POLYMORPHISM OF THE INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASA GENE IN CELIAC DISEASE

Abstract
Nitric oxide (NO) plays a main role in the regulation of diverse physiological and pathophysiological mechanisms in cardiovascular, nervous and immunological systems. The production of NO in the human body is catalyzed by a family of enzymes called nitric oxide synthases (NOSs). Two enzymes, eNOS and nNOS isoforms are designated as constitutive NOS because they are constitutively activated in endothelial and neuronal tissues. The third isoform, iNOS can be induced by immunostimulatory cytokines or infection in a number of cells. The aim of this study was to investigate the possible association between the inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene promoter polymorphism, CCTTTn microsatellite, with celíac disease susceptibility. We carried out a familial study in which 53 Spanish families were genotyped by a polymerase chain reaction (PCR) based method combined with fluorescent technology. A transmission disequilibrium test was performed to investigate the transmission pattern of the different CCTTTn alleles from parents to affected offspring. The test did not reach any statistically significant difference since none of the CCTTTn repeats was shown to be significantly transmitted to the affected sibs. Our data suggest that the CCTTTn pentanucleotide microsatellite in the NOS2 gene promoter does not play a major role in the celíac disease development.

Key words
Inducible nitric oxide synthase, celíac disease, microsatellit

Artículo completo
Introducción
El óxido nítrico (NO) juega un papel relevante en la regulación de diversos mecanismos fisiológicos y patológicos en los sistemas nervioso, cardiovascular e inmunológico.¹ La producción de óxido nítrico se lleva a cabo de forma constitutiva por las sintasas endoteliales (eNOS o NOS1) o neuronales (nNOS o NOS3).¹ En condiciones de estrés derivadas de procesos infecciosos o autoinmunes se induce la producción de NO en mayores concentraciones por la oxido nítrico sintasa inducible (iNOS o NOS2). La expresión de esta enzima se observó en diversos tipos celulares, como células del endotelio, hepatocitos, monocitos y macrófagos, tras su estimulación por diferentes citoquinas proinflamatorias.²
El NO es un importante mediador en la respuesta inmune innata al actuar como agente citotóxico ante infecciones por virus y otros patógenos. Por otro lado, también se ha descrito un papel inmunorregulador del NO por su participación en el mantenimiento del equilibrio Th1/Th2, así como en la apoptosis.² Las enfermedades autoinmunes en las que se ha descrito que la producción de NO por la iNOS se relaciona con la patología de la enfermedad son muy diversas, como es el caso de la artritis reumatoidea, la esclerosis múltiple y la diabetes tipo 1.³ En este trabajo se planteó como objetivo estudiar el papel de la iNOS en otra enfermedad autoinmune, la enfermedad celíaca (EC).La EC consiste en una inflamación crónica de la mucosa intestinal producida por la ingesta de gluten en la dieta diaria, que afecta a individuos genéticamente predispuestos. La susceptibilidad a la enfermedad celíaca tiene un fuerte componente genético, en el cual desempeñan un papel relevante los genes de los antígenos leucocitarios humanos (HLA). En este sentido, los alelos DQA1*05 y DQB1*02 que codifican para la molécula DQ2, están presentes en un 90% de los pacientes celíacos.⁴ A pesar de la fuerte asociación entre la EC y HLA-DQ2, se sugiere que la contribución total de los genes HLA al riesgo de padecer EC no es mayor de un 40%. Por tanto, se cree que otros genes ubicados fuera de la región HLA podrían estar involucrados en la susceptibilidad a dicha enfermedad.^4,5
Las manifestaciones clínicas de la EC son variadas, aunque todos los pacientes celíacos presentan una mucosa intestinal dañada, caracterizada por atrofia de vellosidades e inflamación. Se observó que en los pacientes celíacos hay un aumento de la producción de NO a nivel intestinal en comparación con controles sanos.^6,7 Además, se demostró la expresión activa de la iNOS en el intestino de niños con EC.^8-10 Una posible explicación para esta producción diferencial de NO entre individuos celíacos y controles sanos podría ser la presencia de polimorfismos en la región reguladora del gen NOS2; en este sentido, recientemente se describió que la región promotora del gen iNOS es sumamente polimórfica.¹¹ Otro dato interesante es que el gen NOS2 se encuentra en la región cromosómica 17q11.2-12, que se asoció con predisposición a EC en estudios de rastreo sistemático del genoma.¹²
Sobre la base de todos estos datos se planteó como objetivo de nuestro estudio analizar la posible participación de un microsatélite CCTTTn sumamente polimórfico situado en la región promotora del gen NOS2 en la susceptibilidad a EC.
Material y métodos
Pacientes
En el estudio se incluyeron 53 familias españolas con un hijo afectado de EC y tanto ellos como sus progenitores fueron genotipificados para el microsatélite CCTTTn. Los pacientes se diagnosticaron según los criterios de la Sociedad Europea de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica (EPSGAN) para la EC.¹³
Tipificación del microsatélite CCTTTn
Se utilizó un método basado en PCR descrito previamente.¹⁴ Los oligonucleótidos usados fueron: 5’ ACCCCTGGAAGCCTACAACT 3’ como directo y 5’ GCCACTGCAACCCTAGCCTGTCTCA 3’ como inverso. El oligonucleótido directo se marcó fluorescentemente en 5’ con FAM. Alícuotas de 0.5 μl de PCR se añadieron a 3 μl de formamida y 0.5 μl de marcador interno estándar. Las muestras se analizaron en geles de desnaturalización (6% acrilamida/7 M urea) y se midió su longitud con el software Genescan TM 672 (Applied Biosystem, Nienwekerk/Ijssel, The Netherlands).
Análisis estadístico
Por medio del programa “TDT-phase program” previamente descrito,¹⁵ se realizó un test de desequilibrio de transmisión (TDT) y se calculó la frecuencia de alelos parentales transmitidos y no transmitidos a los hijos afectados de EC. La prueba considera solamente a los pares heterocigóticos y se basa en la transmisión preferencial de un alelo u otro a la descendencia.
Resultados y discusión
En el momento de nuestro estudio únicamente se habían descrito tres polimorfismos en la región promotora del gen NOS2, una mutación puntual (SNP) –954 G/C, que no es polimórfica en poblaciones caucásicas,¹⁶ y dos microsatélites; una secuencia tetranucleotídica TAAAn¹⁷ y una repetición CCTTTn sumamente polimórfica con catorce alelos descritos.¹⁸ De entre estos dos microsatélites se seleccionó como marcador genético para este estudio el microsatélite CCTTTn, debido a su alto grado de polimorfismo (se han descrito 14 alelos diferentes con una heterocigosidad de 0.80) y por su posible potencial para influir en la transcripción del gen NOS2.¹⁴ El microsatélite TAAAn se descartó, ya que numerosos estudios mostraron que su grado de polimorfismo y heterocigosidad es muy bajo en poblaciones caucásicas.¹⁹
En la Figura 1 se muestra el patrón de transmisión de los alelos del microsatélite CCTTTn. Se identificaron 11 alelos diferentes (7 a 17 repeticiones) comprendidas en un rango de 171 a 226 pb, de acuerdo con el patrón previamente descrito para este polimorfismo.^14,19 Los alelos más frecuentemente transmitidos fueron el 186 y el 201, mientras que el 196 fue preferentemente no transmitido a los hijos enfermos; sin embargo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el patrón de transmisión para ninguno de los alelos. Asimismo, la transmisión global de los alelos CCTTTn a los hijos enfermos no mostró una desviación estadísticamente significativa.



Se ha descrito una posible influencia de ciertos alelos del microsatélite CCTTTn en la regulación de la transcripción del gen NOS2.¹⁴ Sin embargo, la extrapolación de estos resultados obtenidos de experimentos in vitro debe hacerse con cautela, ya que diversos factores dentro del microambiente de la enfermedad o del individuo pueden afectar la producción de NO y su actividad biológica. Además, todavía son necesarios estudios moleculares para definir la importancia funcional del polimorfismo de NOS2, considerando que puede haber otros polimorfismos en desequilibrio de ligamiento con éste que quizás estén influyendo en la actividad del promotor.
Además de en la EC, en nuestro departamento se ha estudiado la participación del polimorfismo en la región promotora del gen NOS2 en otras enfermedades autoinmunes: en concreto, en artritis reumatoidea (AR) y lupus eritematoso sistémico (LES). En ambos casos se analizó el papel del microsatélite CCTTTn mediante estudios de casos y controles. De acuerdo con los resultados obtenidos en EC, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre la distribución de este microsatélite en pacientes afectados de LES y en individuos sanos.²⁰ Asimismo, con respecto a la AR tampoco se observaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución de los alelos del microsatélite CCTTTn entre pacientes y controles sanos, por lo tanto se descartó la participación de este microsatélite en la predisposición a AR.¹⁹ Sin embargo, agrupando los alelos del microsatélite en repeticiones cortas (8-11) o largas (12-17) se observó que ciertos alelos parecían estar asociados con protección a AR, concretamente aquellos con repeticiones cortas, aunque las diferencias no fueron estadísticamente significativas.¹⁹ Muy recientemente, en un estudio del papel del microsatélite CCTTTn con respecto a la predisposición a AR en una población española distinta, se confirmó la influencia de las repeticiones cortas en la susceptibilidad a esta enfermedad.²¹
Otros investigadores estudiaron el polimorfismo de CCTTTn y su asociación con diferentes enfermedades autoinmunes en las que se ha visto implicada la producción de NO por la iNOS. Así, ciertos alelos CCTTTn se asociaron con un papel protector en pacientes diabéticos con complicaciones como retinopatía y nefropatía,^14,22 aunque recientemente en un estudio familiar de artritis reumatoidea y diabetes tipo 1 no se encontró asociación entre estas enfermedades y los alelos CCTTTn.^19,23 En nuestro trabajo con respecto a la EC no encontramos ninguna evidencia que sugiera que los alelos CCTTTn están asociados con una predisposición a sufrir EC. Según nuestros datos, los altos niveles de NO observados en el intestino de los pacientes celíacos no parecen tener su origen en el aumento de la expresión de la iNOS, quizá se deban a la acción de otros mediadores proinflamatorios secretados en el microambiente inflamatorio generado por la respuesta inmunitaria frente al gluten.^24-26
En resumen, nuestro estudio representa el primer trabajo que analiza la distribución del microsatélite pentanucleotídico CCTTTn ubicado en el promotor del gen NOS2 en EC, y nuestros datos sugieren que este polimorfismo no está asociado a una mayor predisposición a padecer la enfermedad.
La predisposición genética a padecer EC es compleja y heterogénea, y engloba posiblemente un gran número de genes polimórficos. Todavía conocemos poco sobre el papel de los genes no HLA en la susceptibilidad a EC, por lo tanto, es de gran relevancia seguir analizando otros genes y sus polimorfismos, ubicados fuera de la región HLA. Otros posibles genes candidatos muy interesantes serían los genes de citoquinas que regulan positivamente la expresión de iNOS a nivel transcripcional.
Los autores no manifiestan “conflictos de interés”.

Bibliografía del artículo

1. Aktan F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 2004;75:639-53.
2. Nathan C. Inducible nitric oxide synthase: what difference does it make J Clin Invest 1997;100:2417-23.
3. Kolb H, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide in autoimmune disease: cytotoxic or regulatory mediator Immunol Today. 1998;19:556-61.
4. Sollid LM. Molecular basis of celiac disease. Annu Rev Immunol 2000;18:53-81.
5. King AL, Ciclitira PJ. Celiac disease: strongly heritable, oligogenic, but genetically complex. Mol Genet Metab 2000;71:70-5.
6. Everts B, Stotzer P, Olsson M, y col. Increased luminal nitric oxide concentrations in the small intestine of patients with coeliac disease. Eur J Clin Invest 1999;29:692-6.
7. Herulf M, Blomquist L, Ljumg T, y col. Increased rectal nitric oxide in celiac disease after local challenge with gluten. Scand J Gastroenterol 2001;36:169-73.
8. Beckett CG, Dell'Olio D, Ellis HJ, y col. The detection and localization of inducible nitric oxide synthase production in the small intestine of patients with coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 1998;10:641-7.
9. Holmgren Peterson K, Falth-Magnusson K, Magnusson KE, y col. Children with celiac disease express inducible nitric oxide synthase in the small intestine during gluten challenge. Scand J Gastroenterol 1998;33:939-43.
10. Niveloni S, Weksler-Zangen S, Pedreira S, y col. Time course of nitric oxide synthase generation after gluten exposure in the rectal mucosa of gluten-sensitive patients. Scand J Gastroenterol 2000;35:1150-6.
11. Burgner D, Rockett K, Ackerman H, y col. Haplotypic relationship between SNP and microsatellite markers at the NOS2A locus in two populations. Genes Immun 2003;4:506-14.
12. Popat S, Bevan S, Braegger CP, y col. Genome screening of coeliac disease. J Med Genet 2002;39:328-31.
13. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child 1990;65:909-11.
14. Warpeha KM, Xu W, Liu L, y col. Genotyping and functional analysis of a polymorphic (CCTTT)n repeat of NOS2A in diabetic retinopathy. FASEB J 1999;13:1825-32.
15. Dudbridge F, Koeleman BPC, Todd JA, y col. Unbiased application of the transmission/disequilibrium test to multilocus haplotypes. Am.J.Hum.Genet 2000;66:2009-12.
16. Kun JF, Mordmuller B, Lell B, y col. Polymorphism in promoter region of inducible nitric oxide synthase gene and protection against malaria. Lancet 1998;351:265-6.
17. Bellami R, Hill A. A bialelic tetra nucleotide repeat in the promoter of the human inducible nitric-oxide synthase gene. Clin Genet 1997;52:192-3.
18. Xu W, Liu L, Emson PC, y col. Evolution of a homopurine-homopirimidine pentanucleotide repeat sequence upstream of the human inducible nitric oxide synthase gene. Gene 1997;204:165-70.
19. Pascual M, López-Nevot MA, Cáliz R, y col. Genetic determinants of rheumatoid arthritis: the inducible nitric oxide synthase (NOS2) gene promoter polymorphism. Genes Immun 2002;3:299-1.
20. Lopez-Nevot MA, Ramal L, Jimenez-Alonso J, y col. The inducible nitric oxide synthase promoter polymorphism does not confer susceptibility to systemic lupus erythematosus. Rheumatology (Oxford). 2003;42:113-6.
21. Gonzalez-Gay MA, Llorca J, Sanchez E, y col. Inducible but not endothelial nitric oxide synthase polymorphism is associated with susceptibility to rheumatoid arthritis in northwest Spain. Rheumatology (Oxford). 2004;43:1182-5.
22. Johannesen J, Tarnow L, Parvinng HH, y col. CCTTT-repeat polymorphism in the human NOS2-promoter confers low risk of diabetes nefropathy in type 1 diabetes patients. Diabetes Care 2000;23:560-2.
23. Johannesen J, Pociot F, Kristiansen OP, y col. DIEGG and DSGD. No evidence for linkage in the promoter region of the inducible nitric oxide synthase gene (NOS2) in a Danish type 1 diabetes population. Genes Immun 2000;1:362-6.
24. Nilsen E, Jahnsen FL, Lundin KEZ, y col. Gluten induces an intestinal cytokine resposnse strongly dominated by interferon gamma in patients with celiac disease. Gastroenterology 1998;115:551-63.
25. Lahat N, Shapiro S, Karban A, y col. Cytokine profile in coeliac disease. Sacn J Immunol 1999;49:441-6.
26. Tuckova L, Flegelova Z, Tlaskalova-Hogenova H, y col. Activation of macrophages by food antigens: enhancing effect of gluten on nitric oxide and cytokine production. J Leukoc Biol 2000;67:312-8.