NEW MICROBIOLOGICAL MARKERS OF HEPATITIS C

Abstract
Hepatitis C is a serious public health problem because it infects 2% of world population. The new microbiological tools based on molecular biology are very useful to diagnose, prevent and treat this disease. This review shows the progress in these technologies, focusing in the importance of genotypes and viral quasispecies, as well as in the importance of the study of Ag of core and RNA detection. It also deals with the utility of the secuenciation in drugs resistance detection and virus epidemiology.

Key words
hepatitis C, diagnosis, molecular tools, secuenciation

Artículo completo
Introducción

Según la Organización Mundial de la Salud, la hepatitis C afecta al 2% de la población mundial, aunque la distribución no es uniforme en función de la geografía; así, mientras que en Europa y en América se calcula que entre el 1% y el 1.9% de sus habitantes están infectados, en algunos países de Africa, este porcentaje se eleva al 9% de la población.¹

La aplicación, análisis e interpretación de los resultados aportados por las nuevas técnicas microbiológicas es una de las líneas de investigación más importantes que actualmente se llevan a cabo para el mejor conocimiento de la infección humana por el virus de la hepatitis C (VHC). La aplicación en este campo de las nuevas herramientas de la biología molecular proporciona datos útiles en el diagnóstico, tratamiento y control de este patógeno y en esta revisión pretendemos realizar una actualización de los datos más novedosos sobre este tema.


Genotipos de la hepatitis C

La prevalencia de los diferentes genotipos del VHC depende del área geográfica, los genotipos 1a y 1b son los más prevalentes en Estados Unidos y en buena parte de Europa, mientras que el genotipo 2 es infrecuente en España. El genotipo 4 fue identificado en EE.UU., Oriente Medio y Africa,² y los genotipos 5 y 6 en Sudáfrica y en Hong Kong, respectivamente³. En Iberoamérica, el genotipo 1 es el más prevalente; así, en Brasil el genotipo 1 es el responsable de la infección de más del 50% de los casos, mientras que el genotipo 3 ocupa el segundo lugar, con menos de 40% de los casos.^4-6 La prevalencia del genotipo 1 es aun más alta en Chile, ya que se sabe que el 1b infecta al 82% de los pacientes.⁷

La distribución de los genotipos en una población es un fenómeno complejo y dinámico a lo largo del tiempo. Un estudio realizado durante 13 años en Francia muestra que los genotipos más frecuentes son el 1b (30.2%), 1a (27.7%) y 3a (22.4%), y que los genotipos 1a, 1b, 3a y 4a presentan un perfil epidémico con un gran número de aislamientos por subtipo, mientras que los del tipo 2 presentan un perfil endémico con muchos subtipos y pocos aislamientos de cada uno.⁸ Además, a lo largo del estudio, el perfil cambió radicalmente influido por la etiología de la infección; se observa la aparición de nuevos subtipos epidémicos asociados al uso de drogas por vía parenteral (1a y 3) y la desaparición de los tipos asociados a transfusiones de sangre y a infección nosocomial (1b y 2).⁸

Además, al estudiar la región 5’UTR (untranslated region), muy conservada, se encontraron diferencias entre los virus presentes en plasma y en leucocitos de sangre periférica de algunos pacientes (9%); así, el genotipo detectado en leucocitos no está presente en el plasma y, en algunos casos, tampoco en el hígado; este fenómeno puede deberse a sobreinfecciones.⁹

La presencia de un determinado genotipo tiene gran importancia clínica, ya que un análisis de 6 807 pacientes mostró que los hombres presentan mayor carga viral respecto de las mujeres, al igual que los infectados por el genotipo 1 respecto de los infectados por los genotipos 2 y 31.¹⁰ Por otra parte, se comprobó que los pacientes infectados por el genotipo 4 tienen una carga viral menor que los infectados con el resto de los genotipos,^11,12 mientras que sucede lo contrario con los enfermos del genotipo 3a. También se comunicó que los pacientes coinfectados por el VIH presentan mayor carga viral en todos los genotipos y mayor riesgo de progresión a mortalidad asociada al sida, sobre todo los enfermos infectados por más de un genotipo.^13-15

También se asocian el genotipo y el período de ventana; en donantes de sangre se describe este fenómeno en 18.5 casos por millón, aunque es mucho más frecuente en enfermos infectados por los genotipos 4 y 3a, al contrario de lo que sucede en los infectados por el subtipo 1b.¹⁶

Es bien sabido que algunos genotipos responden mejor a los tratamientos, aunque se desconoce la causa de este fenómeno se postuló la implicación de la respuesta específica de células T frente a NS3 como un fenómeno asociado a una eliminación más rápida del ARN viral.¹⁷

Para la determinación de este parámetro existen distintas metodologías con diversa sensibilidad (entre 64.3% y 100%) y especificidad (entre 42.7% y 85.7%). Las técnicas más novedosas se basan en la secuenciación de las regiones NS5b y 5’ NC; la espectrometría de masas, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real y la metodología denominada HMA (heteroduplex mobility análisis).^13,18-20


Detección del antígeno del core viral

Recientemente se desarrolló la detección del antígeno del core viral en el suero de los pacientes con infección por VHC.¹⁸ Esta técnica se muestra útil en el cribado de los pacientes y en la detección de casos de primoinfección en ausencia de anticuerpos,^19,20 con elevada sensibilidad (97%) y especificidad (100%) y una buena correlación con la PCR.^21,22

También se utiliza con éxito para predecir la respuesta al tratamiento antiviral; en la detección de pacientes sin respuesta al tratamiento presenta un valor predictivo negativo del 75% a la semana 4 y un valor del 100% a la semana 12.^23,24

Hay correlación entre los valores de este marcador y el ARN viral. Así, 9 900 UI/ml corresponden a 1 pg/ml de antígeno del core viral. Se descubre la presencia del antígeno en el 92% de los enfermos con ARN viral detectable por PCR > 600 UI/ml, siendo casi siempre positivo si la carga viral es mayor de 20 000 UI/ml.²⁵ Sin embargo, también se ha descrito la falta de correlación en algunos pacientes, lo que puede estar asociado a la existencia de partículas virales sin genoma; estas partículas están en enfermos con respuesta bioquímica prolongada.²⁶

Un metaanálisis muestra que esta técnica, al igual que la PCR, identifica la presencia de infección más tempranamente que la detección de anticuerpos (entre 40 y 50 días), tiene utilidad en la monitorización del tratamiento independientemente del genotipo viral, pero debido a la menor sensibilidad que la PCR presenta limitaciones a la hora de determinar la respuesta viral sostenida.²⁷

Los nuevos métodos serológicos que realizan detecciones simultáneas de anticuerpos y antígenos son muy útiles a la hora de diagnosticar las infecciones agudas, ya que disminuyen el período de ventana y pueden ser una alternativa a la PCR.²⁸


Técnicas de amplificación genómica

Mediante esta metodología se observó que para cada genotipo existen pacientes con respuesta rápida y con respuesta lenta. Los primeros presentan una mayor caída de la carga viral en la cuarta semana postratamiento y responden mejor a la terapia.²⁹

Los pacientes con respuesta rápida presentan una disminución del ARN viral de 3 log₁₀ durante la primera semana, mientras que la no disminución a la semana 12 se asocia con falta de respuesta.³⁰

También es muy útil en el diagnóstico de la infección de algunos pacientes, por ejemplo en los enfermos hemodializados con síndrome de malnutrición-inflamación y caquexia, en los que se vio que en muchas ocasiones no se detecta la presencia de anticuerpos.³¹ En general, en los pacientes hemodializados, la seroconversión puede retrasarse de 3 a 16 meses.³²

Tras la infección se produce un crecimiento exponencial del número de virus, doblándose la carga viral cada 10.8 horas. Como media, puede detectarse viremia intermitente durante los primeros 56 días, observándose un incremento de la viremia en la etapa previa a la seroconversión.³³

Recientemente se describió el fenómeno de la hepatitis C oculta, caracterizada por la existencia de ARN viral en hígado en ausencia de anticuerpos y ARN viral en suero; más del 70% de los pacientes presentan ARN viral en células mononucleares de sangre periférica. Estos pacientes podrían ser potencialmente infecciosos, por lo que se deben modificar las técnicas actuales para su correcta detección.³⁴


Reactividad específica de las células T

Este nuevo marcador ayuda a diferenciar subgrupos dentro del mismo genotipo, ya que sólo los considerados como de respuesta rápida presentan un incremento de este marcador después de la pérdida de la viremia.²⁹


Desarrollo de chips proteicos

Esta nueva metodología permite determinar simultáneamente la presencia de diferentes anticuerpos. Los primeros estudios muestra mayor sensibilidad y especificidad que el ELISA y sus datos son concordantes con los aportados por el RIBA, considerada la técnica de referencia.³⁵


Detección de anticuerpos en saliva

Existen estudios que demuestran que la detección de anticuerpos en saliva tiene buena sensibilidad si el paciente presenta carga viral positiva en suero.³⁶


Detección de resistencias a fármacos

Se están desarrollando marcadores microbiológicos que tratan de predecir la respuesta a los tratamientos antirretrovirales. Los métodos de secuenciación son los más empleados y hasta el momento los datos más importantes son:

- Los enfermos con buena respuesta presentan más mutaciones en la región V3 de NS5A.³⁷

- La mutación en la región no estructural de la proteasa 3/4ª limita el reconocimiento de los virus por los leucocitos, escapando de la acción citotóxica de los linfocitos T y provocando persistencia viral.³⁸

La secuenciación de la región NS5B, que codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN, revela que mutaciones en las posiciones 300-358 tienen lugar más frecuentemente en enfermos con respuesta sostenida, sobre todo en los aminoácidos 309, 333, 338 y 355.³⁹

El análisis del genoma completo de virus con genotipo 2b muestra que el porcentaje de aminoácidos sustituidos es mayor en los enfermos con respuesta, sobre todo en NS4A.⁴⁰

Varias publicaciones y un metaanálisis indican que las mutaciones en la región ISDR (interferon sensitivity-determining region) de la región no estructural 5A (NS5A) se correlaciona con la respuesta a este compuesto, asociándose a la supresión de la replicación viral y a la protección del hepatocito de la apoptosis.^41-44


Descenso de la metaloproteína de matriz 9 (MM-9)

Se observó que los niveles de esta proteína vírica descienden al final del tratamiento si el paciente presenta respuesta virológica sostenida, tanto en suero como en el hígado, mientras que se mantienen en aquellos sin respuesta.⁴⁵


Quasiespecies

La infección por este virus puede iniciarse a partir de múltiples partículas infecciosas con componente genético heterogéneo (en un tercio de los pacientes) o a partir de una única partícula que conduce a una infección clonal inicial.²⁶ Además de este fenómeno, por las características propias del virus se produce una diversidad genética a lo largo del tiempo.

Esta diversidad genética ya es conocida a través de los múltiples tipos y subtipos descritos, pero recientemente se desarrollaron métodos microbiológicos capaces de estudiar variaciones más sutiles dentro del virus, denominadas cuasiespecies. Este hecho tiene una importante repercusión a la hora de estudiar la resistencia viral a los fármacos, ya que un estudio muestra que al analizar la región NS5A mediante secuenciación se observa que, antes del tratamiento, la complejidad y diversidad de cuasiespecies es menor en aislamientos de pacientes con buena respuesta, sobre todo en el dominio V3. Estas diferencias se hacen mayores durante el tratamiento, ya que la diversidad tiende a incrementarse en los pacientes sin respuesta, mientras que disminuye en los que respondedn.^46,47


Epidemiología molecular

El desarrollo de métodos microbiológicos capaces de comparar los genomas víricos entre sí aporta herramientas que ayudan a conocer la transmisión, basadas principalmente en la secuenciación de diversas regiones del genoma vírico.⁴⁸ Se ha intorducido en el mercado un producto que analiza la región NS5b (Trugene NS5b HCV), con buenos resultados.⁴⁹


Futuro

En los últimos años se avanzó mucho en el estudio microbiológico del virus de la hepatitis C, aunque quedan aún muchos retos. El mejor diagnóstico de la enfermedad y el desarrollo de pruebas microbiológicas que puedan predecir la respuesta al tratamiento son probablemente las dos necesidades más acuciantes. Para avanzar en este camino se están realizado importantes esfuerzos; cabe destacar la creación de grandes bases de datos internacionales en las que los diversos investigadores depositan las secuencias de muchos miles de virus. Así, hay depositadas más de 30 000 secuencias en las bases DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL) and GenBank.^50-51

Bibliografía del artículo
1. Shepard CW, Finelli L, Alter MJ. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis 2005; 5:558-567.
2. Sánchez Quijano A, Abad MA, Torronteras R, y col. Unexpected high prevalence of hepatitis C virus genotype 4 in Southern Spain. J Hepatol 1997; 27:25-29.
3. Cha TA, Beall B, Irvine J, y col. At least five related, but distinct, hepatitis C viral genotypes exist. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:7144-7148.
4. Silva GF, Nishimura NF, Coelho KI, Soares EC. Grading and staging chronic hepatitis C and its relation to genotypes and epidemiological factors in Brazilian blood donors. Braz J Infect Dis 2005; 9:142-149.
5. Focaccia R, Baraldo DC, Ferraz ML. Demographic and anthropometrical analysis and genotype distribution of chronic hepatitis C patients treated in public and private reference centers in Brazil. Braz J Infect Dis 2004; 8:348-355.
6. Amorim RM, Oliveira CP, Wyant PS, y col. Hepatitis C virus genotypes in blood donors from the Federal District, Central Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99:895-897.
7. Soza A, Arrese M, González R, y col. Clinical and epidemiological features of 147 Chilean patients with chronic hepatitis C. Ann Hepatol 2004; 3:146-151.
8. Cantaloube JF, Gallian P, Attoui H, Biagini P, De Micco P, De Lamballerie X. Genotype distribution and molecular epidemiology of hepatitis C virus in blood donors from southeast France. J Clin Microbiol 2005; 43:3624-3629.
9. Roque Afonso AM, Ducoulombier D, Di Liberto G, y col. Compartmentalization of hepatitis C virus genotypes between plasma and peripheral blood mononuclear cells. J Virol 2005; 79:6349-6357.
10. Blatt LM, Mutchnick MG, Tong MJ y col. Assessment of hepatitis C virus RNA and genotype from 6807 patients with chronic hepatitis C in the United States. J Viral Hepat 2000; 7:196-202.
11. Smith DB, Davidson F, Yap P, y col. International HCV Collaborative Study Group. Levels of hepatitis C virus in blood donors infected with different viral genotypes. J Infect Dis 1996; 173:727-730.
12. Lau JY, Davis GL, Prescott LE, y col. Distribution of hepatitis C virus genotypes determined by line probe assay in patients with chronic hepatitis C seen at tertiary referral centers in the United States. Hepatitis Interventional Therapy Group. Ann Intern Med 1996; 124:868-876.
13. Margraf RL, Erali M, Liew M, Wittwer CT. Genotyping hepatitis C virus by heteroduplex mobility analysis using temperature gradient capillary electrophoresis. J Clin Microbiol 2004; 42:4545-4551.
14. Bonacini M, Govindarajan S, Blatt LM, Schmid P, Conrad A, Lindsay KL et al. Patients co-infected with human immunodeficiency virus and hepatitis C virus demonstrate higher levels of hepatic HCV RNA. J Viral Hepat 1999; 6:203-8.
15. Yoo TW, Donfield S, Lail A, Lynn HS, Daar ES. Hemophilia growth and development study. Effect of hepatitis C virus (HCV) genotype on HCV and HIV-1 disease. J Infect Dis 2005; 191:4-10.
16. Van Asten L, Prins M. Infection with concurrent multiple hepatitis C virus genotypes is associated with faster HIV disease progression. AIDS 2004; 18:2319-2324.
17. Hultgren C, Desombere I, Leroux-Roels G, y col. Evidence for a relation between the viral load and genotype and hepatitis C virus-specific T cell responses. J Hepatol 2004; 40:971-978.
18. Rolfe KJ, Alexander GJ, Wreghitt TG, Parmar S, Jalal H, Curran MD. A real-time Taqman method for hepatitis C virus genotyping. J Clin Virol 2005; 11.
19. Laperche S, Lunel F, Izopet J, y col. Comparison of hepatitis C virus NS5b and 5' noncoding gene sequencing methods in a multicenter study. J Clin Microbiol 2005; 43:733-739.
20. Zekri AR, El-Din HM, Bahnassy AA, y col. TRUGENE sequencing versus INNO-LiPA for sub-genotyping of HCV genotype-4. J Med Virol 2005; 75:412-420.
21. Lagging LM, García CE, Westin J, y col. Comparison of serum hepatitis C virus RNA and core antigen concentrations and determination of whether levels are associated with liver histology or affected by specimen storage time. J Clin Microbiol 2002; 40:4224-4229.
22. Gaudy C, Thevenas C, Tichet J, Mariotte N, Goudeau A, Dubois F. Usefulness of the hepatitis C virus core antigen assay for screening of a population undergoing routine medical checkup. J Clin Microbiol 2005; 43:1722-1726.
23. Gonzalez V, Padilla E, Diago M, y col. Clinical usefulness of total hepatitis C virus core antigen quantification to monitor the response to treatment with peginterferon alpha-2a plus ribavirin. J Viral Hepat 2005; 12:481-487.
24. Enomoto M, Nishiguchi S, Tamori A, y col. Chemiluminescence enzyme immunoassay for monitoring hepatitis C virus core protein during interferon-alpha2b and ribavirin therapy in patients with genotype 1 and high viral loads. J Med Virol 2005; 77:77-82.
25. Massaguer A, Forns X, Costa J, y col. Performance of hepatitis C virus core antigen immunoassay in monitoring viral load after liver transplantation. Transplantation 2005; 79:1441-1444.
26. Herring BL, Tsui R, Peddada L, Busch M, Delwart EL. Wide range of quasispecies diversity during primary hepatitis C virus infection. J Virol 2005; 79:4340-4346.
27. Seme K, Poljak M, Babic DZ, Mocilnik T, Vince A. The role of core antigen detection in management of hepatitis C: a critical review. J Clin Virol 2005; 32:92-101.
28. Laperche S, Le Marrec N, Girault A, y col. Simultaneous detection of hepatitis C virus (HCV) core antigen and anti-HCV antibodies improves the early detection of HCV infection. J Clin Microbiol 2005; 43:3877-3883.
29. Tang KH, Herrmann E, Cooksley H, y col. Relationship between early HCV kinetics and T-cell reactivity in chronic hepatitis C genotype 1 during peginterferon and ribavirin therapy. J Hepatol 2005 Aug 31; [Epub ahead of print].
30. Carlsson T, Reichard O, Norkrans G, y col. Hepatitis C virus RNA kinetics during the initial 12 weeks treatment with pegylated interferon-alpha 2a and ribavirin according to virological response. J Viral Hepat 2005; 12:473-480.
31. Kalantar-Zadeh K, Miller LG, Daar ES. Diagnostic discordance for hepatitis C virus infection in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2005; 46:290-300.
32. Schroeter M, Zoellner B, Polywka S, Laufs R, Feucht HH. Prolonged time until seroconversion among hemodialysis patients: the need for HCV PCR. Intervirology 2005; 48:213-215.
33. Glynn SA, Wright DJ, Kleinman SH, y col. Dynamics of viremia in early hepatitis C virus infection. Transfusion 2005; 45:994-1002.
34. Castillo I, Rodriguez-Inigo E, Bartolome J, y col. Hepatitis C virus replicates in peripheral blood mononuclear cells of patients with occult hepatitis C virus infection. Gut 2005; 54:682-685.
35. Zhang W, Huang J, Zhou MF, y col. Protein chip for detection of different HCV antibodies: preparation, quality control, and clinical evaluation. Mol Diagn 2005; 9:81-87.
36. De Cock L, Hutse V, Vranckx R. Correlation between detection of antibodies against hepatitis C virus in oral fluid and hepatitis C virus RNA in serum. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005 Aug 19; [Epub ahead of print].
37. Layden-Almer JE, Kuiken C, Ribeiro RM, y col. Hepatitis C virus genotype 1a NS5A pretreatment sequence variation and viral kinetics in African American and white patients. J Infect Dis 2005; 192:1078-1087.
38. Soderholm J, Ahlen G, Kaul A, y col. Relation between viral fitness and immune escape within the hepatitis C virus protease. Gut. 2005 Aug 16; [Epub ahead of print].
39. Hamano K, Sakamoto N, Enomoto N, y col. Mutations in the NS5B region of the hepatitis C virus genome correlate with clinical outcomes of interferon-alpha plus ribavirin combination therapy. J Gastroenterol Hepatol 2005; 20:1401-1409.
40. Tanabe Y, Nagayama K, Enomoto N, y col. Characteristic sequence changes of hepatitis C virus genotype 2b associated with sustained biochemical response to IFN therapy. J Viral Hepat 2005; 12:251-261.
41. Yoshioka K, Ito H, Watanabe K, y col. Interferon sensitivity-determining region of nonstructural region 5A of hepatitis C virus genotype 1b correlates with serum alanine aminotransferase levels in chronic infection. J Viral Hepat 2005; 12:139-145.
42. Watanabe K, Yoshioka K, Yano M, y col. Mutations in the nonstructural region 5B of hepatitis C virus genotype 1b: their relation to viral load, response to interferon, and the nonstructural region 5A. J Med Virol 2005; 75:504-512. 43. Pascu M, Martus P, Hohne M, y col. Sustained virological response in hepatitis C virus type 1b infected patients is predicted by the number of mutations within the NS5A-ISDR: a meta-analysis focused on geographical differences. Gut 2004; 53:1345-1351.
44. Schuttler CG, Thomas C, Discher T, Friese G, Lohmeyer J, Schuster R, Schaefer S, Gerlich WH. Variable ratio of hepatitis C virus RNA to viral core antigen in patient sera. J Clin Microbiol 2004; 42(5):1977-81.
45. Marinosci F, Bergamini C, Fransvea E, y col. Clinical role of serum and tissue matrix metalloprotease-9 expression in chronic HCV patients treated with pegylated IFN-alpha2b and ribavirin. J Interferon Cytokine Res 2005; 25:453-458.
46. Krekulova L, Rehak V, Riley LW. Hepatitis C virus (HCV) 5'NC sequence variants and their association with hepatitis C risk groups. J Clin Virol 2005; 32:300-304.
47. Chambers TJ, Fan X, Droll DA, y col. Quasispecies heterogeneity within the E1/E2 region as a pretreatment variable during pegylated interferon therapy of chronic hepatitis C virus infection. J Virol 2005; 79:3071-3083.
48. Bracho MA, Gosalbes MJ, Blasco D, Moya A, Gonzalez-Candelas F. Molecular epidemiology of a hepatitis C virus outbreak in a hemodialysis unit. J Clin Microbiol 2005; 43:2750-2755.
49. Othman SB, Trabelsi A, Monnet A, y col. Evaluation of a prototype HCV NS5b assay for typing strains of hepatitis C virus isolated from Tunisian haemodialysis patients. J Virol Methods 2004; 119:177-181.
50. Combet C, Penin F, Geourjon C, Deleage G. HCVDB: hepatitis C virus sequences database. Appl Bioinformatics 2004; 3:237-240.
51. Kuiken C, Yusim K, Boykin L, Richardson R. The Los Alamos hepatitis C sequence database. Bioinformatics 2005; 21:379-384.