HETEROGENEOUS DISTRIBUTION OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS TYPE 16 IN GUARANI POPULATIONS IN MISIONES, ARGENTINA, WITH DIFFERENT GRADE OF CERVIX LESIONS

Abstract
Human papillomavirus (HPV) infection of the cervix is necessary but not sufficient for the onset of oncogenic mechanisms leading to cervical cancer. Cofactors from the host and environment are also necessary. As part of viral factors, some HPV16 molecular variants present different biological behaviors. These minor genomic variations affect viral assembly, transcriptional activity and oncogenic potential. It has become important the analysis of their presence in different human populations and potential association to cervical lesions. In this study, HPV16 class and sub-class variants infecting Guarani aboriginals with different degree of cervical lesions from two different regions of Misiones, Argentina have been determined for the first time. A heterogeneous geographical distribution was observed, having 74% of European variants and 26% of other origins, mainly African, in the northern region. Meanwhile, 100% of European variants were present in the central region. This particular situation is discussed from the phylogenetic point of view. No statistical significant association was detected between any particular HPV16 variant and grade of cervical lesions.

Key words
HPV, variants, Guaraníes

Artículo completo
Introducción
El carcinoma de cuello uterino representa la primera causa de mortalidad por neoplasia entre mujeres residentes de la Provincia de Misiones. Esta situación difiere de la de los principales centros urbanos argentinos en donde el cáncer de mama lidera las estadísticas.¹
El carcinoma de cuello uterino se desarrolla generalmente mediante un proceso continuo que progresa gradualmente desde lesiones precursoras leves a grados más graves e invasivos. La infección genital por ciertos tipos de virus papiloma humano (HPV), llamados de alto riesgo, es necesaria aunque no suficiente para que se inicie este proceso. Otros factores asociados al huésped y al ambiente (inicio temprano de relaciones, número de parejas, multiparidad, tabaquismo) son también necesarios para que se establezca la progresión hacia la malignidad.²
La infección genital por HPV es muy prevalente y tiene lugar al inicio de las relaciones sexuales, siendo inocua en la gran mayoría de los casos. En sólo un 5% a un 8% de aquellas que cursan con un tipo viral de alto riesgo se verifican los procesos conducentes al cáncer. Aun así, la mayoría de las lesiones leves y moderadas regresan a la normalidad.³ Debido a esta situación, se requieren parámetros biológicos que oficien de marcadores pronósticos de progresión de lesiones. De contar con ellos sería factible la subclasificación de poblaciones con características de alto riesgo.
El estudio de la distribución de HPV en diversas poblaciones ha cobrado importancia debido a que la protección inmunológica provista por las vacunas profilácticas en experimentación presenta especificidad de tipo, necesitándose por ende el desarrollo de vacunas polivalentes a los efectos de lograr una protección efectiva de la población en riesgo.⁴ Esta situación impulsó a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a propiciar estudios de prevalencia de infección por HPV del tracto genital femenino en distintas regiones del mundo para guiar así la inmunoprevención y estimar su posible impacto sobre la incidencia del carcinoma de cuello uterino. En este contexto, la primera generación de vacunas no eliminaría la necesidad de continuar con los programas masivos de tamizaje, dado que incluirían un número limitado de tipos virales de alto riesgo. Pero a medida que se circunscriban los principales tipos virales oncogénicos circulantes a regiones geográficas definidas, la efectividad de las fórmulas vacunales a desarrollarse propiciarán una cobertura cada vez más efectiva.
La presencia de HPV de alto riesgo (principalmente de los tipos 16, 18, 31, 33 y 45) en prácticamente el 100% de los tumores ha impulsado un intenso estudio sobre su estructura genómica y mecanismos oncogénicos que lleva ya más de tres décadas. La clasificación de los HPV, a diferencia de la mayoría de otros virus, no está basada en criterios serológicos sino mediante similitud de sus genomas, debido a que las proteínas de la cápside son antigénicamente similares.⁵ Así, cuando el genoma de un HPV difiere en más del 10% de secuencia del gen L1 se habla de un nuevo tipo viral; cuando esta diferencia se encuentra entre el 2% y el 10% se trata de un subtipo, y cuando es menor del 2% estamos frente a una variante viral.
El análisis de secuencias virales ha permitido agrupar los diversos HPV generando árboles filogenéticos que muestran su evolución molecular. De ellos se han extraído importantes conclusiones, como la de saber que los HPV coevolucionaron con el hombre, distribuyéndose y diseminándose de acuerdo con los movimientos de diversas poblaciones a lo largo de la historia.⁶ Dado que se trata de uno de los grupos virales más diversos involucrados en infecciones humanas, estos análisis están generando información básica de utilidad en la elaboración de métodos diagnósticos moleculares, estudios de relaciones genotipo-fenotipo y detección de grupos virales más agresivos.
En nuestro estudio epidemiológico regional sobre infección de cuello uterino por HPV llevado a cabo durante los años 2000 a 2003 se relevaron dos poblaciones de Misiones, Argentina: mujeres de raza blanca urbanas y mujeres aborígenes de la etnia guaraní, residentes en la selva misionera.⁷ Los valores de prevalencia de infección viral genérica fueron elevados, con una diferencia significativa entre poblaciones: urbana, 43%, y aborigen, 60%. Estas altas prevalencias se asociaron con el inicio temprano de relaciones, número de parejas y hábito de fumar. Además, fue importante la presencia de tipos virales de alto riesgo en la población aborigen guaraní (26%), con una notoria diversidad viral de 28 tipos detectados, en contraste con sólo 10 presentes en la población urbana.
Al agrupar los tipos virales hallados según la clasificación filogenética propuesta por Myers y col. basada en la región consenso del gen L1,⁸ encontramos que en los aborígenes están presentes la mayoría de los tipos virales de alto riesgo (grupos A9, A7 y A5); mientras que en la población urbana, la diversidad viral fue mucho más acotada, con alrededor del 30% de tipos pertenecientes a los grupos A7 y A9 de alto riesgo. Esta situación particular podría definir dos posibles dinámicas de circulación viral con características propias en cada población.
Mediante el estudio de variantes de HPV16 se identificaron cinco ramas filogenéticas correspondientes a poblaciones europea, asiática, asiático-americana, africana-1 y africana-2.⁹ Esta diversidad viral relacionada inicialmente a la ubicación geográfica se encuentra actualmente asociada con la etnicidad poblacional.
Últimamente se encuentra en discusión que algunas variantes de HPV16 pueden ser determinantes de diferentes comportamientos biológicos. Estas variaciones menores expresadas en secuencias proteicas afectan el ensamblado viral, la capacidad transcripcional y también su potencial oncogénico.¹⁰ Dichos efectos mostraron diferencias en la capacidad de inmortalización de células en cultivo y en la degradación de p53 y que variantes particulares tienden a estar más asociadas a lesiones de alto grado y cáncer, siendo su distribución diferencial en ciertas áreas geográficas y en etnias particulares.^11-14
Estos datos conducen a la necesidad de evaluar la distribución de las diversas variantes de HPV16 presentes en poblaciones con alta incidencia de carcinoma de cérvix, con el objetivo de establecer posibles asociaciones entre variantes particulares, lesiones cervicales y su progresión hacia la malignidad.
Sobre la base de estos informes y la posible consecuencia en nuestra realidad regional, llevamos a cabo recientemente un estudio de caracterización de clase y subclase de variantes de HPV16 infectantes en mujeres guaraníes con diferentes grados de lesión cervical basado en el análisis del gen temprano E6 (asociado a mecanismos oncogénicos virales) y del gen tardío L1 (asociado a la antigenicidad viral). Estos análisis tuvieron como objetivos detectar las variantes presentes en esta etnia particular y estimar su posible asociación a lesiones cervicales de diferente grado.
Materiales y métodos
Características generales de la población relevada
Se seleccionaron 70 muestras de hispado exoendocervical HPV16 monoinfectadas de la población aborigen guaraní relevada durante 2002-2003.⁷ La mediana de edad de esta submuestra poblacional fue de 20 años, habiendo iniciado relaciones sexuales a los 13 años, teniendo de 3 a 5 parejas y con primer embarazo a los 15 años, en promedio. Noventa y cuatro por ciento de las mujeres nunca habían recibido atención ginecológica.
Las pacientes se distribuyeron geográficamente 34 asentamientos de la región norte de Misiones, departamento de Iguazú, en la frontera con Brasil y Paraguay, y 36 en la región central de la provincia, internadas en áreas de selva subtropical alejadas de las fronteras. Estos asentamientos distan aproximadamente 200 km entre sí y registran una limitada migración entre sus integrantes. Los aborígenes de la región norte tienen un contacto fluido con habitantes no aborígenes y turistas de la zona fronteriza, mientras que los de la región central preservan en mayor medida su forma ancestral de vida, limitando en lo posible los contactos con pobladores del área.
Características de las muestras analíticas
Todas las muestras fueron reconfirmadas como monoinfectadas por HPV16 mediante PCR-RFLP¹⁵ y sus diagnósticos citohistológicos revisados por dos patólogos independientes. De las 70 muestras totales, 37 se encontraban dentro de límites normales, 18 presentaban lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LSIL) y 15, lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL).
Identificación de variantes de los genes E6 y L1 de HPV16
Se llevó a cabo mediante el método propuesto por Wheeler y col.¹⁶ el cual se basa en la amplificación por PCR anidada de una región de 585 pb del gen E6 y una región de 423 pb del gen L1 de HPV16. Estos productos son luego hibridados con 23 y 12 sondas biotiniladas, respectivamente, en formato dot-blot. Las variaciones nucleotídicas posibles de identificar incluyen las posiciones 109, 131, 132, 143, 145, 178, 183, 286, 289, 335, 350, 403 del gen E6, y 6695, 6721, 6803, 6854, 6862 y 6694 del gen L1 de HPV16. Los patrones de hibridación se asignaron a las diversas clases y subclases de variantes de acuerdo con la clasificación propuesta por Yamada y col.¹⁷
Análisis estadístico
Para la determinación de asociación entre variantes de HPV16 infectantes y grado de lesión histopatológica se empleó el test de χ² calculado con el programa Epi-Info versión 3.3 (Epidemiology Program Office, Division of Public Health Surveillance and Informatics, Centers for Disease Control and Prevention, EE.UU.).
Resultados
Mediante la aplicación de la técnica de Wheeler y col.¹⁶ se pudo identificar y clasificar la totalidad de las clases y subclases de variantes de HPV16 presentes en esta dos poblaciones aborígenes guaraníes residentes en distintas áreas geográficas de la provincia de Misiones.
La distribución general de variantes incluyó, en orden de importancia: 51% de variante europea prototipo (EP), 32% de variante europea-350G (E-350G), 9% de variante africana tipo 1 (Af1), 4% de variante europea-6862C, 3% de variante africana tipo 2-a (Af2-a) y 1% de variante asiático americana-a (AA).
La distribución de variantes por zona geográfica de residencia no fue homogénea, detectándose mayor diversidad en la región Norte, en comparación con los asentamientos de la región Centro.
En la región Norte, el 74% de las variantes fueron de origen europeo, con el 26% restante de otras clases, mientras que la totalidad de las variantes presentes en la región Centro (100%) fueron de origen europeo (tabla 1).



No se detectó asociación estadísticamente significativa cuando se analizó la distribución de variantes entre las muestras con diagnóstico histopatológico LSIL y HSIL por medio de la prueba de χ² (tabla 2).



Discusión
Está comprobado que una infección cervical persistente con HPV16 es un factor de riesgo importante para el desarrollo de lesiones premalignas y cáncer cervical.¹⁸
Últimamente se sugirió que diversas variantes naturales de HPV16 en una población pueden presentar comportamientos biológicos diferentes, algunas de ellas asociadas a lesiones cervicales de alto grado y cánceres agresivos.^19,20
La población aborigen guaraní estudiada presenta una elevada prevalencia de variantes europeas (87%), un resultado concordante con el único estudio realizado a nivel mundial, en el que se informa un 76% de variantes europeas en cánceres cervicales de América Central y América del Sur.¹⁷
Por otra parte, del 12% de las variantes no europeas presentes en mujeres guaraníes, la variante africana-1 es la más prevalente, con un 9%. Estos resultados contrastan con los de Yamada y col., quienes detectaron un 20% de variantes asiático americanas presentes en carcinomas de esta región mundial y sólo un 3% de variantes africanas.¹⁷
Se conoce que los genomas de HPV son muy estables, los eventos mutacionales y de recombinación son muy raros, ocurren con frecuencias que no difieren de aquellas humanas.² Es por ello interesante destacar la relación entre diversidad de variantes virales detectadas y frecuencia estimada de contactos entre las aborígenes residentes en las dos regiones en estudio. En consecuencia, la detección de variantes africanas sólo presentes en mujeres aborígenes guaraníes residentes de la región Norte (tabla 1) podría asociarse a contactos con individuos de esa ascendencia provenientes del sur de Brasil, descendientes de esclavos introducidos durante la dominación portuguesa.
Si comparamos los resultados obtenidos en este trabajo con los comunicados por Picconi y col. sobre variantes de HPV16 presentes en población indígena quechua argentina,²¹ ambos coinciden en destacar una limitada presencia de variantes no europeas en estas dos poblaciones aborígenes residentes en los extremos opuestos del Norte argentino. Hipotéticamente, el impacto de la colonización española habría impulsado una circulación de variantes europeas en ambas poblaciones mencionadas.
Sin embargo, a diferencia de las guaraníes, el 10% de las variantes no europeas presentes en quechuas es de origen asiático-americano o asiático, sin detección de variantes africanas. Este hecho podría asociarse a la idea de una distribución viral más ancestral en esta etnia, proveniente de la migración de individuos asiáticos por el estrecho de Behring, con una posterior distribución geográfica a lo largo de la cordillera andina.
Actualmente existen informes que asocian una mayor frecuencia de infección genital por variantes asiático-americanas o de la subclase E350G de HPV16 con lesiones cervicales y cánceres.^12,22 Esto no se verificó en la población guaraní analizada, en donde la distribución de las diversas variantes de HPV16 detectadas en mujeres con citología normal y con lesiones de diferente grado fue estadísticamente no significativa. Aun así, la única variante asiático-americana detectada en guaraníes provino de una paciente con lesión de alto grado (tabla 2).
Sobre la base de resultados diversos y contrastantes recabados en diferentes poblaciones a nivel mundial y debido a que algunas de estas variaciones de secuencia génica tienen el potencial de modificar la estructura proteica de la cápside viral y, por ende, su antigenicidad, es importante la continuidad del estudio de su prevalencia y del análisis de su asociación a lesiones de alto grado y cánceres, tratando de establecer si verdaderamente las variantes virales de HPV16 y de otros tipos de alto riesgo oncogénico presentan comportamientos biológicos diferentes que ameriten su detección particular y su asignación como parámetro relacionado a una progresión diferencial de lesiones cervicales.
Los autores no manifiestan “conflictos de interés”.

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