Autor: Alba Edith Vega Columnista Experto de SIIC Institución: Área Microbiología Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia Universidad Nacional de San Luis Artículos publicados por Alba Edith Vega

Conclusión breve
El medio de cultivo con agregado de extracto de cianobacteria presenta la ventaja de ser fácil de preparar y conservar y evita el uso de productos derivados de animales.

Resumen

El uso de extracto de cianobacteria (EC) como suplemento de medios sólidos y líquidos en reemplazo de suero fetal bovino (SFB) y sangre permite un adecuado crecimiento de Helicobacter pylori. Además, este suplemento nutricional reemplaza el medio de cultivo con tripticasa de soja (TSC), en la conservación en frío de este microorganismo. Once cepas de H. pylori fueron exitosamente subcultivadas en agar Mueller-Hinton (AMH) suplementado con 0.4% de EC (AMH-0.4% EC). Cuando se usó este medio para el aislamiento primario de H. pylori, se obtuvo una menor recuperación (30%) debido al desarrollo de contaminantes. La biomasa final obtenida con caldo Mueller-Hinton suplementado con 0.7% de EC (CMH-0.7% EC) fue significativamente mayor (p < 0.05) para cuatro cepas que con CMH suplementado con 5% SFB (CMH-5% SFB). En la mayoría de las cepas se observó una disminución del 35% en los tiempos de generación cuando se empleó CMH-0.7% EC. En la conservación en frío, los índices de recuperación (IR) obtenidos con EC adicionado de glicerol al 20% (EC-20% G) fueron superiores a los alcanzados con TSC adicionado de glicerol al 20% (TSC-20% G) en todas las temperaturas ensayadas. Además EC presenta la ventaja de ser fácil de preparar y conservar y evita el uso de productos derivados de animales.

Palabras clave
Helicobacter pylori, crecimiento, conservación, cianobacteria

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, 
Relacionadas: Gastroenterología, Infectología, 

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Patrocinio y reconocimiento
Agradecimientos. Los autores agradecen a la Dra. Patricia Gómez y al Dr. Rubén Majul por la obtención de las muestras de biopsia gástrica. Este trabajo fue subsidiado por la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de San Luis. Proyectos 8802 y 9303.

EFFECT OF A CYANOBACTERIAL EXTRACT ON GROWTH AND CONSERVATION OF HELICOBACTER PYLORI

Abstract
The use of a cyanobacterial extract (CE) as nutritional supplement of solid and liquid media replacing fetal calf serum (FCS) and blood or blood derivatives allowed growth of several Helicobacter pylori strains. Similary CE replaced Trypticase soy broth (BTS) in conservation of strains at low temperatures. Eleven H. pylori strains were successfully subcultured in Mueller-Hinton agar (MHA) supplemented with 0.4% CE (MHA-0.4% CE). When this medium was used for primary isolation of H. pylori, only a 30% recovery was obtained due to growth of contaminants. The final biomass concentration obtained with Mueller-Hinton broth (MHB) supplemented with 0.7% CE (MHB-0.7% CE) was statistically higher (p < 0.05) in four strains. The generation time decreased by 35% in all strains when MHB-0.7% CE was used in relation to MHB supplemented with 5% FCS (MHB-5% FCS).The recuperation index (RI) at low temperatures with CE plus 20% glycerol (CE-20% G) was higher than that obtained with BTS plus 20% glycerol (BTS-20% G) at all the temperatures assayed. CE is a nutritional supplement of easy preparation and conservation, that avoids the use of products derived from animals.

Key words
Helicobacter pylori, growth, conservation, cyanobacteria

Artículo completo
Introducción
Helicobacter pylori es una bacteria cuya presencia en la mucosa gástrica está asociada al desarrollo de diversas enfermedades gastroduodenales. El subcultivo de este microorganismo in vitro es difícil de obtener, particularmente en medio líquido, debido a que requiere medios de cultivo suplementados usualmente con suero fetal bovino (SFB) y sangre o sus derivados en medio sólido.^1-4 Estos suplementos encarecen el cultivo y dificultan la posterior purificación debido a la asociación del suero con proteínas celulares y extracelulares, o la posible contaminación con virus del SFB, especialmente con el virus de la diarrea bovina.^5,6 Helicobacter pylori es considerado además una bacteria frágil ya que pocas cepas resisten la conservación a temperaturas bajas o muy bajas,⁷ perdiendo tanto la infectividad como la capacidad de ser cultivadas. Se ha demostrado que durante la conservación en frío sufre una transformación de la forma bacilar viable a la cocoide, considerada como no cultivable. También se ha informado que H. pylori es dañado severamente durante el proceso de liofilización.⁸ Otro inconveniente que presenta la conservación de este microorganismo es la limitada viabilidad de los subcultivos. En medio sólido H. pylori puede soportar desde 4 subcultivos hasta un máximo de 20. dependiendo de la cepa,⁸ éste es un procedimiento que insume tiempo e incrementa el riesgo de contaminación.⁸ Los inconvenientes antes citados dificultan el establecimiento de colecciones de cepas y el estudio de este microorganismo. Se han propuesto diversos suplementos para el cultivo de H. pylori, entre los que se citan suero de caballo,⁴ eritrocitos lisados, hemina,³ extracto de levadura,⁴ peptona,⁴ IsoVitaleX,⁹ Vitox,² almidón,¹ ciclodextrina,⁴ sulfato ferroso más piruvato de sodio (FP) y/o mucina.¹⁰ Si bien algunos aumentan el crecimiento de H. pylori no reemplazan el suero o derivados de la sangre en los medios de cultivo.¹⁰ Por otra parte, existen pocos estudios de investigación sistemática sobre condiciones y medios de conservación en frío de este microorganismo. Diversos autores han propuesto para la conservación de H. pylori desde muestras de biopsias gástricas como de aislamientos clínicos, el uso de tripticasa de soja (TSC), caldo cisteína Albimi, caldo Brucella o leche descremada, adicionados con diferentes concentraciones de SFB, sangre equina (SE), solución de mucina al 10% o glicerol.^11-14
Recientemente se informó que los extractos de cianobacterias o algas pueden reemplazar satisfactoriamente nutrientes en el medio de cultivo, tanto de microorganismos –incrementando su viabilidad¹⁵– como del cultivo de células. Particularmente, las cianobacterias filamentosas se emplean para la obtención de productos de alto valor nutricional tales como aminoácidos, proteínas, polipéptidos y carbohidratos.^15-17
El objetivo de nuestro estudio fue evaluar el empleo de un extracto de cianobacteria (EC) en el cultivo de H. pylori en reemplazo de sangre y SFB, en medios sólido y líquido, respectivamente, y la conservación en frío a diferentes temperaturas, en reemplazo de un medio citado en bibliografía, TSC-20% glicerol.
Materiales y métodos
Cepas y condiciones de aislamiento
Para los estudios de crecimiento en medio sólido y líquido con EC se emplearon 11 cepas de H. pylori aisladas de muestras de biopsia gástrica de pacientes adultos sintomáticos que concurrieron al Servicio de Gastroenterología del Complejo Sanitario San Luis y una cepa obtenida del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de la Princesa, Madrid, España.¹⁸ Para los ensayos de conservación en frío se utilizaron dos cepas de H. pylori HP788 y HP829. En todos los estudios se empleó la cepa NCTC 11638 como cepa de referencia, gentilmente cedida por el Dr. Manuel López-Brea. El cultivo de las muestras de biopsia se realizó en agar Mueller-Hinton (AMH) adicionado con sangre de oveja al 7% (AMH-7% SO) y suplemento antibiótico (vancomicina 10 mg/l, trimetroprima 5 mg/l y polimixina B 2 500 U/l) Merck. Se incubó a 37ºC en atmósfera de microaerofilia provista por una mezcla de gases (O₂ 5%, 10% CO₂ y 85% N₂) durante 7 a 10 días. Para el aislamiento primario en medio AMH-0.4% EC se tomaron muestras de biopsia gástrica de 20 pacientes dispépticos (8 mujeres y 12 hombres). El medio fue suplementado con la misma mezcla antibiótica e incubado en las mismas condiciones indicadas anteriormente. La identificación de los microorganismos se realizó por morfología de las colonias, tinción de Gram y producción de oxidasa, catalasa y ureasa.
Extracto de cianobacteria
Se obtuvo a partir de biomasa de la cianobacteria filamentosa heterocística, Nostoc sp. de acuerdo con Silva y col.¹⁹ La conservación del extracto se realizó a -20ºC o por liofilización.
Medios y condiciones de cultivo
Cultivo en medio sólido: Se empleó EC en concentraciones de 0.4% y 0.6% en reemplazo de SO. La obtención de los inóculos se realizó a partir de cultivos de tres días en AMH-7% SO que fueron resuspendidos en caldo Mueller-Hinton (CMH) a una concentración final de 1-5 x 10⁸ ufc/ml. Un volumen de 0.1 ml de esta suspensión fue subcultivado sobre AMH-0.4% EC y AMH-0.6% EC. Se emplearon las mismas condiciones de incubación indicadas para el aislamiento primario.
Crecimiento en medio líquido: Para el estudio del empleo de EC en reemplazo de SFB los cultivos de nueve cepas de H. pylori¹⁸ se iniciaron con una concentración de 1-3 x 10⁴ ufc/ml y desarrollados en erlenmeyers de 125 ml que contenían 20 ml de CMH suplementado con 0.3, 0.7 y 1% de EC; como medio de referencia se empleó CMH-5% SFB. Los cultivos fueron incubados a 37ºC, durante 120 h y agitados a 200 rpm en atmósfera de microaerofilia. El recuento de los microorganismos se realizó diariamente, por duplicado, sobre AMH-5% SO. La cinética de crecimiento se caracterizó por los siguientes parámetros: período lag (h), por el método de Lodge y Hinshelwood, tiempo de generación (t_g) (h) y concentración de biomasa final (ufc/ml).²⁰
Medios y temperaturas de conservación en frío
Se empleó EC-20% G y un medio citado en bibliografía, TSC-20% G. Se ensayó la conservación en frío de H. pylori a tres temperaturas, 4ºC, -20ºC y -80ºC durante 60 días, empleándose para ello 300 μl de una suspensión de 10⁸ ufc/ml obtenida a partir de un cultivo de tres días en AMH-7% SO.
Indices de recuperación (IR)
Para determinar la recuperación se realizaron recuentos de los cultivos obtenidos a los 15, 30 y 60 días en AMH-7% SO a las 48 h de incubación en las mismas condiciones descritas anteriormente. Los IR se expresaron como porcentajes, donde:



Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos de crecimiento y conservación en frío de las cepas se realizó con los siguientes programas: Statistix versión 6.1 e Infostat versión 0.1, 2004.
Resultados
Cultivo en medio sólido
Todas las cepas de H. pylori aisladas desde muestras de biopsia gástrica en AMH-5% SO fueron subcultivadas satisfactoriamente en AMH-EC, observándose un desarrollo similar en los medios a las dos concentraciones de EC (0.4% o 0.6%) ensayadas. Sin embargo, se obtuvo un menor porcentaje de aislamiento cuando se empleó AMH-0.4% EC, (30% [6/20]) respecto de los obtenidos con AMH-5% SFB (43.3% [9/20]). Este resultado podría atribuirse al mayor desarrollo de contaminantes, especialmente Candida spp., en AMH-0.4% EC aun cuando se utilizó en ambos medios la misma mezcla antibiótica.¹⁸
Cultivo en medio líquido
Los resultados obtenidos en el cultivo en medio líquido suplementado con EC a concentraciones de 0.3, 0.7 y 1% demostraron un aumento significativo (p < 0.05) a la concentración 0.7% respecto de 0.3% en algunas cepas, pero no hubo diferencias significativas con respecto a la concentración de 1% de EC. Por lo tanto se eligió la concentración de 0.7% para los cultivos en medio líquido. No se detectaron períodos lag en las cepas estudiadas por el método de Lodge y Hinshelwood. Los tiempos de generación de las nueve cepas de H. pylori en CMH-0.7% EC estuvieron comprendidos entre 2.39 h a 4.62 h; mientras que en CMH-5% SFB los valores fueron 3.15 h a 4.7 h. En general se observó 35% de disminución en los tiempos de generación cuando se empleó el medio CMH-0.7% EC para todas las cepas, excepto para dos cepas y NCTC 11638, en las que los tiempos de generación fueron similares con ambos suplementos. Para siete cepas de H. pylori las concentraciones celulares finales obtenidas con CMH-0.7% EC fueron más altas que las obtenidas con CMH-5% SFB, pero los incrementos fueron estadísticamente significativos sólo para cuatro cepas.
Conservación en frío
Los resultados obtenidos empleando extracto de cianobacterias para la conservación en frío de cepas de H. pylori fueron presentados en el Congreso Latinoamericano de Biotecnología Algal (CLABA 2004, Bs. As., 25 al 29 de octubre). La conservación a 4ºC permitió la recuperación hasta los 30 días con valores IR entre 10^-4 y 10^-6, dependiendo de la cepa, los IR obtenidos fueron aproximadamente el doble para EC-20% G respecto del TSC-20% G. La recuperación obtenida a -20ºC a los 60 días en EC-20% G fue entre 10 y 20 veces mayor con respecto a TSC-20% G con valores de IR = 41.33 vs. 2 para la cepa HP788 y 33 vs. 3, para la cepa HP829, en EC-20% G y TSC-20% G, respectivamente. En TSC–20% G se recuperaron 2 de las 3 cepas en estudio, mientras que con EC-20% G se recuperó la totalidad de las cepas ensayadas (Tabla 1). A -80ºC se observó un marcado incremento de la recuperación con el uso de EC-20% G (p < 0.05) en todas las cepas y períodos de conservación empleados. Los IR oscilaron entre 100% y 24.4% para EC-20% G y entre 10% y 4.8% en TSC-20% G (Figura 1).





Discusión
Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que EC sustituye completamente el SFB y la sangre, en medio líquido y sólido, respectivamente, a concentraciones inferiores a las comúnmente empleadas para estos suplementos. Además, EC-20% G puede reemplazar completamente el medio TSC-20% G citado en la bibliografía, en ensayos de conservación de H. pylori a bajas temperaturas.
El medio sólido suplementado con EC permitió el crecimiento de todas las cepas de H. pylori ensayadas, demostrando que puede reemplazar satisfactoriamente la sangre o derivados, y que puede ser empleado tanto para el cultivo de cepas adaptadas de laboratorio como para el aislamiento primario de H pylori. En este estudio se obtuvo un menor porcentaje de aislamientos con AMH-0.4% EC debido a que estuvo asociado con mayor contaminación por levaduras, esto indicaría la necesidad de ensayar otros suplementos antibióticos cuando se emplea el medio AMH-EC en aislamiento primario.
En medio líquido suplementado con EC se observaron tiempos de generación similares o significativamente menores (p < 0.05) con respecto al medio de referencia, siendo en general esta disminución del 35%, con excepción de tres cepas, en las que los t_g fueron similares con ambos suplementos. Los valores obtenidos en este trabajo son menores a los informados por otros autores, lo que indica que EC permite crecer a H. pylori a alta velocidad. Estos valores son similares únicamente a los informados para diferentes cepas de H. pylori en cultivos de medios ricos suplementados con FP y mucina.¹⁰ Además, con el suplemento EC se logró un incremento de la biomasa final en nueve de las cepas estudiadas, siendo éste significativo (p < 0.05) para la cepa de referencia NCTC 11638 y una cepa local. Las concentraciones finales de biomasa de H. pylori obtenidas en este estudio empleando EC constituyen los mayores valores informados en la bibliografía.^3,9
Los IR obtenidos con EC-20% G en la conservación en frío fueron superiores a los alcanzados con TSC-20% G en todas las temperaturas ensayadas, siendo marcadamente significativo (p < 0.05) este incremento a -80ºC. Existe poca información en la bibliografía que cuantifique la recuperación de H. pylori en frío, la mayoría de los trabajos consultados están orientados a determinar la recuperación de las cepas pero no la cuantificación de dicha recuperación.^8,11,21 Este trabajo es el primer informe de conservación de H. pylori a 4ºC por un período de 30 días. El incremento de los IR alcanzado con el empleo de EC indica que este suplemento nutricional no sólo reemplaza el SFB, la sangre o los nutrientes en el medio sino que además protege a H. pylori y conserva la viabilidad de este microorganismo.
Los importantes resultados obtenidos en medio suplementado con EC en el cultivo y la conservación a bajas temperaturas de H. pylori pueden atribuirse a la contribución de diferentes nutrientes aportados por el extracto, entre los que se encuentran 16 aminoácidos solubles (35%), proteínas crudas (45.6%), carbohidratos (1.9%), azúcares reductores (2.8%) y diferentes minerales.¹⁸
El uso de medios de cultivo que no requieran la adición de sangre o derivados que permitan un adecuado crecimiento y la obtención de altas concentraciones celulares es importante en el cultivo de H. pylori con el objeto de obtener antígenos, vacunas y enzimas. Además, la conservación de cultivos viables a bajas temperaturas permite el establecimiento de colecciones de cepas para un posterior estudio epidemiológico, genético o de resistencia antimicrobiana. Finalmente el uso de EC tiene la ventaja, respecto de los suplementos convencionales, de su bajo costo, fácil preparación y conservación, y además cumple con la tendencia actual de evitar el uso de productos derivados de animales.
Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo