Autor: Clara Isabel Marín Briggiler Columnista Experto de SIIC Institución: Instituto de Biología y Medicina Experimental, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) Artículos publicados por Clara Isabel Marín Briggiler

Conclusión breve
Los anticuerpos presentes en fluidos foliculares humanos con capacidad de alterar la funcionalidad espermática constituyen una herramienta para la identificación de proteínas involucradas en la interacción de los gametos.

Resumen

La presencia de anticuerpos antiespermáticos en diferentes fluidos biológicos puede afectar la interacción entre el espermatozoide y el ovocito y causar infertilidad. En trabajos previos de nuestro grupo se demostró que los fluidos foliculares de pacientes participantes de un programa de fecundación in vitro contienen inmunoglobulinas (IgGFF) con capacidad de alterar la función espermática, esto es, tanto inhibir la unión de los espermatozoides a la matriz extracelular del ovocito como inducir la liberación de las enzimas acrosomales (Marín Briggiler et al, Am J Reprod Immunol, 2003). El objetivo del presente estudio fue utilizar dichos anticuerpos para identificar proteínas espermáticas involucradas en la interacción de los gametos humanos. Se llevaron a cabo ensayos de Western immunoblotting en los que proteínas extraídas de espermatozoides humanos incubados en condiciones capacitantes fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida de una dimensión, transferidas a membranas de nitrocelulosa y expuestas a fluidos foliculares individuales y anticuerpos anti-IgG humana. Tres de las IgGFF capaces de alterar los eventos relacionados con la interacción de los gametos reconocieron proteínas espermáticas de 78 ± 1, 58 ± 2 y 15 ± 1 kDa. La caracterización bioquímica y molecular de estos polipéptidos permitirá confirmar su participación en la interacción espermatozoide-ovocito. Estos estudios contribuirían a dilucidar las bases moleculares del proceso de fecundación y conducirían a proponer métodos alternativos para el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad, así como nuevas estrategias para la regulación de la natalidad.

Palabras clave
proteínas espermáticas, anticuerpos antiespermáticos, interacción de gametas, reproducción humana, fluido folicular

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Especialidades
Principal: Inmunología, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Urología, 

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Clara I. Marín Briggiler, Instituto de Biología y Medicina Experimental, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), C1428ADN, Buenos Aires, Argentina

Patrocinio y reconocimiento
El estudio fue subsidiado con fondos de la Organización Mundial de la Salud (LID Grant # 97175), el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y la Agencia Nacional de Promoción de la Ciencia y Tecnología (PICT97, 00207) (Argentina).

USE OF NATURALLY OCCURRING ANTISPERM ANTIBODIES FOR THE IDENTIFICATION OF PROTEINS INVOLVED IN HUMAN GAMETE INTERACTION

Abstract
Presence of antisperm antibodies in biological fluids can alter sperm-egg interaction and cause infertility. Previous studies from our group have demonstrated that follicular fluids obtained from patients participating in an in vitro fertilization program contain immunoglobulins (FFIgG) with the ability to affect sperm function, i.e. to inhibit sperm binding to the egg extracellular matrix and/or to induce the release of acrosomal enzymes (Marín Briggiler et al, Am J Reprod Immunol, 2003). The objective of the present study was to use these antibodies to identify sperm proteins involved in human gamete interaction. Western immunoblot assays were carried out in which proteins extracted from human sperm previously incubated under capacitating conditions were separated by one dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membranes and exposed to individual follicular fluids and anti human IgG antibodies. Three of the FFIgG with the capacity of altering gamete interaction-related events recognized sperm proteins of 78 ± 1, 58 ± 2 and 15 ± 1 kDa. Biochemical and molecular characterization of these polypeptides will confirm their participation in sperm-egg interaction. These studies would contribute to elucidate the molecular basis of the fertilization process, and would lead to propose alternative methods for infertility diagnosis and treatment, as well as new strategies for fertility regulation.

Key words
sperm proteins, antisperm antibodies, gamete interaction, human reproduction, follicular fluid

Artículo completo
Introducción

La fecundación es un fenómeno complejo que involucra la interacción entre los gametos masculino y femenino. El espermatozoide, una célula sumamente especializada, es producida en el testículo, sufre un proceso de maduración durante su estadía en el epidídimo y completa la adquisición de su capacidad fecundante en el tracto femenino, mediante un proceso conocido como capacitación espermática. Una vez capacitado, el espermatozoide puede unirse a la matriz extracelular del ovocito o zona pelúcida (ZP), interacción que desencadena la exocitosis del contenido acrosomal (exocitosis acrosomal). La liberación de las enzimas acrosomales, junto con la movilidad hiperactivada, permiten que el espermatozoide penetre la ZP y se fusione con la membrana plasmática del ovocito u oolema.¹

El reconocimiento e interacción de los gametos se basa en la complementariedad de los componentes de la ZP y de las moléculas presentes en la membrana plasmática del espermatozoide. La unión espermatozoide-ZP es específica de especie y la exocitosis acrosomal se desencadena cuando ligandos de la matriz extracelular del ovocito provocan la agregación de receptores en el espermatozoide. A pesar de que numerosos estudios se orientaron a la caracterización de las moléculas espermáticas involucradas en estos eventos, aun no se determinó con certeza la identidad de éstas.² Se ha propuesto que en la superficie del espermatozoide podría existir un receptor de ZP multivalente (con más de un sitio activo), o varios sitios receptores, que contribuirían a la especificidad y complejidad en la interacción de los gametos.³

El proceso de fecundación puede ser afectado por la presencia de anticuerpos dirigidos contra antígenos espermáticos u ovocitarios. Estos anticuerpos (inmunoglobulinas de los tipos A, G y M) fueron detectados en el suero y en secreciones del tracto reproductor masculino (plasma seminal) y femenino (moco cervical, fluidos folicular y tubario). Se ha descrito que la infertilidad por causa inmunológica afecta de un 9% a un 36% de las parejas en consulta médica por dificultades para concebir.^4,5

Los anticuerpos antiespermáticos pueden interferir en la movilidad y en la penetración de los espermatozoides a través del moco cervical, así como afectar la interacción de los gametos y el desarrollo embrionario temprano.^6,7 Estudios previos de nuestro grupo indicaron que los fluidos foliculares (FF) provenientes de pacientes participantes de un programa de fecundación asistida contienen inmunoglobulinas de tipo G (IgG) capaces de inducir la exocitosis acrosomal de los espermatozoides humanos;⁸ un análisis individual permitió identificar fluidos con IgG que, además de desencadenar la exocitosis del acrosoma, inhiben la unión de los espermatozoides a la ZP.⁹ Teniendo en cuenta el efecto de estos anticuerpos sobre la funcionalidad del espermatozoide, es posible proponer que éstos estén dirigidos contra entidades espermáticas que participan en la interacción con el ovocito. El objetivo del presente trabajo fue utilizar estas IgG del FF como herramientas para avanzar en la identificación de proteínas espermáticas involucradas en eventos tempranos de la fecundación humana.


Materiales y métodos

Las muestras de semen humano utilizadas en el presente estudio fueron obtenidas con el consentimiento informado de los donantes y el protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica (Buenos Aires, Argentina).


Obtención y procesamiento de las muestras de semen

Las muestras de semen fueron obtenidas de donantes voluntarios, luego de 2 a 5 días de abstinencia sexual. Dentro de la primera hora de obtención de las muestras se determinaron los parámetros seminales de acuerdo con los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud.¹⁰ Sólo se utilizaron las muestras de semen que presentaron una concentración de 20 x 10⁶ espermatozoides/ml o mayor, con más de 50% de espermatozoides con movilidad progresiva, un porcentaje de formas normales mayor del 14% y que carecían de anticuerpos antiespermáticos, según el análisis por el ensayo de Immunobeads directo.¹⁰

Los espermatozoides móviles fueron seleccionados por filtración por columnas de lana de vidrio y la capacitación espermática se llevó a cabo por incubación a 37°C, durante 6 h en medio HSM suplementado con 26 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.).¹¹ Luego de esta incubación, se determinó el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva, descartándose aquellas muestras que presentaban menos de 75% de células móviles.


Obtención y preparación del fluido folicular humano

Las muestras de fluido folicular se obtuvieron de pacientes participantes en un programa de fecundación in vitro (Centro Médico Fertilab, Buenos Aires), sin realizar una selección previa de acuerdo con la causa de infertilidad.

El desarrollo folicular múltiple se obtuvo utilizando un protocolo largo de inducción con análogos de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH, LUPRON, Lab. Abbot) y gonadotrofinas recombinantes (GONAL, Serono, Buenos Aires, Argentina).¹² Los folículos fueron aspirados mediante ecográfica transvaginal; los complejos cumulus oophorus-ovocito fueron transferidos a cápsulas de cultivo y los fluidos foliculares correspondientes a cada paciente fueron centrifugados durante 15 min a 1500 xg para eliminar los restos celulares, calentados a 56°C, filtrados y posteriormente almacenados a -20°C hasta su utilización.


Extracción, separación electroforética y electrotransferencia de las proteínas espermáticas

Los espermatozoides, luego de la incubación en condiciones que promueven la capacitación, fueron lavados 2 veces con buffer fosfato salino (PBS; pH 7.4), conteniendo p-aminobenzamidina 1 mM y resuspendidos en buffer de extracción (Tritón X-100 1% y desoxicolato de Na⁺ 1% en PBS suplementado con inhibidores de proteasas: p-aminobenzamidina 2 mM, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) 1 mM, aprotinina 10 μg/ml y leupeptina 10 μg/ml). La extracción proteica se llevó a cabo por incubación en hielo durante 2 h con agitación; posteriormente las muestras se trataron con ultrasonido durante 10 min y se centrifugaron a 6 000 xg por 5 min.¹³ Los sobrenadantes fueron suplementados con buffer “muestra” de Laemmli 4x y fueron calentados a 100(C en presencia de beta-mercaptoetanol 70 mM durante 5 min.¹⁴ Después de una centrifugación, los sobrenadantes fueron guardados a -20(C hasta su uso. Los extractos proteicos provenientes de 7 donantes diferentes fueron mezclados y sometidos a separación electroforética.

Se utilizaron geles preparativos de poliacrilamida al 10% y SDS 0.1%, preparados siguiendo la técnica de Laemmli.¹⁴ Se sembraron alícuotas de los extractos proteicos correspondientes a 300 x 10⁶ espermatozoides, paralelamente con los estándares de peso molecular (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.) y la corrida electroforética se realizó a corriente constante (25 mA por gel). La transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa fue realizada de acuerdo con el método de Towbin y col.,¹⁵ a un voltaje constante de 35 V, por 18 h a 4(C. Las membranas fueron teñidas con rojo Ponceau (2 mg/ml en ácido acético 0.5%) hasta obtener la coloración deseada y posteriormente fueron cortadas en secciones a lo largo del sentido del desarrollo de la electroforesis.


Inmunodetección

Los sitios de unión no específicos de la membrana de nitrocelulosa fueron bloqueados por incubación con leche descremada 5% en PBS-Tween 20 0.1% durante 1 h. Posteriormente, cada sección de nitrocelulosa fue incubada con los fluidos foliculares individuales (diluidos 1:25 en solución de bloqueo), durante toda la noche a 4ºC. Luego de 4 lavados de 5 min con PBS-Tween 20 0.1%, se agregó el segundo anticuerpo (anti-IgG humana desarrollado en conejo, unido a peroxidasa, Sigma Chemical Co.) diluido 1:5 000, incubándose por 1 h. La nitrocelulosa se lavó como se indicó anteriormente y las bandas reactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia (ECL kit, Amersham Life Science Inc., Oakville, ON, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente.

La determinación de los pesos moleculares aparentes se llevó a cabo mediante interpolación en la recta obtenida por regresión lineal, utilizando los valores de movilidad electroforética en función del peso molecular de los estándares de proteínas.


Resultados

En un estudio anterior, nuestro grupo describió que inmunoglobulinas presentes en los fluidos foliculares (IgGFF) de pacientes en tratamiento por infertilidad son capaces de inducir la exocitosis acrosomal en espermatozoides humanos; en el mismo estudio se determinó que cuando las incubaciones se realizaron en condiciones que previenen la inducción de la exocitosis acrosomal (en medio de capacitación conteniendo iones Sr²⁺ en reemplazo de iones Ca²⁺),¹¹ la presencia de estas inmunoglobulinas conducía una disminución en la capacidad de los espermatozoides de unirse a la ZP homóloga.⁹ Estos resultados indicarían que algunas IgGFF son capaces de reconocer y producir la agregación de receptores espermáticos para la ZP, y por lo tanto, se constituyen en herramientas valiosas para la identificación y caracterización de entidades espermáticas que participan en la interacción de los gametos humanos.

En el presente estudio se llevaron a cabo ensayos de Western immunoblotting a fin de identificar las proteínas espermáticas reconocidas por las IgGFF analizadas en el trabajo anterior. Los extractos de proteínas se prepararon utilizando espermatozoides incubados en condiciones que promueven la capacitación. Los componentes proteicos extraídos fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida, seguida de electrotransferencia e inmunorrevelado con FF individuales conteniendo IgG previamente seleccionados por su alta capacidad de inducir la exocitosis acrosomal, que inhiben o no afectan la unión de los espermatozoides a la ZP (clasificadas como Grupo III).⁹ Como control se utilizaron FF con IgG con capacidad baja o nula de provocar la liberación de las enzimas acrosomales, que no bloquean la interacción de los gametos (Grupo I).⁹ En los ensayos se incluyeron 6 fluidos del Grupo III y 7 del Grupo I, seleccionados al azar.

El análisis del patrón de bandas mostró que cada inmunoglobulina elegida reconoció de manera específica entre 5 y 10 proteínas espermáticas con peso molecular aparente (PM) entre 130 y 11 kDa (figura 1, tabla I). A fin de identificar las proteínas detectadas por las IgGFF con capacidad de afectar la funcionalidad espermática se siguieron varias estrategias de análisis. En una de ellas se procedió a la búsqueda de bandas inmunorreactivas para alguna de las IgGFF del Grupo III que no estuvieran presentes en los perfiles inmunorrevelados con IgGFF del Grupo I; en este caso, se discriminó entre las IgGFF del Grupo III con capacidad de inducir la exocitosis acrosomal e inhibir la unión de los espermatozoides a la ZP (IgGFF # 7, 14, 26 y 28) y las IgGFF del Grupo III sólo inductoras de la exocitosis acrosomal (IgGFF # 25 y 32). Como resultado de esta búsqueda se identificaron tres bandas inmunorreactivas específicas: una de 78 ± 1 kDa, reconocida por la IgGFF # 7, una de 15 ± 1 kDa, reconocida por la IgGFF # 26 y una de 58 ± 2 kDa, detectada por la IgGFF # 32. Estas proteínas no fueron reactivas con otras de las IgGFF evaluadas (figura 1 y tabla I).

Figura 1. Proteínas espermáticas reconocidas por inmunoglobulinas del fluido folicular. Los espermatozoides móviles fueron incubados en condiciones que promueven la capacitación por 6 h, en medio HSM, y las proteínas fueron extraídas utilizando un buffer con detergentes. Se realizaron geles preparativos (desnaturalizantes) y se sembró una alícuota del extracto correspondiente a 300 x 10⁶ espermatozoides. Luego de la transferencia, la membrana de nitrocelulosa fue dividida en secciones a lo largo del sentido del desarrollo de la electroforesis, que fueron incubadas con los fluidos foliculares individuales como primer anticuerpo y anti-IgG humana como segundo anticuerpo. Como control, una sección fue incubada solamente con segundo anticuerpo (2do). Los marcadores de peso molecular (x 10^-3) se indican en el margen izquierdo de la figura. Se muestran los resultados de un experimento típico. El ensayo fue repetido tres veces obteniéndose resultados similares. Los asteriscos indican bandas reconocidas selectivamente por IgGFF del Grupo III (con alta capacidad de inducir la exocitosis acrosomal).⁹

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