área geográfica, e segundo, o contato do indivíduo susceptível com duas fontes de infecção em um curto período de tempo. Este caso de co-infecção foi de uma menina que havia sido contratada pelo orfanato apenas 20 dias antes da coleta de sangue realizada para confirmar o surto de hepatite A. Estas condições podem ter facilitado a dupla infecção da paciente em um curto intervalo de tempo. Logo depois da publicação do nosso trabalho, foi descrito um caso de recombinação entre cepas de HAV dos genótipos IB e VII em uma menina que foi hospitalizada na França após viagem para Marrocos.¹⁴ Para que ocorra a recombinação é necessário que haja uma dupla infecção em uma mesma célula. Apesar da freqüência e as possíveis implicações patogênicas da recombinação do HAV não terem sido esclarecidas até o momento, acredita-se que a co-infecção é o primeiro passo para que ocorra a recombinação entre dois genótipos diferentes do mesmo vírus. Em junho de 2003, Sánchez e colaboradores descreveram a primeira evidência de distribuição de quasispecies do HAV,¹³ mostrando que apesar da conservação antigênica, mutações seletivas ocorrem durante a replicação, podendo explicar a presença de duas seqüências diferentes do subgenótipo IA que foram encontradas na amostra AUX-23.

Como demonstrado nos artigos descritos anteriormente, o uso de técnicas moleculares e sorológicas foram ferramentas importantes para o diagnóstico e a pesquisa do HAV. Uma vez padronizada a técnica de PCR, o seqüênciamento e a genotipagem do HAV, pudemos utilizar estas metodologias para outros estudos, como de da co-infecção do HAV com outros vírus. Avaliamos a infecção do vírus da hepatite A em pacientes portadores do HCV,⁶³ pois esta co-infecção pode aumentar a taxa de hepatite fulminante e a mortalidade. Dos 197 pacientes portadores de HCV (positivos para anti-HCV e RNA) que foram avaliados quanto à presença dos marcadores sorológicos para o HAV, 86% eram imunes ao HAV. Em um estudo feito nos Estados Unidos envolvendo 671 pacientes com hepatite C, apenas 38% eram anti-HAV total.⁶⁴ Duas razões podem explicar esta diferença da prevalência do HAV em portadores de hepatite C, primeiro, a maioria dos pacientes atendidos no CRNHV possui uma situação socioeconômica baixa e segundo, a idade média dos pacientes testados foi relativamente alta (44.8 ± 12.5 anos). Um terço dos pacientes susceptíveis tinham menos de 30 anos, e continuavam susceptíveis ao HAV, refletindo novamente a mudança do perfil epidemiológico da infecção pelo HAV no Brasil nas últimas décadas.

Apesar dos relatos de hepatite fulminante em pacientes co-infectados com HAV e HCV,^65,66 neste estudo não observamos casos de hepatite fulminante, porque os pacientes selecionados foram atendidos no CRNHV e não estavam hospitalizados em estado grave. Ainda assim, foi alta a proporção (6/27, 22%) dos pacientes susceptíveis que apresentaram pelo menos um marcador de infecção aguda do HAV, e em cinco deles foi possível detectar o RNA do HAV. Entre estes cinco pacientes quatro apresentavam níveis de transaminases ALT e AST elevados. Para confirmação da presença do RNA do HAV, as amostras foram seqüenciadas e posteriormente classificadas nos genótipos IA e IB. Estudos anteriores mostraram que a vacina da hepatite A é bem tolerada em pacientes portadores de hepatite C, e estes pacientes apresentam uma resposta imune satisfatória, embora seja inferior a de indivíduos saudáveis.⁶⁷

Apesar das notáveis melhorias nas condições de saneamento básico, o Brasil é um país que continua endêmico para o HAV, onde casos esporádicos e surtos ocorrem com freqüência. Com o aumento da proporção de pessoas susceptíveis ao vírus no futuro, a hepatite A pode surgir como uma doença reemergente, então estudos de vigilância epidemiológica molecular terão fundamental importância para verificar se não houve a introdução de uma cepa que escape à neutralização da vacina. O desenvolvimento e a padronização das metodologias avançadas de biologia molecular podem contribuir para a pesquisa e diagnóstico do HAV.

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