ANTIFUNGAL ACTIVITY OF SERTACONAZOLE AGAINST CLINICAL ISOLATES OF DERMATOPHYTE FUNGI

Abstract
Three hundred and nine strains belonging to 11 species of dermatophytes moulds were tested against sertaconazole following mainly the National Committee for Clinical Laboratory Standards (M38-P) for filamentous fungi. However, several important factors such as the temperature (28ºC vs. 35ºC) and time of incubation (4-10 d vs. 21-74 h), have been modified. Sertaconazole was active against all the clinically important dermatophyte moulds involved in human infections tested. Geometric mean MIC of sertaconazole was 0.21 μg/ml with a MIC range of 0.01-8 μg/ml. MIC₅₀ and MIC₉₀ were, respectively, of 0.25 and 1 μg/ml. Sertaconazole showed high activity against Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans and Microsporum canis (geometric means 0.08, 0.13, 0.13 and 0.19 μg/ml respectively). Microsporum audouinii had the lowest susceptibility in the study (geometric mean 0.59 μg/ml). Considering MIC₅₀ and MIC₉₀, these differences were significantly in favour of the activity of sertaconazole against E. floccosum (0.06 and 0.5 μg/ml). Important differences between sertaconazole and fluconazole were observed. MIC₅₀ and MIC₉₀ were respectively of 0.5 and 1 μg/ml while fluconazole was ≥ 16 μg/ml. No resistant isolates to sertaconazole were detected while 4 isolates had a fluconazole MIC ≥ 64 μg/ml and 4 MIC ≥ 32 μg/ml. No evidence of cross-resistance between both antifungals was found.

Key words
Sertaconazole, dermatophyte, antifungal, mycoses

Artículo completo
Introducción
Los hongos dermatofitos afectan los tejidos queratinizados de humanos y animales así como de otros vertebrados. Se comprobó un aumento de este tipo de infecciones, en especial en situaciones de compromiso del estado inmunitario en las que se producen manifestaciones atípicas y lesiones extensas de una mayor gravedad.^1-4 Las dermatofitosis generalmente responden de forma favorable a la terapia antifúngica tópica. El sertaconazol es un derivado azólico (7-cloro-3-[1-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-imidazol-1-il)etoxi-metil]benzo[b]tiofeno) que actúa inhibiendo la biosíntesis del ergosterol produciendo así un daño irreversible en la integridad de la membrana.⁵ Este antifúngico tiene un amplio espectro de actividad sobre levaduras, dermatofitos y también bacterias grampositivas, lo cual le da aplicación en el tratamiento de las infecciones mixtas.^6-15 Sin embargo, la evaluación de la actividad del sertaconazol ante un significativo número de aislamientos de hongos dermatofitos utilizando un método estandarizado, como el propuesto por la NCCLS, no había sido abordado con anterioridad.¹⁶
Materiales y método
Se utilizaron 309 aislamientos humanos, incluyendo 11 especies de hongos dermatofitos (tabla 1). Los hongos fueron identificados y subcultivados en agar patata glucosado (PDA) (Biolife Italiana^TM, Milán, Italia) a 28ºC durante 7-15 días para asegurar su pureza y viabilidad, antes de preparar los inóculos. La cepa Paecilomyces variotti (ATCC 36257) fue incluida en el ensayo como referencia. Las pruebas se realizaron en medio RPMI 1640 (GIBCO BRL, Life Technologies, Izasa, España) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio y tamponado a pH 7.0 con 0.165 M ácido morfolinopropilesulfónico (MOPS) (Sigma, España). Se utilizaron drogas puras de sertaconazol (Centro de Investigación Ferrer, Barcelona, España) y fluconazol (Pfizer, Kent, RU). Las soluciones madres de sertaconazol y fluconazol se prepararon a 1 600 μg/ml con 100% dimetilsulfóxido (DMSO) como disolvente y congeladas a -20ºC hasta su utilización. Las diluciones de los antifúngicos fueron realizadas por medio de diluciones dobles seriadas siguiendo un esquema similar al propuesto por el método de referencia del NCCLS^16,20 y los publicados anteriormente,^17-19 en los que determinadas variables experimentales ya habían sido modificadas para adaptarlas a los requerimientos de los dermatofitos, como la temperatura (28ºC vs. 35ºC) y el tiempo de incubación (4-10 d vs. 21-74 h).¹⁹ Los inóculos se prepararon a partir de cultivos de 7-15 dias en PDA (28ºC). Para ello, las colonias maduras fueron cubiertas con 10 ml de suero fisiológico (0.85%) y se arrastró la superficie con la punta de una pipeta Pasteur. Tras recoger la suspensión, ésta se ajustó espectrofotométricamente (530 nm de longitud de onda) y la transmitancia a 65-70%. Cada suspensión fue diluida 1:50 en RPMI 1 640 para obtener los concentración de inóculo (tabla 1). Finalmente, se colocó 0.01 ml de la dilución 1:100 en los pocillos de placas microtiter de 96 pocillos de fondo Redondo (Soria-Greiner, Madrid, España). Las placas se incubaron posteriormente a 28ºC y fueron observadas diariamente para evaluar la presencia o ausencia de colonias. Las concentraciones utilizadas de sertaconazol fueron de 0.031-16 μg/ml, mientras que las de fluconazol estuvieron entre 0.05 y 64 μg/ml. Las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) fueron las menores concentraciones que mostraron reducción del crecimiento del 50% con respecto a los controles de crecimiento.¹⁹ Se calculó la media geométrica y rangos de las CMI, así como las CMI que inhibieron al 50% y 90% de los aislamientos.



Resultados
La mayoría de los aislamientos ensayados desarrollaron un crecimiento claramente detectable entre los 4-7 días de incubación. Trichophyton mentagrophytes, M. gypseum y T. interdigitale crecieron más lentamente y T. verrucosum y T. violaceum no mostraron crecimiento detectable hasta los 10 dias.
En la tabla 1 se muestra la actividad antifúngica in vitro del sertaconazol frente a las once especies de hongos dermatofitos. La media obtenida fue de 0.21 μg/ml con un rango de concentraciones de 0.01-8 μg/ml; y CMI₅₀ y CMI₉₀ de 0.25 y 1 μg/ml, respectivamente. Un 36.9% de estos aislamientos presentaban sensibilidad reducida al fluconazol.
El sertaconazol fue más activo ante E. floccosum, T. rubrum, T. tonsurans y M. canis (medias geométicas de 0.08; 0.13; 0.13 y 0.19 μg/ml, respectivamente) y menos activo frente a M. audouinii (media geométrica 0.59 μg/ml). Considerando la CMI₅₀ y la CMI₉₀, la diferencia entre estas especies, en cuanto al patrón de sensibilidad al sertaconazol, fue estadísticamente significativa a favor de la actividad del sertaconazol ante E. floccosum (0.06 y 0.5 μg/ml, respectivamente), con respecto al resto de especies que fueron de 1, 2 o 3 diluciones dobles más altas para la CMI₅₀ y 1 o 2 dos diluciones dobles para la CMI₉₀ (tabla 1). No obstante, los rangos de CMI menos homogéneos se obtuvieron ante E. floccosum (0.06-8 μg/ml), mientras que los más homogéneos lo fueron frente a T. violaceum (0.125-1 μg/ml) y M. canis, T. interdigitale o T. tonsurans (0.01-1 μg/ml).
Las medias geométricas de CMI para sertaconazol fueron de 0-41 μg/ml y CMI₉₀ de 1 μg/ml para sertaconazol, mientras que frente a fluconazol las CMI fueron ≥ 16 μg/ml. Cuatro aislamientos (3.51%) tuvieron una CMI de fluconazol de ≥ 64 μg/ml y un total de 8 presentaron CMI ≥ 32 μg/ml. Estos 8 aislamientos fueron inhibidos por una concentración de sertaconazol ≤ 1 μg/ml. El sertaconazol fue más activo frente a E. floccosum, T. rubrum, T. verrucosum, T. tonsurans y M. canis de una reducida sensibilidad a fluconazol (media geométrica de 0.07; 0.19; 0.25; 0.35 y 0.27 μg/ml, respectivamente). Esta tendencia se invirtió en el caso de M. audouinii o T. schoenleinii, que fueron más sensibles al fluconazol (media geométrica 0.89 y 1 μg/ml). Considerando la CMI₅₀ y la CMI₉₀, estas diferencias fueron también significativas a favor de la actividad del sertaconazol en comparación con la del fluconazol (CMI ≥ 16 μg/ml) frente a todos los aislamientos.
Discusión
Con el objeto de perfeccionar un método de referencia para el estudio de la sensibilidad antifúngica de hongos dermatofitos se introdujeron variaciones y adaptaciones al método de referencia del NCCLS para hongos filamentosos oportunistas. Estos cambios afectan sobre todo las condiciones de incubación (temperatura y período), preparación y tamaños de inóculo y medios de cultivo, entre otros.^17,20-26 La variabilidad de los distintos resultados obtenidos por diferentes investigadores se debe seguramente a las importantes divergencias metodológicas utilizadas. Algunas de estas condiciones difieren mucho de las recomendadas por el método del NCCLS para hongos filamentosos.¹⁶
En este estudio el sertaconazol mostró buena actividad ante los hongos dermatofitos, entre ellos los de mayor relevancia clínica. La media geométrica obtenida en este estudio fue inferior a la anteriormente descrita por nosotros⁸ sobre un número inferior de aislamientos y utilizando condiciones experimentales diferentes. En este sentido, estamos en condiciones de aportar datos de sensibilidad utilizando variables experimentales obtenidas por medio de un método estandarizado y descrito anteriormente que, además, es superior a la obtenida por otros antifúngicos azólicos.^8,10 T. rubrum, que es una de las especies de mayor prevalencia y con mayor tasa de recidivas, resultó ser más sensible al sertaconazol que otras especies como T. mentagrophytes, M. canis y M. gypseum. De este modo, la actividad del sertaconazol frente a dermatofitos de tipo antropofílico es importante en comparación con la actividad de éste frente a otros géneros y especies.
Los datos obtenidos en este estudio demuestran que el sertaconazol es muy activo en condiciones estandarizadas frente a un importante número de aislamientos de hongos dermatofitos. Por otro lado, el sertaconazol resultó más activo que el fluconazol. Si bien hay una clara dependencia del género y la especie ensayados, no se obtuvieron resistencias al sertaconazol, a diferencia de lo observado con el fluconazol, ya que cerca de 36% de estos aislamientos presentaban sensibilidad reducida a fluconazol.
En conclusión, el sertaconazol es activo en concentraciones de 1 μg/ml (CMI₅₀) y su acción se demostró ante a todas las especies de mayor importancia clínica, que a su vez tenían reducida sensibilidad al fluconazol. Su actividad se desarrolla en concentraciones que son inferiores a aquellas que se pueden alcanzar tras la aplicación tópica, la cual excede la CMI. Además, el elevado tiempo de retención en el estrato córneo favorece esta actividad por tiempo prologado.²⁷ Todo ello, junto a otras propiedades del sertaconzol, como su capacidad antiinflamatoria,²⁸ buena tolerancia²⁷ y actividad antibacteriana,¹⁴ pueden explicar los excelentes resultados obtenidos con formulaciones dérmicas en los ensayos clínicos llevados adelante, pudiendo predecir su utilidad terapéutica.¹⁵Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo

1. Berger AR. Common superficial fungal infections in patient with AIDS. Clin. Infect. Dis. 1996;22:128-132.
2. Macura A. Dermatophytes, pathogens or saprophytes. Int. J. Dermatol. 1995;34:529-530.
3. Pontón J, Rüchel R, Clemonds KV y cols. Emerging pathogens. Med. Mycol. 2000;38:225-236.
4. Ray MC, Gately LE. Dermatology manifestations of HIV infection in AIDS. Infect. Dis. Clin. North. Am. 1994;94:583-605.
5. Agut J, Palacín C, Sacristán A, y cols. Inhibition of ergosterol synthesis by sertaconazole in Candida albicans. Arzn. Forsch. 1992;42:718-720.
6. Agut J, Palacín C, Salgado J, y cols. Direct membrane-damaging effect of sertaconazole on Candida albicans as a mechanism of its fungicidal activity. Arzn. Forch. 1992;42:721-724.
7. Carrillo-Muñoz AJ, Torres-Rodríguez JM. In vitro antifungal activity of sertaconazole, econazole and bifonazole against Candida spp. J. Antimicrob Chemother. 1995;36:713-726.
8. Carrillo-Muñoz AJ, Tur-Tur C. Comparative study of antifungal activity of sertaconazole, terbinafine and bifonazole against clinical isolates of Candida spp., Cryptococcus neoformans and dermatophytes. Chemother. 1997;43:387-392.
9. Carrillo-Muñoz AJ, Tur C, Torres J. In vitro activity of sertaconazole, bifonazole, ketoconazole and miconazole against yeasts of the Candida genus. J. Antimicrob. Chemother. 1996;37:815-819.
10. Drohuet E, Dupont B. In vitro antifungal activity of sertaconazole. Arzn Forsch 1992;42:705-710.
11. Palacín C, Sacristán A, Ortiz JA.In vitro activity of sertaconazole. Arzn. Forsch 1992;42:699-705.
12. Palacín C, Tarragó C, Sacristán A, y cols Antifungal Activity of sertaconazole in the cutaneos retention time test. J Mycol. Med. 1995;5:35-39.
13. Palacín C, Tarragó C, Agut J y cols. In vitro activity of sertaconazole, fluconazole, ketoconazole, fenticonazole, clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginal yeast isolates. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2001;23:61-64.
14. Prats G, Mirelis B, Palacín C y cols. Actividad antibacteriana in vitro de sertaconazol. Rev Esp Quimioter. 1995;8:325-326.
15. Torres J, Márquez M, Camps F. Sertaconazole in the treatment of mycoses: from dermatology to gynecology. Int J Gynaecol Obstet. 2000;71;Suppl 1:S3-20.
16. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi: approved standard. NCCLS document M38-A. National Committee for Laboratory Standards, Wayne, Pa.
17. Fernández-Torres B, Vázquez-Veiga H, Llovo X y cols. In vitro susceptibility to itraconazole, clotrimazole, ketoconazole and terbinafine of 100 isolates of Trichophyton rubrum. Chemotherapy. 2000;46:390:394.
18. Fernández-Torres B, Carrillo AJ, Martín E y cols. In vitro activities of 10 antifungal drugs against 508 dermatophyte strains. Antimicrob. Agents. Chemother. 2000;45:2524-2528.
19. Fernández-Torres B, Cabañes FJ, Abarca L y cols. Collaborative evaluation of optimal antifungal susceptibility testing conditions for dermatophytes. Journal of Clinical Microbiology. 2002;40:3999-4003.
20. Brega EF, González G, Fothergill AW y cols. An in vitro evaluation of the new triazole antifungal agents against clinical isolates of dermatophytes in comparison with terbinafine, itraconazole, and fluconazole, abstr. J205, p. 354. In Abstract of the 40^th Intersciencie Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 2000.
21. Butty P, Lebecq JC, Mallié M y cols. Evaluation of the susceptibility of dermatophytes to antifungal drugs: a new technique. J. Med. Vet. Mycol. 1995;33:403-409.
22. Jessup CJ, Warner J, Isham N y cols. Antifungal susceptibility testing of dermatophytes: Establishing a medium for inducing conidial growth and evaluation of susceptibility of clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 2000;38:341-344.
23. Meletiadis J, Meis JF, Mouton JW y cols. Comparison of NCCLS and 3-(4,5-dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) methods of in vitro susceptibility testing of filamentous fungi and development of a new simplified method. J Clin Microbiol 2000;38:2949-2954.
24. Mock M, Monod M, Baudruz-Rosselet F y cols. Tinea capitis dermatophytes: susceptibility to antifungal drugs tested in vitro and in vivo. Dermatology. 1998;197:361-367.
25. Norris HA, Elewski BE, Ghannoum MA. Optimal growth conditions for the determination of the antifungal susceptibility of three species of dermatophytes with the use of a microdilution method. J. Am. Acad. Dermatol 1999;40: S9-S13.
26. Wildfeuer A, Seidl HP, Paule I y cols. In vitro evaluation of voriconazole against clinical isolates of yeasts, moulds and dermatophytes in comparison with itraconazole, ketoconazole, amphotericin B and griseofulvin. Mycoses 1998;41:309-319.
27. Grau MT, Romero A, Sacristán A y cols. Dermal tolerance and phototoxicity studies of sertaconazole. Arzn Forsch. 1992;42:746-7.
28. Agut J, Tarrida N, Sacristan A y cols. Antiinflammatory activity of topically applied sertaconazole nitrate. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1996;18:233-4.