Autor: Graciela Raquel Elso de Berberian Columnista Experto de SIIC Institución: Laboratorio de Biofísica Instituto de Investigación Médica "Mercedes y Martín Ferreira" INIMEC-CONICET Artículos publicados por Graciela Raquel Elso de Berberian

Conclusión breve
La modulación del intercambio Na⁺/Ca²⁺ por Mg-ATP en membranas plasmáticas de cerebro bovino es más comparable a la observada en membranas de sarcolema cardíaco de la misma especie.

Resumen

El intercambiador Na⁺/Ca²⁺ es una proteína intrínseca de la membrana plasmática de las células animales. Puede introducir o eliminar Ca²⁺ de las células por intercambio con Na⁺, dependiendo del gradiente de sodio. Es electrogénico, asimétrico y regulado por ligandos intracelulares y extracelulares (ATP, H⁺, Na⁺, Ca²⁺, fosfoarginina, fosfolípidos). Se comunicaron marcadas diferencias estructurales y funcionales para el intercambiador Na⁺/Ca²⁺, según el tejido, la especie de origen o ambos. El Mg-ATP activa el intercambio Na⁺/Ca²⁺ en vesículas de corazón (K_0.5 500 μM) y cerebro bovino (K_0.5 336 μM). A diferencia de lo observado en nervio de calamar (i) ese efecto de ATP no necesita ningún componente citosólico y está presente en vesículas preparadas y/o ensayadas a fuerza iónica baja (mamíferos, 160 mM) o alta (animales marinos, 300 mM); (ii) no es estimulado por los fosfágenos (fosfoarginina y fosfocreatina); (iii) la activación por ATP esta relacionada con la síntesis de polifosfoinosítidos, como en el intercambiador de corazón. El intercambiador Na⁺/Ca²⁺ cardíaco une PtdIns-4,5-P₂ y esa cantidad unida varía con MgATP, en paralelo con la estimulación del intercambio. Estos resultados indican que las diferencias en la regulación metabólica del intercambio Na⁺/Ca²⁺ en nervio de calamar y cerebro bovino, representan diferencias entre especies.

Palabras clave
Intercambio Na⁺/Ca²⁺, ATP, cerebro bovino, fosfoinosítidos, fosfágenos

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Especialidades
Principal: Bioquímica, Neurología, 
Relacionadas: Medicina Interna, 

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Graciela E. Berberián. CC 389 Córdoba, 5000 Argentina

Patrocinio y reconocimiento
Agradecimientos: Apoyado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (FONCYT PICT03/ 05-12397) y la Agencia Córdoba Ciencia (181/01). G. B. es miembro de la Carrera del Investigador del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas de Argentina (CONICET). S. G. R. es investigador asociado al laboratorio de Biofísica del IMMF.

METABOLIC REGULATION OF BRAIN Na⁺/Ca²⁺ EXCHANGE

Abstract
The Na⁺/Ca²⁺ exchanger couples movement of Na⁺ and Ca²⁺ across the plasma membrane of most animal cells. Several intra- and extra-cellular ligands ( Ca²⁺, H⁺, Na⁺, K⁺, ATP, phosphoarginine, phospholipids) modulate the function of this exchanger. Mg-ATP activates the Na⁺/Ca²⁺ exchanger in membrane vesicles from bovine heart (K_0.5, 500 μM) and brain (K_0.5, 336 μM). As a difference with the squid nerve this effect has no need of any cytosolic component. Also, stimulation is the same in bovine brain vesicles prepared and/or assayed at mammals (160 mM) or marine animals (300 mM) ionic strength. Other differences between squid and bovine brain are: (i) bovine brain Na⁺/Ca²⁺ exchanger is not stimulated by phosphagens, either phosphoarginine or phosphocreatine and (ii) in bovine brain stimulation by MgATP is related to the production of poly-phosphatidylinositides. In this regard bovine heart and brain Na⁺/Ca²⁺ exchangers behave similarly. Cardiac Na⁺/Ca²⁺ exchanger binds PtdIns-4,5-P2 and MgATP regulates that binding in the same direction of Na⁺/Ca²⁺ fluxes. These results indicate that metabolic regulation of the squid and mammalian nerve Na⁺/Ca²⁺exchangers are not alike and represent differences between species.

Key words
Na⁺/Ca²⁺ exchange, ATP, bovine brain, phosphoinositides, phosphagens

Artículo completo
El intercambio Na^+/Ca²⁺ de células animales
El calcio iónico intracelular desempeña una función central en la cascada de señales actuando como segundo mensajero. Así, durante la activación celular, se produce un aumento rápido y transitorio de la concentración citoplasmática de calcio iónico que en algunos casos puede pasar de 0.01-0.1 μM en reposo a 10-300 μM. Las células poseen mecanismos específicos para remover Ca²⁺ desde el citosol, entre los que se encuentra el intercambiador Na⁺/Ca²⁺. Debido a su alta capacidad de transporte, este mecanismo cumple un papel fundamental allí donde tienen lugar cambios importantes de la concentración de calcio iónico intracelular [Ca²⁺]_i tales como las sinapsis nerviosas y en la región subsarcolemar de células cardíacas.
En la mayoría de los tejidos de origen animal, tanto en vertebrados como en invertebrados, se identificaron intercambiadores Na⁺/Ca²⁺.^1-3 En general, movilizan Ca²⁺ en una dirección a través de la membrana plasmática en intercambio por 3 o 4 Na⁺ que se mueven en dirección opuesta.^4,5 El primer intercambiador Na⁺/Ca²⁺ fue clonado en 1990 a partir de corazón de perro.⁶ Desde entonces se determinó que los transportadores Na⁺/Ca²⁺ de mamífero comprenden una familia multigénica de proteínas con tres isoformas NCX1,^6,7 NCX2⁸ y NCX3,⁹ que comparten entre sí 68% a 75% de homologia. Su distribución es diferente según el tipo de tejido: NCX1 es expresado en mayor proporción en músculo cardíaco y en menor proporción en riñón, retina, cerebro y músculo; en cambio, NCX2 y NCX3 están presentes principalmente en cerebro y músculo esquelético.¹⁰ En invertebrados, dentro de la familia NCX se clonaron al menos tres transportadores: uno, presente en nervio de calamar (NCXQ1);¹¹ otro, de Drosophila (Calx),¹² y un tercero, de C. Elegans.¹²
La topología de los transportadores de la familia NCX pudo determinarse por análisis de hidropatía, accesibilidad de cisteínas y marcado de epitopes. Estas proteínas tienen 9 segmentos transmembrana (STM) agrupados en dos partes separadas por una gran asa citoplasmática hidrofílica ubicada entre los STM5 y STM6. Cada una de estas dos regiones presenta alta homología intramolecular y está orientada hacia lados opuestos de la membrana.¹³ El asa citosólica central de la molécula abarca más de la mitad de la proteína y en ella se ubican sitios que tienen relación con la regulación de la actividad del intercambiador.^1,14-17
Activación metabólica del intercambio Na⁺/Ca²⁺ por Mg-ATP en diferentes tejidos y especies
Muchos transportadores y canales iónicos presentan mecanismos de regulación dependientes de ATP.¹⁸ La regulación de la función de proteínas por fosforilación reversible es reconocida como un mecanismo clave en el control de muchos procesos celulares. Así, existen evidencias de que el Mg-ATP estimula el contratransporte Na⁺/Ca²⁺ tanto en axón de calamar¹⁹ como en diferentes preparaciones de miocardio;^20-22 y aunque esta estimulación es importante, el ATP no es un requerimiento esencial para la actividad. En todas las preparaciones, el Mg²⁺ intracelular es un requerimiento absoluto, lo cual indica que el nucleótido actúa mediante eventos de fosforilación, aunque el mecanismo involucrado parece ser diferente entre especies y también según el tejido, aun en la misma especie.
Recientemente, Di Polo y Beaugé,²³ presentaron una recopilación de la información sobre las similitudes y diferencias en la regulación por ATP del intercambio Na⁺/Ca²⁺ basados en estudios realizados en los dos modelos experimentales: corazón de mamífero y nervio de calamar. En ambos sistemas el contratransporte tiene características comunes entre las cuales se destacan: (1) es imprescindible la unión de Ca²⁺ a un sitio intracelular regulador para la funcion, (2) el Mg-ATP estimula el transporte e induce marcado incremento en la afinidad del sitio regulatorio para Ca²⁺; (3) los efectos del Mg-ATP son pequeños o nulos en ausencia de Na⁺ citosólico. Entre las diferencias podemos decir que la estimulación del intercambio por Mg-ATP en nervio de calamar requiere la presencia de un factor citosólico proteico de alrededor de 13 kD.²⁴ Ninguno de los inhibidores de quinasas (treonina y serina) o fosfatasas conocidos modifica el efecto de MgATP. Sin embargo, es sensible a la acción de fosfatasas inespecíficas, lo que sugiere la participación de un sistema de quinasa(s)-fosfatasa(s). En axón de calamar observamos un efecto estimulador de otro fosfágeno: fosfoarginina (PA), presente en concentraciones milimolares.²⁵ Haciendo un paralelo con vertebrados, este fosfágeno equivale a fosfocreatina, aunque en este caso, éste no es capaz de estimular el intercambiador de corazón bovino.²⁶ En sarcolema cardíaco, la estimulación por Mg-ATP es eliminada por fosfolipasa C específica para fosfoinosítidos (PtdIns-PLC) y es reestablecida por la adición exógena de PtdIns y MgATP o directamente de PtdIns4,5-P2 (ver^{1,16,17,22,23,26-28}). En nuestro laboratorio demostramos que la activación tiene lugar a través de la síntesis rápida de PtdIns4,5-P2 a partir de Mg-ATP y PtdIns4,-P²¹ y que el NCX1 existe en una forma que une PtdIns4,5-P2 y que las modificaciones por ATP de su actividad ocurren en paralelo a los cambios en la cantidad de PtdIns4,5-P2 unido al mismo.²⁹
El intercambiador de cerebro bovino
Las diferencias observadas entre los intercambiadores Na⁺/Ca²⁺ de células nerviosas de calamar y corazón de mamíferos pueden tener más de un origen. Pueden representar diferencias de tejidos, de especies o de ambos, o pueden obedecer a diferencias en la fuerza iónica, en la osmolaridad o en ambas, utilizadas en la obtención o medición de los flujos de los distintos intercambiadores.
Con la finalidad de caracterizar los efectos de Mg-ATP en el intercambiador de cerebro bovino, estudiamos el contratransporte Na⁺/Ca²⁺ en vesículas de membrana plasmática de cerebro bovino y esos datos pudieron compararse con los obtenidos utilizando otras fuentes de la proteína (sarcolema cardíaco y nervio de calamar). Midiendo la captación de [⁴⁵Ca]Ca dependiente del gradiente de sodio, observamos que en vesículas de cerebro bovino y a concentraciones submáximas del ión Ca²⁺ (micromolar), el Mg-ATP produce un incremento de 2 a 3 veces del intercambio Na⁺/Ca²⁺, que pasa de 0.33 ± 0.02 nmol/mg.20s a 1.1 ± 0.07 nmol/mg.20s (n= 6) sin necesidad de la adición de un factor citosólico (por detalles, ver referencias^26,29).
Como mencionamos antes, en los transportadores de nervio de calamar y corazón bovino el Mg-ATP estimula a través de incrementar la afinidad aparente por Ca²⁺ citosólico (aproximadamente 10 veces). Así, a concentraciones de Ca²⁺ saturantes no se observa efecto del nucleótido. En cerebro bovino, el incremento en la afinidad para [Ca²⁺]_i en presencia de 1 mM ATP es de alrededor de 4 veces (el K_0.5 para Ca²⁺ pasa de 0.48 μM a 0.11 μM) pero, a diferencia de los precedentes, un pequeño pero significativo incremento persiste aún a [Ca²⁺]_i saturante (100 μM). En cuanto a la K_m aparente para la activación por ATP del intercambio en cerebro bovino, se determinó como 336 μM a 1 μM de Ca²⁺, la que está en el orden de las observadas para corazón de la misma especie (500 μM) y nervio de calamar (200 μM). Por otra parte, la activación por ATP fue independiente de la fuerza iónica del medio de preparación de las vesículas y del utilizado en la medición de los flujos, observándose efectos semejantes tanto a la fuerza iónica normal para mamíferos (160 mM) como la correspondiente a invertebrados marinos (300 mM), observación que deja de lado la posibilidad de que alta fuerza iónica colabore liberando de la membrana de nervio de calamar el factor citosólico necesario para que ATP actúe, y por ende apoya la idea de la participación de vías diferentes, en cerebro bovino y cerebro de calamar, para el mecanismo de activación del intercambiador por Mg-ATP.
Un dato adicional en esta comparación es que al igual que en corazón de la misma especie y a diferencia del nervio de calamar, el efecto de ATP en cerebro bovino es anulado por acción de una fosfolipasa polifosfoinosítido sensitiva (PtdIns-PLC) y este efecto es reconstituido por el agregado exógeno de PtdIns-4,5-P₂. Por otra parte observamos, en ausencia de ATP, incremento en la captación de Ca²⁺ dependiente del gradiente de Na⁺ con el agregado de PtdIns-4-P, y este efecto se magnifica en presencia de 1 mM ATP. El efecto observado con PtdIns-4,5-P₂, por el contrario, no fue modificado por ATP.
Por último, analizando los efectos de fosfoarginina (fosfágeno natural del calamar) y fosfocreatina (análogo en función a fosfoarginina, en los mamíferos) en el intercambio Na⁺/Ca²⁺ de cerebro bovino observamos que estos fosfágenos no estimulan este sistema, tal como sucede en corazón bovino y diferente de nervio de calamar.
En su conjunto estos resultados señalan que la modulación del intercambio Na⁺/Ca²⁺ por Mg-ATP en membranas plasmáticas de cerebro bovino es más comparable a la observada en membranas de sarcolema cardíaco de la misma especie que a la correspondiente de nervio de calamar, lo que aporta nuevas evidencias a favor de la existencia de mecanismos de regulación distintos entre especies, aunque procedan de tejidos con funciones fisiológicas similares. Por otro lado, el hecho de que los intercambiadores de cerebro y corazón bovino respondan con ligeras diferencias a la regulación metabólica por ATP puede guardar relación con las características individuales de las isoformas presentes en cada tejido, ya que NCX1 es la única isoforma presente en corazón, mientras que en cerebro, si bien NCX1 es mayoritaria, también están presentes las isoformas NCX2 y NCX3 (por referencias ver^1,2).
Los autores no manifiestan conflictos.

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