METHODS IN ASSESSMENT OF EFFICACY OF INACTIVATED POLIOVIRUS VACCINES USING TRANSGENIC MICE SUSCEPTIBLE TO POLIOVIRUS

Abstract
This review concerns methodological approaches to assessment of protective properties of new inactivated poliovirus vaccines (IPV) using transgenic mice susceptible to poliovirus. Vaccines include a new generation of IPV that is made from attenuated Sabin strains (sIPV), as well as combination products that include other protective antigens. Authors describe their own results and data published by others in order to present comprehensive picture of this assessment. The transgenic mouse test is based on immunization-challenge (functional part of the test) and includes serological assessment. Comparison of conventional IPV (cIPV) and sIPV of type 1 showed that type 1 sIPV possesses excellent immunogenicity and protectivity in Tg-mice. It was found that sIPV of type 2 induced lower levels of neutralizing antibodies and was less protective than type 2 cIPV against challenge with wild-type poliovirus. Authors conclude that transgenic mouse test for evaluation of immunogenicity and protectivity of new IPVs is an effective surrogate method in situation when clinical efficacy trials in people are impossible.

Key words
poliovirus vaccine, animal model, protectivity, serological tests

Artículo completo
Introducción

La campaña mundial para erradicar la poliomielitis iniciada por la Asamblea Mundial de la Salud en 1988 produjo una declinación importantísima de la morbilidad por poliovirus en todo el mundo y podría asociarse con la erradicación completa de la enfermedad en los próximos años.^1,2 Este fenómeno se acompañó de cambios sustanciales en las políticas de vacunación³ y se espera que más países dejen de usar la vacuna oral con poliovirus vivo (VOP) y comiencen a utilizar exclusivamente vacuna con virus inactivados (VPI). La mayor demanda de VPI obligará a que más compañías empiecen a fabricar este tipo de vacuna que requerirá una evaluación regulatoria que debe incluir la demostración de una eficacia adecuada.

Actualmente, la VPI se produce a partir de grandes volúmenes de poliovirus salvaje concentrado. Según el Plan de Acción Global de la OMS,⁴ después de que termine la circulación del poliovirus salvaje, todos los depósitos de poliovirus salvaje deben ser transferidos y manipulados en laboratorios que reúnan mayor infraestructura de contención, designados BSL-3/polio. Sin embargo, aun cuando exista un mayor nivel de seguridad no se elimina por completo el riesgo de liberar accidentalmente poliovirus salvaje en el medio ambiente. En 2006, la OMS hizo un pedido para generar nuevas vacunas contra la polio, producidas a partir de virus atenuados. Algunos fabricantes de vacunas comenzaron la primera elaboración de VPI a partir de cepas Sabin de virus atenuados (VPIs); Doi y col. del Japanese Poliomyelitis Research Institute (JPRI) refirieron resultados promisorios.⁵ Cuando se caracteriza una nueva VPIs es importante comparar su antigenicidad y sus propiedades protectoras con la VPI convencional (VPIc), preparada a partir de poliovirus salvaje. Doi y col. observaron que la VPIs del serotipo 1 era más eficaz y que la VPIs del serotipo 3 era comparable a la VPIc respectiva en ensayos de inmunogenicidad en ratas, mientras que la VPIs del serotipo 2 inducía menos inmunidad.⁵ La medición definitiva de eficacia de la vacuna puede obtenerse sólo en ensayos clínicos en poblaciones de seres humanos. Sin embargo, la morbilidad por poliomielitis, rápidamente en descenso, hace imposible evaluar nuevas vacunas de poliovirus en estudios clínicos. En función de las guías en animales recientemente publicadas por la FDA, en algunos casos en los cuales es imposible el estudio directo de la eficacia, los datos obtenidos a partir de experimentos animales pueden ser utilizados en lugar de los trabajos clínicos. No existe un modelo animal natural de poliomielitis, pero se crearon ratones transgénicos que expresan el receptor para el poliovirus. Estos ratones son susceptibles al poliovirus y han sido previamente propuestos para la evaluación de la VOP y de la VPI (referencias).

En este artículo presentamos una revisión de nuestros estudios sobre la creación de nuevos métodos de laboratorio para la valoración de las propiedades protectoras de la VPI generada a partir de la cepa salvaje y de cepas atenuadas de poliovirus. Estos estudios se realizan en colaboración con el Japanese Poliomyelitis Research Institute (JPRI) y con el Central Institute for Experimental Animals (CIEA), dos instituciones con las cuales tenemos amplia experiencia de cooperación sobre proyectos en ratón transgénico.^6-12


Modelo animal, inmunización y provocación

Los ratones transgénicos susceptibles al poliovirus (ratones TgPVR) se crearon entre 1989 y 1990 mediante la incorporación del receptor de poliovirus en el genoma murino,^13,14 de manera tal que los animales se tornan vulnerables a la infección.¹⁵ Se demostró que los ratones TgPVR discriminaban entre poliovirus con distinto grado de neurovirulencia.^6,13-17 Por lo tanto se empleó una de las líneas de ratón (TgPVR21) para elaborar la prueba de neurovirulencia en ratón transgénico, la cual fue propuesta en reemplazo del uso de monos en la evaluación de la seguridad de la vacuna oral con poliovirus vivo (live oral poliovirus vaccine [OPV]).^7,9,11,12,17 La creación de la prueba de neurovirulencia en ratón fue posible gracias a la producción en masa de ratones TgPVR21, por el CIEA japonés bajo la dirección del Dr. T. Nomura. El monitoreo de los animales TgPVR21 para determinar la ausencia de 22 patógenos específicos y la estabilidad generacional del material genético y del gen introducido es realizado rutinariamente por el CIEA como parte del control de calidad en animales. El mantenimiento, el depósito y el transporte de los ratones se efectúan según las recomendaciones del Memorando de la OMS para ratones transgénicos susceptibles a virus humanos.¹⁸ Para nuestros estudios revisados en este artículo, los ratones TgPVR21 fueron aportados por el CIEA. Las cepas monovalentes de VPIc utilizadas en este trabajo fueron amablemente cedidas por el productor de una vacuna; las muestras de VPIs fueron donadas por el JPRI.

Cualquier vacuna nueva contra poliovirus debería ser evaluada en comparación con las vacunas convencionales existentes para garantizar que sus propiedades inmunológicas sean idénticas y poder esperar, así, que la eficacia no difiera. La correlación entre los niveles de anticuerpos en suero y la protección frente a la enfermedad ha sido bien establecida con la VPI convencional. Sin embargo, dicha correlación puede no ser necesariamente idéntica para vacunas preparadas con cepas con propiedades inmunológicas distintas, como las cepas Sabin. Por lo tanto es aconsejable crear una prueba de protección en animales que proporcione indirectamente no sólo información sobre el nivel de anticuerpos inducido por los productos convencionales y los nuevos sino también que demuestre que estos anticuerpos se asocian con la misma protección. Con este propósito generamos un método de inmunización y de provocación en ratones TgPVR21. En este modelo se prueban dos serotipos (1 y 2) de la PVIc y de la PVIs. Los ratones fueron inmunizados por vía intraperitoneal una a tres veces y estimulados por vía intramuscular con 25 50% de la dosis paralítica de la cepa salvaje respectiva o con la cepa virulenta de poliovirus tipo 1 o 2.^10,19 Veintiocho a treinta días después de la inmunización final se tomaron muestras de sangre y de saliva luego de la provocación, generalmente hacia el final del período de observación de 2 semanas.


Métodos serológicos

La valoración serológica de la respuesta inmunológica en ratones se basó en un ensayo funcional de determinación de anticuerpos neutralizantes (prueba de la microneutralización o NT), pruebas de ELISA de bloqueo que simulan la NT y ELISA de unión para la detección de IgM e IgG en suero y de IgA en mucosa (de saliva).

La NT sigue siendo la “prueba serológica estándar” para poliovirus porque el estudio mide la función natural de los anticuerpos protectores (inactivación viral). Si bien los mecanismos de neutralización no son completamente precisos, en última instancia la NT es ampliamente aceptada como la prueba más específica y sensible.²⁰ El rendimiento de la microversión de la NT es simple y se conoce bien desde 1965.²¹ En nuestro estudio utilizamos la NT como el principal ensayo serológico, realizado tal como lo describió la OMS en el “Manual para investigaciones virológicas en polio”, de 1997.²²

A pesar de su sencillez y de su diseño simple, la NT tiene limitaciones, como su larga duración y la necesidad de utilizar cultivos de tejidos y virus vivos, entre ellos cepas salvajes de poliovirus. Este último hecho será de gran preocupación en la era posterior a la erradicación.⁴ Por lo tanto, en este proyecto se prestó especial atención a la creación de pruebas serológicas basadas en poliovirus salvajes inactivados que podrían convertirse en una alternativa confiable a la NT. Para tal fin, un ELISA de bloqueo²³ fue modificado y optimizado^24,25 y utilizado en paralelo con la NT y con el ELISA IgG e IgM para la determinación de la respuesta inmunológica en el modelo de ratones de vacuna y provocación.¹⁰ El ELISA de bloqueo incluye los siguientes pasos: el poliovirus inactivado (antígeno estándar) se captura en inmunoplacas que tienen adherida una IgG policlonal antipoliovirus; luego se añaden diluciones seriadas de la muestra de suero y los anticuerpos específicos de unen a los epitopes del virus fijado (efecto de bloqueo). En un paso posterior se agrega un conjugado de IgG antipoliovirus-biotina para determinar la reactividad residual de los poliovirus. La unión de los anticuerpos de la muestra a los poliovirus evita la reacción de éstos con el conjugado y por lo tanto se reduce la densidad óptica del producto coloreado en los pocillos que contienen las muestras reactivas de suero en comparación con los pocillos control (que tienen muestra de suero no inmunológico). La cuantificación de los anticuerpos se basa en la determinación de la dilución del suero que asegure el 50% de reducción de la reactividad del ELISA del conjugado de IgG-biotina. Los títulos del ELISA de bloqueo se calculan por datos de densidad óptica que se obtienen con diluciones seriadas de la muestra con una fórmula simple.^24,25 Por ende, los títulos del ELISA de bloqueo reflejan la cantidad de anticuerpos IgG e IgM. Al comparar el ELISA de bloqueo y la NT, el ELISA IgM e IgG mostró una buena correlación entre los resultados: r = 0.8 (ELISA de bloqueo/NT); r = 0.75 (ELISA de bloqueo/IgM ELISA; r = 0.7 (ELISA de bloqueo/IgG ELISA), p < 0.01.¹⁰

Otra variante de ELISA de bloqueo para la detección de anticuerpos contra poliovirus con capacidad de neutralización es el ELISA de inhibición de la unión (ELISA BI) descrito por Edevag y col.,²⁶ seguido por Herremans y col.,²⁷ Hashido y col.²⁸ e Ivanov y col.²⁹ Esta variante es una modificación del procedimiento que se describió con anterioridad. Una dosis óptima de polioviurs se mezcla con diluciones seriadas de la muestra de suero, se incuba y luego se transfiere a la placa que tiene adherida la IgG antipoliovirus. A diferencia del ELISA de bloqueo, en el cual la reacción inmunológica ocurre en la superficie de los pocillos, en el ELISA BI, los anticuerpos reaccionan con el virus en solución y la reactividad residual se mide por la cantidad de virus que puede capturarse en placas con anticuerpo fijado. En la práctica, las dos variantes de bloqueo de ELISA se asocian prácticamente con los mismos resultados, que muestran una excelente correlación con la NT (casi un 100% de sensibilidad y de especificidad). Si bien es teóricamente posible que en algún sistema los resultados de la NT difieran de los del ELISA BI o de los del ELISA de bloqueo y aunque la NT sigue siendo por definición la prueba estándar, si se ha establecido una buena correlación con un gran número de muestras homotípicas en un amplio espectro de títulos, estas versiones de ELISA podrían utilizarse como sustituto de la NT.²⁹

Los ELISA de unión para la determinación de IgM, IgG antipoliovirus en suero y de IgA en saliva son la versión más simple de este método. El término “unión” refleja el hecho de que estas pruebas miden anticuerpos con un amplio espectro de afinidades y que no correlacionan necesariamente bien con el ensayo funcional de NT que revela anticuerpos de alta afinidad. Esta discrepancia entre los resultados de la NT y las pruebas no funcionales (ELISA de unión) se conoce bien³⁰ y es por ello que la NT fue la prueba básica para la estimación de la inmunidad protectora del VPIc y del VPIs en el modelo murino. En este proyecto utilizamos ensayos de unión para la determinación de IgM e IgG en suero y de IgA en saliva como marcadores de inmunidad generada por la vacuna independientemente del espectro de afinidad. Fue importante porque los niveles y el curso de formación de tales marcadores reflejan las propiedades antigénicas de la vacuna. Las pruebas se basaron en técnicas clásicas de ELISA: variantes indirectas para la detección de IgM e IgG y técnica de captura, ELISA de captura-alfa para la detección de IgA. El ELISA indirecto empleó conjugados enzimáticos con cadenas mu o gamma específicas antiespecies, presentados en numerosas publicaciones. En nuestros estudios utilizamos el siguiente protocolo: el poliovirus se fijó a la fase sólida que tiene adherida la IgG policlonal antipoliovirus (de conejo), luego se agregan diluciones seriadas de la muestra de suero y los anticuerpos específicos se unen a los epitopes del virus fijado; en un paso posterior se agrega un conjugado de peroxidasa específico contra la cadena mu o gamma de ratón y el sustrato.^10,31 El ELISA de captura-alfa para la determinación de IgA antipoliovirus en saliva se basó en el método descrito para la IgA secretoria antipoliovirus en suero²⁷ y modificado por Ivanov y col.³² Es una técnica clásica de captura: la IgA en la muestra de saliva se une a la anti-IgA de ratón (específica contra la cadena alfa) que está fijada al pocillo; luego se agrega el poliovirus y posteriormente sigue la detección con la IgG policlonal antipoliovirus marcada con un conjugado de biotina-avidina-peroxidasa y el sustrato. La comparación del ELISA de captura-alfa con el ELISA-IgA (similar al ELISA IgG y al ELISA IgM descritos previamente) mostró que el ELISA de captura-alfa era el método más sensible.³² Este resultado era esperable porque según el diseño del método otros tipos de anticuerpos no interfieren con la detección de la IgA. Dicha ventaja del ELISA de captura-alfa es esencial cuando se prueban fluidos corporales complejos, como la saliva.

La valoración de la inmunidad de las mucosas frente a poliovirus (determinación de anticuerpos con capacidad de neutralización en muestras de saliva y heces) también puede realizarse mediante ensayos funcionales y símil funcionales –la NT y el ELISA de bloqueo o el radioinmunoensayo (RIA).^32-34 La presencia de anticuerpos neutralizantes (presuntamente de tipo IgA) en muestras de saliva y heces es la confirmación definitiva de inmunidad protectora de mucosas y sugiere una respuesta inmune adecuada frente a la vacuna polio. En la prueba de ratones transgénicos no utilizamos este abordaje a pesar de que se vio que brinda bastante información para las muestras de saliva y heces.^32-34 La determinación de anticuerpos neutralizantes en saliva de ratón podría ser una prueba válida y por lo tanto requiere consideraciones especiales.


Conclusión

Si bien la respuesta inmunológica al VPI en ratones puede diferir de la respuesta en seres humanos, los experimentos inmunológicos y de protección en ratones transgénicos y en otros animales son una parte importante de la evaluación comparativa de la VPI. Pueden poner de manifiesto diferencias inmunológicas entre los productos convencionales y los nuevos y estas diferencias podrían tener consecuencias en términos de eficacia de la vacuna en los seres humanos. Las propiedades similares de las vacunas en modelos animales podrían garantizar que el efecto en seres humanos será parecido. Asimismo, las diferencias reveladas en modelos animales pueden en teoría (aunque no necesariamente) reflejar diferente protección en seres humanos. En este caso debe evaluarse cuidadosamente la respuesta inmunológica frente a las vacunas viejas y nuevas en el hombre.

La prueba en ratón transgénico (de inmunización y provocación, avalada con métodos serológicos apropiados) para la determinación de la antigenicidad y de la protección de nuevas VPI se vio que es una herramienta eficaz en situaciones en las cuales los trabajos en personas son imposibles. Demostramos la utilidad de esta prueba en la evaluación de la VPIs de los tipos 1 y 2;^10,19 la evaluación del tercer tipo de VPIs está en marcha. Este método sustituto para predecir la eficacia de la vacuna consiste en tres partes principales: inmunización, provocación y evaluación serológica. La parte esencial, la provocación, brinda la información definitiva acerca del poder de protección de la vacuna y por lo tanto representa un verdadero estudio funcional. La evaluación serológica, además de determinar la presencia de anticuerpos neutralizantes, tiene importancia adicional porque los niveles de marcadores de inmunidad sérica y de mucosas, IgM, IgG e IgA demuestran las propiedades inmunológicas de la vacuna, independientemente del papel funcional del anticuerpo. En este estudio observamos una correlación entre la dosis del inóculo, el nivel de anticuerpos neutralizantes y el efecto protector y no encontramos dicha correlación en términos de marcadores serológicos y de mucosa (IgM, IgG, IgA). Por ende, el nivel de anticuerpos neutralizantes fue el principal marcador serológico que reflejó inmunidad protectora.^10,19 Este hecho sugiere bastante bien que la VPI es inductora de anticuerpos neutralizantes que protegen a los seres humanos contra la enfermedad.³⁵

Doi y col.⁵ informaron que el VPIs tipo 1 era inmunogénico en seres humanos, adultos y niños. Los autores también mostraron que en la prueba de eficacia rutinariamente usada en la actualidad en ratas, el VPIs y el VPIc son igualmente inductores de inmunidad: el título de anticuerpos neutralizantes fue similar después de la inmunización con el VPIc o con VPIs. Los resultados de nuestros experimentos en ratones transgénicos mostraron que la producción de anticuerpos neutralizantes en ratones transgénicos fue aproximadamente de la misma magnitud que la observada en ratas, con lo cual se confirman las observaciones de Doi y col.⁵ También encontramos que el VPIs tipo 1 protegió por completo a los ratones inmunizados contra la provocación letal con poliovirus salvaje. Esto último indicó que no había discrepancia entre el nivel de anticuerpos y su efecto protector en ratones.

Encontramos que el VPIs tipo 2 indujo niveles más bajos de anticuerpos neutralizantes y que fue menos protector que el VPIc contra la estimulación con el virus salvaje (cepa MEF-1). Los resultados confirmaron los hallazgos de Doi y col. en ratas y sugieren la necesidad de una mayor optimización del VPIs tipo 2.⁵ A diferencia del VPIs tipo 2, se vio que el sIPV tipo 1 tiene una inmunogenicidad y una capacidad de protección excelentes en ratones transgénicos.¹⁹

Por lo tanto, nuestros resultados en el modelo de ratón transgénico y los datos obtenidos por Doi y col. sugieren que el nivel de anticuerpos neutralizantes en los seres humanos podría utilizarse como una medición sustituta de la eficacia clínica del VPIs. El significado de los nuevos métodos propuestos va más allá de la evaluación del VPIs porque esta prueba también podría utilizarse en la evaluación de la eficacia de vacunas combinadas que tienen como componente el VPI.

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