RHYTHMIC EXPRESSION PATTERNS OF CLOCK GENES (PER AND TIM) AND LOCOMOTOR ACTIVITY IN MUTANTS OF DROSOPHILA MELANOGASTER UNDER DIFFERENT WAVELENGTHS OF LIGHT

Abstract
The gene products of period (per) and timeless (tim) are essential components of circadian clock controlling the rhythms of locomotor activity, eclosion and male courtship song in Drosophila melanogaster. The temporal expression patterns of per and tim at various time points were studied in intestine and salivary glands of wild type (WT), vestigial (vg) and cryptochrome-absent (cry^b) mutants under different light regime treated conditions. The weaker expression of per and tim in cry^b flies suggested the significant role of blue light photoreceptor, cryptochrome for a stronger synchronization of circadian clock. The expression of per and tim in the salivary gland of larvae suggested their temporal expression during the developmental stages of D. melanogaster. In vg mutants poorer locomotor activity rhythms with lesser amount activity (α) were observed than WT flies under different light regime treated conditions; it might be due to greatly reduced wing structure in vg flies. From the present results, it was suggested that blue and green light are more or less effective as white light; red light was found to be least effective on circadian clock gene expression and locomotor behaviour in WT and mutants of Drosophila melanogaster.

Key words
Drosophila melanogaster, circadian clock, gene

Artículo completo
Los ritmos circadianos están establecidos en la mayoría de los eucariotas, en una minoría de los procariotas, y aportan un marco temporal para los organismos vivos. Los insectos aportan un excelente modelo para estudiar la organización circadiana multioscilatoria. Los mecanismos moleculares del reloj circadiano de Drosophila melanogaster se estudian constantemente. Los productos de los genes period (per) y timeless (tim) son componentes fundamentales de este reloj que controlan los ritmos de actividad locomotora, el comportamiento de eclosión y el componente rítmico de la canción utilizada para el cortejo de la mosca.^1,2 El ARNm y los niveles proteicos de los genes tim y per se producen cíclicamente con un período cercano a las 24 horas en todas las partes del cuerpo de Drosophila bajo condiciones constantes de luz y oscuridad. Los genes tim y per se transcriben de manera cíclica y generan un sistema de retroalimentación molecular.^3,4 Las dos proteínas (PER y TIM) se acumulan durante la noche y se necesita su heterodimerización para su traslado hacia el núcleo. Estas proteínas presentan fluctuaciones diarias en su estado de fosforilación, en su distribución subcelular, etc. Además, el complejo TIM-PER ingresa en el núcleo en una manera dependiente del tiempo. Esta secuencia de fenómenos provoca, con posterioridad, la inhibición de la transcripción de per y tim.^5,6 Las neuronas laterales del cerebro parecen ser importantes para la regulación circadiana en la mosca; se han detectado oscilaciones circadianas independientes del cerebro en diversos tejidos periféricos de Drosophila. Este organismo utiliza al menos tres fotorreceptores: viz para el arrastre, los cryptocromos (cry) para la luz azul, los componentes de los ojos y del ojalillo de Hafbaur-Buchner.⁹ Los fotorreceptores transmiten, principalmente, las señales del medio ambiente hacia el reloj.
Ivanchenko y col.¹⁰ informaron que el fotorreceptor para la luz azul, cry, es un elemento indispensable para el arrastre en los tejidos periféricos de la mosca; las que carecen de ellos (cry^b) tienen un aporte o entrada fótica defectuosa. En las mutantes vg (con vestigios) se halló que la estructura de las alas estaba reducida¹² y que la actividad locomotora se encontraba mucho más disminuida.¹³ Con anterioridad se investigaron las sensibilidades diferenciales de los receptores visuales y ocelares en la mosca de la fruta. Se informó que la luz roja era menos efectiva sobre el comportamiento circadiano de la mosca^14,15 y que las sensibilidades máximas tuvieron lugar dentro de la gama azul del espectro.¹⁶ En este estudio se observaron las expresiones de los genes tim y per bajo diferentes esquemas luminosos, como ciclos de 12 horas de luz y oscuridad (12:12) (LO); luz azul (450 nm):oscuridad (AO); luz verde (550 nm):oscuridad (VO) y luz roja (650 nm):oscuridad (RO) en mutantes vg y cry^b de Drosophila mediante hibridación ARN:ADN in situ. También se observaron ritmos de actividad locomotora bajo estos regímenes luminosos.
En los horarios diurnos subjetivos ZT 06 y ZT 10, las expresiones de per y tim fueron débiles, mientras que en los nocturnos ZT 18 y ZT 22 se hallaron fuertemente aumentadas en mutantes y en las de tipo salvaje (wild type [WT]); en comparación con otros intervalos de tiempo bajo diferentes condiciones luminosas. Estos resultados indican la degradación dependiente de la luz de TIM en todas las longitudes de ondas excepto en el ciclo AO, donde es débil. La expresión más débil de per y tim en moscas cry^b sugirió el importante papel del cryptochrome –fotorreceptor para la luz azul– para la sincronización más intensa del reloj circadiano. Sin embargo, bajo condiciones AO en mutantes cry^b la expresión de tim se halló fuertemente aumentada, lo que sugirió que la luz azul podría imitar la oscuridad continua en esta mutante, ya que expresa una proteína cry mutante (la cual es uno de los fotorreceptores presentes en Drosophila). Además, la degradación de TIM dependiente de cry podría estar suprimida y la vía completa podría estar afectada, lo que provoca el aumento de la expresión del gen tim bajo condiciones AO. En este trabajo, se encontró que las luces verdes y azules fueron más o menos efectivas en comparación con las blancas, y que las rojas fueron menos efectivas sobre el comportamiento locomotor circadiano y en la expresión de los genes clock en WT y en mutantes. Se observaron patrones de expresión similares en el intestino y en las glándulas salivales. Las expresiones de estos genes clock sugirieron la presencia de osciladores circadianos autónomos y periféricos en estos tejidos. La expresión relativamente más débil de estos genes clock en las mutantes indicó un grado menor de acoplamiento y de coordinación del reloj maestro con los relojes periféricos. La expresión de per y de tim en las glándulas salivales de las larvas sugirió, además, su expresión temporal durante las etapas del desarrollo de D. melanogaster.
En las mutantes vg se observaron ritmos más débiles de actividad locomotora con menor cantidad de actividad (α) que en moscas WT bajo condiciones AO, VO y RO; esto podría deberse a la importante reducción de la estructura de las alas en estas mutantes. Bajo condiciones RO la cantidad de actividad se halló francamente disminuida en mutantes y en el tipo salvaje, lo que indica que la luz roja podría ser menos sensible sobre la actividad locomotora manifiesta en la mosca. Sin embargo, la duración de período (τ) se incrementó de forma significativa bajo esta luz y se halló una disminución en los genes clock per y tim en mutantes y WT, lo que evidenció que estos genes pueden tener consecuencias directas sobre la longitud del período de la mosca.
Las moscas adultas y las larvas muestran ritmos de comportamiento en la función digestiva (actividades metabólicas más elevadas), la absorción de líquidos y la digestión de alimentos está guiada por movimientos iónicos de trasmembrana. En estos tejidos funcionan bombas iónicas y ATPasas vacuolares.¹⁷ De esta manera, la expresión circadiana de genes clock en el intestino podría afectar las tasas de movimientos iónicos a través de las membranas celulares –como en otros sistemas circadianos.¹⁸ Este reloj (periférico y autónomo), que se presenta en los intestinos de las moscas, puede ser manipulado de manera experimental y podría aportar un modelo para investigar los vínculos entre los mecanismos circadianos y la fisiología de las membranas. De igual forma, las glándulas salivales de las larvas involucradas en la función digestiva de secreción y síntesis enzimática, permiten explorar los vínculos entre el mecanismo circadiano y la bioquímica de las membranas. El conocimiento de las bases moleculares del reloj desde la entrada y hasta la salida en el sistema de Drosophila podría ser de utilidad para estudiar el comportamiento y la fisiología de organismos más complejos; y para preparar el terreno para el alivio de las enfermedades originadas por desequilibrios en la función del reloj circadiano.
Los autores no manifiestan “conflictos de interés”.

Bibliografía del artículo

1. Konopka RJ, Benzer S. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA 1971; 68:2112-2116.
2. Sehgal A, Price JL, Man B, Young MW. Loss of circadian behaviour rhythms and per RNA oscillations in the Drosophila mutant timeless. Science 1994; 263:1603-1606.
3. Subramanian P, Lakhotia SC. Molecular rhythms that regulates rhythm genes in Drosophila. Curr Sci 1999; 77:1165-1169.
4. Subramanian P, Balamurugan E, Suthakar G, Circadian clock genes in Drosophila: Recent developments. Indian J Exptl Biol 2003; 41:797-804.
5. Vosshall LB, Price JL, Sehgal A, Saez L, Young MW. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science 1994; 263:1606-1609.
6. Price JL, Dembinska ME, Young MW, Roshash M. Suppression of PERIOD protein abundance and circadian cycling by the Drosophila clock mutation timeless. EMBO J 1995; 14:4044-4049.
7. Plautz JD, Kaneko M, Hall JC, Kay SA. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science 1997; 278:632-1635.
8. Emery P, So WV, Kaneko M, Hall JC, Rosbash M. CRY, a Drosophila clock and light-regulated cryptochrome, is a major contributor to circadian rhythms resetting and photosensitivity. Cell 1998; 95:669-679.
9. Hofbauer A, Buchner E. Does Drosophila have seven eyes Naturwiss 1989; 76:335-336.
10. Ivanchenko M, Stanewsky R, Giebultowicz JM. Circadian photoreception in Drosophila: Functions of cryptochrome in peripheral and central clocks. J Biol Rhythms 2001; 16:205-215.
11. Stanewsky R, Kaneko M, Emery P, Beretta B, Wager-Smith K, Kay SA, Rosbash M, Hall JC. The cryb mutation identifies cryptochrome as a circadian photoreceptor in Drosophila. Cell 1998; 95: 681-692.
12. Lindsley DL, Zimm GG. The genome of Drosophila melanogaster. Academic press, San Diego, 1992.
13. Suthakar G, Subramanian P, Manivasagam T. Rhythmic patterns of activity in vg and cryb mutants of Drosophila under two different wavelengths of light. J Insect Behav 2005; (in press).
14. Frank KD, Zimmerman WF. Action spectra for phase shifts of a circadian rhythms in Drosophila. Science 1969; 163:688-689.
15. Helfrich-Forster C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster: sex-specific differences suggest a different quality of activity. J Biol Rhythms 2000; 15:135-154.
16. Suri V, Qian Z, Hall JC, Rosbash M. Evidence that the TIM light response is relevant to light-induced phase shifts in Drosophila melanogaster. Neuron 1998; 21: 225-234.
17. Dow JA, Davies SA, Guo Y, Graham S, Finbow ME, Kaiser K. Molecular genetic analysis of V-ATPase function in Drsophila melanogaster. J Exp Biol 1997; 200:237-245.
18. D’Souza T, Dryer SE. A cationic channel regulated by a vertebrate intrinsic circadian oscillator. Nature 1996; 382(6587):165-167.