Autor: Roxana Inés Cerretini Columnista Experto de SIIC Institución: Departamento de Genética Instituto de Investigaciones Hematológicas Academia Nacional de Medicina Artículos publicados por Roxana Inés Cerretini

Conclusión breve
El trabajo informa sobre cuatro anomalías estructurales nuevas, una de ellas recurrente, y sugiere que éstas podrían implicar eventos genéticos asociadas a enfermedad inestable.

Resumen

La leucemia linfocítica crónica/linfoma de linfocitos pequeños (LLC/LLP) presenta una evolución clínica muy variable, encontrándose rearreglos genómicos asociados con diferentes grupos de riesgo. Este trabajo se centra en el análisis de rearreglos estructurales de los cromosomas 2, 12 y 17; se describen 4 anomalías nuevas, detectadas en un total de 92 pacientes. Simultáneamente, se efectuó una exhaustiva revisión de la literatura. Se efectuó estudio citogenético e hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Cuatro casos mostraron anomalías que afectaban el cromosoma 17, siendo el cromosoma 2, con punto de ruptura en 2p21, el cromosoma partner más frecuente. Un paciente presentó coexistencia de LLC/LLP con enfermedad de Hodgkin, subtipo celularidad mixta, detectándose el marcador psu dic (17;2)(p112;p21), con deleción monoalélica del gen TP53. Dos casos mostraron una nueva anomalía recurrente: t(2;17)(p21;q23), asociada a evolución clonal en ambos pacientes y a deleción 11q23 en uno de ellos. Las restantes alteraciones fueron el der(17)t(12;17)(q13;q25) y una translocación compleja t(5;12;19)(q15;p11;q13). Cuatro pacientes tuvieron curso clínico adverso y murieron debido a progresión de su enfermedad. Nuestro trabajo aporta cuatro anomalías estructurales nuevas, una de ellas recurrente, y sugiere que éstas podrían implicar eventos genéticos asociadas a enfermedad inestable.

Palabras clave
LLC/LLP, enfermedad de Hodgkin, citogenética, FISH

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
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Especialidades
Principal: Genética Humana, Hematología, 
Relacionadas: Diagnóstico por Laboratorio, Medicina Interna, Oncología, 

Enviar correspondencia a:
Roxana Cerretini. Departamento de Genética, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina. Pacheco de Melo 3081 (1425) Buenos Aires, Argentina

Patrocinio y reconocimiento
Agradecimientos: Este trabajo fue realizado con subsidios otorgados por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), la Agencia Nacional de Promoción Científica y Técnica (ANPCyT), Fundación “Alberto J. Roemmers” y Fundación Acción Oncohematológica.

NOVEL STRUCTURAL ABERRATIONS IN CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA/SMALL LYMPHOCYTIC LYMPHOMA

Abstract
Chronic lymphocytic Leukemia/small lymphocytic lymphoma (CLL/SLL) is a lymphoproliferative disorder characterized by a highly variable clinical course and specific genetic alterations have been associated with different risk groups. In the present study, we focused on the analysis of structural anomalies of chromosomes 2, 12 and 17. In addition, a exhaustive revision of the literature was performed. We identified four new genomic rearrangements detected among 92 evaluated patients. Cytogenetic studies and fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis were performed. Four cases showed chromosome 17 structural anomalies and chromosome 2 with breakpoint at p21 was the most frequent chromosome partner. A psu dic (17;2)(p11.2;p21), leading to a TP53 deletion, was observed in a patient who developed a mixed cellularity Hodgkin’s disease coexisting with the CLL/SLL. Two cases had a new recurrent translocation t(2;17)(p21;q23), both associated with clonal evolution and one of them also with a 11q23 deletion. In addition, a der(17)t(12;17)(q13;q25) and a complex translocation t(5;12;19) (q15;p11;q13) were also found. Four patients presented an adverse clinical outcome and died due to disease progression. These uncommon abnormalities may have implications for the understanding of genetic events associated with evolving disease.

Key words
CLL/SLL, Hodgkin’s disease, cytogenetic, FISH

Artículo completo
Introducción
La leucemia linfocítica crónica/linfoma de linfocitos pequeños (LLC/LLP) es un proceso linfoproliferativo crónico, con una incidencia que corresponde al 7% del total de los linfomas no Hodgkin (LNH),¹ cuya patogénesis, así como su célula de origen no están aún bien definidas.^2,3 Presenta un curso clínico muy variable, situación que determina que cada paciente tenga un riesgo individual de evolución de la enfermedad y de supervivencia. Esta marcada heterogeneidad en términos de morfología, inmunofenotipo y evolución clínica ha orientado la investigación hacia la búsqueda de factores pronósticos robustos de utilidad en la valoración de este riesgo. El estado mutacional de la región variable de los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (IgV_H),⁴ es uno de los marcadores que mejor correlación tiene con la evolución clínica,^5,6 con la salvedad de que los métodos requeridos para tal valoración no son simples ni están disponibles, en la mayoría de los casos, en la práctica clínica. La expresión de ZAP-70, considerado como el subrogante del estado mutacional de IgV_H, constituye un buen parámetro, que puede ser fácilmente detectable por citometría de flujo, ya que presenta buena asociación con progresión de la enfermedad y supervivencia.⁷ Contrariamente, el valor de CD38 como factor pronóstico es controvertido,^8,9 sobre todo si se tiene en cuenta que sus niveles de expresión pueden variar durante el curso de la enfermedad.¹⁰
Simultáneamente, las anomalías cromosómicas tienen un papel relevante en la definición de diferentes grupos de riesgo para esta entidad, habiéndose encontrando buena correlación entre las características clínico-biológicas y los patrones citogenéticos.^11-13 Los estudios de citogenética convencional demuestran que 40% a 50% de los casos con LLC/LLP presentan alteraciones cromosómicas clonales,^14,15 entre las que la trisomía 12 es la anomalía numérica más comúnmente descrita (7% a 25%), seguida por alteraciones estructurales de los brazos largos de los cromosomas 13 (20%) y 14 (4%).^15-17 No obstante, con la introducción de las técnicas citomoleculares se incrementa ampliamente la sensibilidad del análisis citogenético, se detectan alteraciones en el 80% de los casos, y se modifica además el orden de incidencia de las alteraciones: deleción 13q14 (50%-60%), deleción 11q22-q23 (20%-40%), trisomía 12 (10%-> 30%), pérdida monoalélica de 17p13 (7%-17%), lugar donde se ubica el gen TP53, y deleciones en 6q (6%). Aproximadamente el 20% de los pacientes presentan cariotipo normal, sin los rearreglos genómicos descritos con anterioridad.¹⁸
Asimismo, se sabe que los casos de LLC/LLP con deleción en 13q14 sola tienen mejor pronóstico que los pacientes con cariotipo normal, la presencia de trisomía 12 se encuentra asociada con pronóstico intermedio, en tanto que las deleciones o los rearreglos, o ambos, que involucren 11q22-q23 y 17p13 muestran en común un curso clínico adverso y corta supervivencia.^11,18,19
Si bien se conocen los rearreglos genómicos más frecuentes no es claro aún el proceso de desregulación génica que da origen a la LLC/LLP, por lo que resulta de importancia dirigir las investigaciones hacia la búsqueda de nuevas alteraciones que permitan establecer asociaciones más precisas entre las anomalías cromosómicas y las características clínico-biológicas de esta patología. En el presente trabajo, centramos nuestro interés en el análisis de los rearreglos estructurales de los cromosomas 2, 12 y 17, se describien 4 anomalías cromosómicas nuevas y se efectúa una exhaustiva revisión de la literatura.
Materiales y métodos
En nuestra institución fueron estudiados 92 pacientes con diagnóstico de LLC/LLP durante el período 1993-2003. El 5.3% (5/92) de los casos (cuatro varones y una mujer; edad media 59 años; intervalo 50-70 años) presentaron rearreglos estructurales nuevos que involucraban los cromosomas 2, 12 y 17. La Tabla 1 detalla edad, sexo, tipo de muestra analizada, respuesta al tratamiento y supervivencia correspondientes a cada caso. Sus características hematológicas fueron previamente descritas.²⁰



Dos pacientes (Casos 2 y 5) presentaron perfiles clínicos, inmunofenotípicos e histopatológicos compatibles con LLP,^21,22 en tanto que los tres casos restantes (Casos 1, 3 y 4) reunieron los criterios para LLC.²³ El Caso 1 fue un linfoma compositum que desarrolló enfermedad de Hodgkin (subtipo: celularidad mixta) 19 meses después del diagnóstico de LLC, mostrando el perfil inmunofenotípico característico de linfocitos B y de células de Reed-Stemberg (RS).
Los estudios citogenéticos y de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) fueron realizados al diagnóstico o previamente al tratamiento en los Casos 2, 3 y 4; luego de varios esquemas quimioterapéuticos, en el Caso 5, y al diagnóstico y 19 meses después, en el Caso 1. El 80% (4/5) de los pacientes habían fallecido al momento de este estudio.
El análisis cromosómico fue realizado en cultivos de corto término (24-48 hs) de médula ósea (MO) o biopsia de nódulo linfático (BNL) o ambos, en medio F-10 suplementado con suero fetal bovino al 15%, empleándose bandeo GTG (bandas G con tripsina y coloración con Giemsa) y la nomenclatura ISCN²⁴ para la identificación y descripción de las anomalías cromosómicas. Este estudio se complementó con FISH mediante el empleo de sondas del pintado total de los cromosomas, centroméricas y específicas para locus, siguiendo los protocolos estándar.
Resultados
La Tabla 1 muestra los estudios citogenéticos y citomoleculares correspondientes a los cinco pacientes estudiados. Cuatro casos presentaron rearreglos estructurales del cromosoma 17 y un caso una translocación compleja que involucraba al cromosoma 12.
El Caso 1 presentó un cromosoma seudodicéntrico psu dic(17;2)(p11.2;p21) como única anomalía citogenética. Asimismo, los estudios de hibridación in situ revelaron la presencia del virus de Epstein Barr (EBV) en las células de RS, en tanto que las células de la LLC/LLP fueron negativas.
Los Casos 2 y 3 mostraron la misma translocación t(2;17)(p21q23), asociada a trisomías 12 y 17 y monosomía 10 (Caso 2) y a del(11)(q23) (Caso 3).
Los Casos 4 y 5 presentaron cariotipos complejos que incluyeron el der(17)t(12;17)(q13;q25) (Caso 4) y un rearreglo complejo t(5;12;19)(q15;p11;q13) (Caso 5).
Discusión
En este estudio se describen 5 pacientes con LLC/LLP que presentaron rearreglos cromosómicos estructurales no publicados previamente en la literatura. El cromosoma 17 estuvo involucrado en cuatro de ellos, en 3 de los cuales el cromosoma 2 fue el cromosoma partner, mientras que el caso restante presentó una translocación compleja que comprometía el brazo corto del cromosoma 12.
En el Caso 1 se observó un cromosoma seudodicéntrico: psu dic (17;2)(p11.2;p21) como única anomalía, dando origen a una deleción monoalélica del gen TP53. Es interesante remarcar que en las neoplasias hematológicas los cromosomas seudodicéntricos se observan con menor frecuencia que los cromosomas dicéntricos y, en particular, su hallazgo es un evento raro en LLC/LLP, siendo el dic(17;18)(p11;p11) o der(17;18)(q10;q10) el más frecuente en esta patología, con 11 casos publicados.²⁵ Específicamente, la participación de los cromosomas 2 y 17 en la formación de este tipo de aberraciones es sumamente infrecuente, se encontró una sola referencia previa en la literatura, con diferentes puntos de ruptura que los observados en nuestro paciente²⁶ (Tabla 2). Distintos trabajos mostraron que las deleciones del gen TP53 tiene fuertes implicancias en el curso clínico de la enfermedad, con una supervivencia media significativamente más corta, estadio clínico avanzado y resistencia a la quimioterapia.^18,19 Estos hallazgos están en concordancia con nuestro caso, que mostró progresión de la enfermedad y una clara falta de respuesta a los diferentes esquemas quimioterapéuticos empleados (agentes alquilantes, antraciclinas y análogos de las purinas). Además, 19 meses después del diagnóstico inicial de LLC/LLP, la paciente contrajo enfermedad de Hodgkin (EH) con positividad para EBV. Se sabe que aproximadamente el 3% al 10% de los casos de LLC/LLP evolucionan a un linfoma B difuso de células grandes (LBDCG), proceso conocido como síndrome de Richter.²⁷ En un pequeño número de casos se produce una transformación a un componente con características de EH con el fenotipo característico de las células de RS.^28-30 Es interesante destacar que los pacientes con LLC/LLP tienen un riesgo 8 veces mayor de desarrollar EH,³¹ que es una de las neoplasias secundarias más frecuentes en esta entidad. Existen evidencias de que las células de RS representan poblaciones clonales de linfocitos B derivadas del centro germinal. En muy pocos casos, el análisis de clonalidad de las células correspondientes a LLC y a EH resultaron en la detección del mismo rearreglo clonal del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, indicando que ambas derivaban de la misma célula B precursora. Esta situación sugeriría la presencia de eventos moleculares diferentes en el precursor común que llevarían a la aparición de dos poblaciones celulares con capacidad de expansión clonal. Sin embargo, en un alto porcentaje de casos, las células de RS positivas para el EBV no están genéticamente relacionadas con el clon tumoral de la LLC, lo que indica que el EBV podría tener un papel importante en el desarrollo de la EH, situación que es sugerida para nuestro paciente.^32-34



Tres casos presentaron anomalías del brazo largo del cromosoma 17. Dos pacientes mostraron la t(2;17)(p21;q23), la cual podría representar una nueva anormalidad cromosómica recurrente en LLC/LLP. Uno de ellos se encontraba fallecido al momento de este estudio, en tanto que el otro paciente está vivo y en remisión parcial. Es interesante remarcar que éste fue el único rearreglo balanceado del cromosoma 17 observado en nuestra serie. Este hallazgo resulta de importancia, no sólo por la recurrencia, sino porque las translocaciones balanceadas son, en general, anomalías muy poco frecuentes en esta patología y usualmente involucran alguno de los genes de inmunoglobulinas.²⁵ En particular, sólo han sido publicadas hasta el presente, tres translocaciones que involucrando los cromosomas 2 y 17, una balanceada y dos desbalanceadas, ninguna recurrente^26,35,36 (Tabla 2). Si bien la LLC/LLP es considerada una enfermedad genéticamente estable, diferentes estudios indicarían que la evolución clonal no es infrecuente en estos pacientes y que estaría asociada con enfermedad progresiva o avanzada.³⁷ Ambos pacientes mostraron evolución cariotípica y el Caso 3 mostró deleción de 11q23, región donde se localiza el gen ATM. Dicha deleción es considerada como una de las alteraciones cromosómicas más comunes, después de las aberraciones de 13q, encontrándose asociada con enfermedad agresiva con cariotipo inestable. Estos pacientes tienen un cuadro clínico característico, con presentación de la enfermedad a una edad más temprana, con estadios avanzados y linfoadenopatías extensas.^11,18,37 Un estudio reciente³⁸ muestra que esta anomalía podría ser adquirida durante el curso de la enfermedad, algunas veces se la encuentra asociada con una progresión clínica abrupta. En coincidencia con estos datos, al momento de nuestro primer análisis, el paciente se encontraba con progresión de la enfermedad, caracterizada por cortos intervalos libres de tratamiento, linfocitosis progresiva y aumento de las adenopatías, luego de 4 años de enfermedad estable.
Este estudio también muestra que el cromosoma 2 con punto de ruptura en p21 es el cromosoma partner más frecuentemente involucrado en rearreglos de ambos brazos del cromosoma 17, generando tanto anomalías simples como dicéntricas. En este aspecto la literatura documenta que los cromosomas 2, 4, 8, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20 y 22 son los más comúnmente implicados en rearreglos del cromosoma 17, con baja frecuencia de dicéntricos.²⁵ Las bandas 2p21-22 se encuentran frecuentemente rearregladas en pacientes con leucemias y neoplasias linfoides,²⁵ región donde, es de destacar, fueron mapeados el gen supresor de tumor de la proteína quinasa activada por RNA doble cadena (PKR)³⁹ y el gen MSH2 de reparación de errores de apareamiento.⁴⁰
El caso restante con anomalía de 17q presentó una translocación desbalanceada: der(17)t(12;17)(q13;q25), como parte de un cariotipo complejo. Este paciente tuvo un curso clínico adverso y murió debido a progresión de la enfermedad. En la literatura hay descritos once rearreglos que involucran ambos cromosomas (Tabla 2), de los cuales 3 son translocaciones balanceadas sin recurrencia,^41-43 y 8, rearreglos desbalanceados, dos de ellos recurrentes^20,26,44-48 (Tabla 2). De los tres pacientes con translocaciones que comprendían el brazo largo del cromosoma 17 (Casos 2, 3 y 4), dos mostraron el mismo punto de ruptura en la banda 17q23 y el restante en la banda 17q25. Las anomalías del brazo largo de dicho cromosoma no son frecuentes en pacientes con LLC/LLP, no obstante, el punto de ruptura 17q25 se observa más frecuentemente involucrado que la banda 17q23.²⁵ Por otra parte, una revisión de la literatura (Tabla 2), muestra que en los rearreglos (12;17), el punto de ruptura 17q11 es el más frecuentemente afectado. Recientemente, el gen RAC3 de la guanosina trifosfatasa (GTPasa) fue mapeado en 17q25.3, se reconoce actualmente que las proteínas RAC constituyen un componente necesario de la transformación celular mediada por RAS y relevante para la patogénesis de una amplia variedad de neoplasias.^40,49 Asimismo, en 17q25.1 se ubica el gen DMC1 (downregulated in multiple cancer-1) que produce una proteína integral de membrana, cuya pérdida de expresión se observa en muchas neoplasias.⁵⁰ Por otro lado, las aberraciones estructurales del brazo largo del cromosoma 12 fueron observadas en alrededor del 5% de los casos de LLC/LLP.¹⁴ Varios genes han sido identificados en la banda 12q13, incluyendo MDM2 (mouse double minute 2), que codifica para una proteína de 90-kD que puede unirse e inactivar la proteína p53, promoviendo el desarrollo tumoral. Diferentes estudios documentaron que dicho gen se encuentra sobrexpresado o rearreglado en pacientes con LLC.^51,52 Asimismo, se informó un caso con diagnóstico de LLC típica y t(6;12) resultando en una ruptura en 12q13, lo que sugiere que esta banda portaría un gen específico que, al alterarse, contribuiría a la aparición de esta patología.⁵³
El Caso 5 presentó una translocación compleja t(5;12;19) no descrita previamente. Las translocaciones complejas son rearreglos muy poco frecuentes en este subtipo histológico y corresponden al 2.4% de los casos.²⁵ Particularmente, fueron descritos 8 casos de LLC/LLP con translocaciones complejas que involucran algunos de los tres cromosomas implicados en nuestro paciente (Tabla 2).^17,45,54-58 Los rearreglos del brazo corto del cromosoma 12 son comunes en una amplia variedad de neoplasias hematológicas, particularmente síndromes mielodisplásicos y leucemias agudas. Por el contrario, estos rearreglos constituyen eventos raros en pacientes con LLC/LLP.²⁵ Recientemente se ha propuesto que las aberraciones de 12p podrían ser anomalías primarias en esta patología, y es interesante destacar que uno de los casos publicados con compromiso de 12p tuvo un curso clínico agresivo.⁵⁹ En lo que respecta al cromosoma 19, sabemos que a nivel de 19q13, se localiza el oncogén BCL-3 (B cell lymphoma leukemia) que codifica una proteína de la familia I-κB.^58,60 Esta actúa como coactivadora de los factores de transcripción NF-κB, involucrados en el control del ciclo celular y en la determinación del linaje, y cumple un papel importante en el desarrollo de las células B y en la activación de los linfocitos B y T. Nuestro caso fue refractario a la quimioterapia, y murió debido a una rápida progresión de la enfermedad, 9 meses después del diagnóstico de LLP.
En conclusión, se identificaron 4 rearreglos cromosómicos estructurales, no mencionados previamente en la literatura, de los cuales uno podría representar una nueva anomalía recurrente en LLC/LLP. Estas alteraciones citogenéticas se encontraron asociadas con curso clínico adverso, con enfermedad progresiva y corta supervivencia, lo cual puede ser de importancia en la comprensión de los eventos genéticos asociados con progresión de la enfermedad.
Los autores no manifiestan “conflictos de interés”.

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