PREPARATION OF A ³⁵S-PROINSULIN TRACER AND ITS APPLICATION IN A COMBINED RADIOLIGAND-BINDING ASSAY FOR PREDICTING INSULIN REQUIREMENT IN ADULT ONSET DIABETIC PATIENTS

Abstract
The serum glutamate decarboxylase autoantibodies (GADA) and insulin/proinsulin autoantibodies (IAA/PAA) have predictive value about the insulin requirement in adult-onset diabetic patients. In our lab, we first developed a new tracer ³⁵S-Proinsulin for PAA assessment. Then it was employed in a combined radioligand binding assay with ³⁵S-GAD for the simultaneous determination of GADA and PAA (RBA GADA/PAA combi). This novel assay was applied to sera from 85 young type 1 and 98 adult-onset diabetic patients, and to 53 normal control. Among type 1 diabetes sera, 100% of those with at least one positive marker by single methods, and 17.7% of those with double negative markers, were positive by RBA GADA/PAA combi. Among sera from adult-onset diabetes, 100% of those PAA+ (GADA+ or GADA-), 92.3% of GADA+/PAA-, and 1.3% of GADA-/PAA-, were RBA GADA/PAA combi+. Moreover, 88.9% of adult patients RBA GADA/PAA combi+ evolved to insulin requirement, suggesting a good predictive value for this method. In conclusion, the new tracer ³⁵S-Proinsulin was able to be used in the RBA GADA/PAA combi allowing the simultaneous detection of GADA and PAA markers. Such marker combination is a valuable tool for assessing autoimmune processes associated to future insulin requirement in adult-onset diabetes.

Key words
Autoantibodies, diabetes mellitus, insulin, proinsulin, GAD, radioligand-binding assay

Artículo completo
La diabetes mellitus (DM) tipo 1 normalmente aparece antes de los 20 años y se caracteriza por la deficiencia absoluta de insulina circulante como consecuencia de la destrucción autoinmune de las células beta de los islotes pancreáticos. Las características bioquímicas destacadas son la presencia de autoanticuerpos circulantes y la asociación con ciertos alelos HLA de alta susceptibilidad. La DM tipo 2 aparece frecuentemente en personas mayores de 40 años y se atribuye a un defecto en los mecanismos moleculares que intermedian la acción de la insulina sobre las distintas células del organismo, pudiendo coexistir con un defecto secretorio a nivel de las células beta, generalmente sin agresión inmunológica asociada.¹ Sin embargo, se ha descrito la existencia de autoinmunidad en pacientes adultos clasificados inicialmente como diabéticos tipo 2. Así, 10% a 25% de los pacientes con fenotipo de DM tipo 2 presentan autoinmunidad.^2-7 Los autoanticuerpos anti-glutamato descarboxilasa (GADA), anti-tirosina fosfatasa IA-2 (IA-2A) y anti-insulina/proinsulina (IAA/PAA) identifican los pacientes con insuficiencia progresiva de las células beta, la mayoría de los cuales en algún momento presentará insulinodependencia.⁸
La detección temprana de los pacientes con riesgo de tornarse insulinodependientes es sumamente deseable, independientemente del tipo de diabetes involucrada.^9-13 La presencia de autoanticuerpos en adultos con un perfil de DM tipo 2 puede predecir la necesidad de administrar insulina y evitar en estos pacientes un control metabólico inadecuado.¹⁰
En un trabajo previo determinamos el perfil de los marcadores GADA, IA-2A e IAA en 115 pacientes diabéticos con comienzo clínico en edad adulta, detectamos una alta prevalencia de los marcadores GADA e IAA, en comparación con la de IA-2A.¹⁴ Otros autores también demostraron baja prevalencia de IA-2ª.¹⁵ En este sentido, de acuerdo con Kasuga y col.,⁸ encontramos que la presencia de IAA en asociación con GADA predice el requerimiento insulínico. También detectamos algunos pacientes IAA positivos, GADA negativos que evolucionaron lentamente a insulinodependencia. Por los motivos citados, se decidió desarrollar una nueva estrategia analítica mejor adaptada al perfil serológico de la diabetes del adulto.
Habitualmente, para la detección de los marcadores séricos de autoinmunidad dirigida a los componentes de las células beta pancreáticas se utilizan ensayos de unión de radioligando (reconocidos universalmente por la sigla inglesa derivada de radioligand binding assay [RBA]). Entre estas pruebas consideradas de referencia por ser confiables y muy reproducibles se hallan las que determinan los marcadores IAA y GADA. Estos son particularmente útiles para el screening de individuos con alto riesgo de contraer DM tipo 1, insulinodependiente.^16-18 Sin embargo, del mismo modo en que oportunamente se había diseñado una estrategia simplificada y económica para la determinación combinada de los marcadores GADA e IA-2ª,¹⁹ nuestro grupo consideró apropiado desarrollar un método radiométrico combinado para la detección simultánea de GADA e IAA. Dicho ensayo facilitaría, según las previsiones de nuestro trabajo anterior¹⁴ el screening de autoinmunidad en pacientes diabéticos con comienzo clínico en edad adulta de manera más rápida y menos costosa. Pero por otra parte, se sabía que la determinación simultánea de GADA e IAA estaba dificultada debido a los diferentes isótopos involucrados en los análisis convencionales de referencia (¹²⁵I-Insulina y ³⁵S-GAD) y a los distintos sistemas de separación normalmente aplicados (PEG y proteína A-Sepharose, respectivamente). Con esos antecedentes se concibió un diseño analítico para la detección en una sola prueba de los marcadores GADA e IAA. Además se contempló el problema de la estructura bicatenaria de la insulina, por lo cual se partió del modelo monocatenario de su precursor, la proinsulina, para mejorar las probabilidades de lograr un plegamiento terciario nativo y asociadamente un proceso reoxidativo apropiado para la formación correcta de los puentes disulfuro durante la biosíntesis del trazador in vitro. Además, la obtención del autoantígeno proinsulina recombinante (o incluso de preproinsulina), representativo de la estructura molecular completa existente en los gránulos de secreción, resultaba un modelo más apropiado, al menos desde el punto de vista teórico. Para ello primero desarrollamos un trazador de proinsulina marcado metabólicamente con [³⁵S]-Cys, apto para aplicarlo a un método radiométrico destinado a determinar IAA/PAA,²⁰ de manera análoga a la determinación del marcador GADA. Posteriormente desarrollamos un RBA combinado utilizando los trazadores [³⁵S]-Proinsulina y [³⁵S]-GAD para la detección simultánea de los dos marcadores en una único prueba.²¹
La performance del RBA GADA/PAA combi fue evaluada primero empleando suero de pacientes con DM tipo 1, los cuales fueron también evaluados por los métodos radiométricos individuales. El estudio se efectuó sobre una seroteca previamente constituida, dentro de un programa de estudio conjunto con la Unidad Metabólica del Hospital Nacional de Pediatría Dr. J. P. Garrahan, de Buenos Aires, y cuyos resultados fueran oportunamente publicados.^22,23 En esa evaluación preliminar de control el RBA GADA/PAA combi mostró alta correspondencia con los métodos radiométricos individuales. De esta forma todos los sueros positivos para GADA, PAA o ambos determinados individualmente, fueron también positivos por el RBA GADA/PAA combi, reflejando la correspondencia perfecta de los resultados. Además, 17.7% de los sueros GADA-/PAA- resultaron positivos por el RBA GADA/PAA combi, lo que sugiere una mayor sensibilidad del método combinado en relación con los individuales. Al respecto, cabe destacar que recientemente se estableció un acuerdo con el Dr. George Eisenbarth, investigador de amplio reconocimiento internacional, desde el Barbara Davis Center, de Denver, Colorado, EE.UU., para el análisis comparativo del marcador PAA utilizando nuestro método versus el método convencional para IAA.
Por otro lado, luego de la validación del RBA GADA/PAA combi frente a los métodos individuales, la nueva metodología desarrollada fue aplicada a 98 sueros de pacientes diabéticos con comienzo clínico en la edad adulta, de los cuales el 18.4% resultó positivo. Este valor fue mayor que los obtenidos con los RBA individuales (15.3% para GADA y 5.1% para PAA). Posteriormente se estudió el uso potencial del RBA GADA/PAA combi para predecir el requerimiento insulínico en pacientes diabéticos con comienzo clínico en la edad adulta. De los 18 pacientes adultos que resultaron positivos al emplear el RBA GADA/PAA combi, 16 (88.9%) progresaron a dependencia insulínica, lo que sugiere que dicho ensayo puede ser utilizado como una herramienta analítica predictiva. Más aun, los 16 pacientes RBA GADA/PAA combi+, que evolucionaron al requerimiento insulínico, presentaron mayores señales de autoanticuerpos que los únicos dos pacientes tipo 2 (DM 2) seropositivos que no requirieron terapia insulínica (tabla 1). La positividad para GADA predominó entre los pacientes adultos requirentes de insulina de rápida evolución (ARI r) con una relación GADA:PAA de 9:3. Por el contrario, entre los pacientes adultos requirentes de insulina de evolución lenta (ARI l) esa relación fue de 3:4. Independientemente de cuál fuese el subgrupo al cual perteneciera el paciente, el RBA GADA/PAA combi permitió detectar la totalidad de los individuos con marcadores positivos (figura 1).

Figura 1. Distribución de las señales obtenidas de los RBA individuales para GADA y PAA y del RBA GADA/PAA combi aplicados a 18 sueros de pacientes con comienzo clínico en la edad adulta GADA/PAA combi+. La línea punteada representa el valor de corte para cada ensayo.

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