Autor: Junqueira Rodrigues, Consuelo Columnista Experto de SIIC Institución: Departamento de Cirugía Facultad de Medicina Universidad de São Paulo SP, Brasil Artículos publicados por Junqueira Rodrigues, Consuelo

Conclusión breve
Não observamos nenhuma associação entre IMS e quantidade de redução do leiomioma tratado com GnRH. Houve associação significante entre a presença de LOH dos marcadores D7S515, D7S518 and D7S666 e a maior redução de volume do leiomioma uterino.

Resumen

Apesar das características benignas do leiomioma uterino, anormalidades envolvendo o cromossoma 7 tem sido descritas, sugerindo a existência de gene supressor de tumor nesta região. O efeito de redução do análogo de GnRH sobre o leiomioma uterino é variável e pode estar relacionado em parte ao crescimento autônomo do tumor. O presente estudo verificou a ocorrência da associação entre o efeito de redução do tratamento com análogo do GnRH sobre o leiomioma uterino e a instabilidade de microsatélites (IMS) e perda da heterozigosidade (LOH) dos marcadores D7S471, D7S496, D7S501, D7S515, D7S518 and D7S666. Vinte e nove mulheres nulíparas com leiomioma uterino, com idade variando de 24 to 39 anos, foram submetidas a US para estudo do volume do leiomioma. Elas foram tratadas com goserelina 3.6 mg a cada 28 dias, por 6 meses. Doze pacientes tiveram redução do leiomioma ≤ 36% e as outras 17 tiveram redução > 36%. Todas as pacientes foram submetidas à miomectomia. O DNA extraído do tecido tumoral, embebido em parafina, e do sangue periférico foi amplificado por PCR e submetido à sequenciamento automático. Não observamos nenhuma associação entre IMS e quantidade de redução do leiomioma tratado com GnRH. Houve associação significante entre a presença de LOH dos marcadores D7S515, D7S518 and D7S666 e a maior redução de volume do leiomioma uterino.

Palabras clave
Leiomioma uterino, microssatélite, perda de heterozigosidade, estrógeno, GnRH

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Especialidades
Principal: Genética Humana, Obstetricia y Ginecología, 
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Consuelo Junqueira Rodrigues. Av Dr Arnaldo, 455. Sala 1304. CEP 01246-903. São Paulo-SP, Brasil. Junqueira Rodrigues, Consuelo

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Reconhecimento: Os autores agradecem à FAPESP (Fundação de Amaparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo auxílio financeiro (Processo 01/14052-5).

ASSOCIATION OF LOSS OF HETEROZYGOSITY FROM 7Q22 REGION AND SHRINKAGE OF UTERINE LEIOMYOMA TREATED WITH GnRH AGONIST

Abstract
Despite the benign status of uterine leiomyoma, chromosomal abnormalities involving the chromosome 7 have been described, suggesting the existence of tumor suppressor genes in this region. The shrinkage effect of GnRH agonist on leiomyoma is variable and may be related in part to an autonomous growth. The present study examine the association of the shrinkage effect of GnRH agonist treatment on uterine leiomyomas and microsatellite instability (MSI) and loss of hererozygosity (LOH) with D7S471, D7S496, D7S501, D7S515, D7S518 and D7S666 microsatellite marker. Twenty-nine nuliparous women with uterine leiomyomas, aging from 24 to 39 years old, submitted to US study of leiomyoma volume. They were treated with goserelin 3.6 mg every 28 days for 6 months. Twelve patients had leiomyoma reduction ≤ 36% and the other seventeen had reduction > 36%. All women were submitted to myomectomy. DNA was extracted from tumor paraffin-embedded tissue and matched peripheral blood. The PCR products were submitted to automated sequencer. We didn’t showed any association between MSI and leiomyoma shrinkage. There was a significant association between LOH in D7S515, D7S518 and D7S666 markers and high leiomyoma shrinkage.

Key words
Uterine leiomyoma, microsatellite, LOH, GnRH, oestrogen

Artículo completo
Introdução
O Leiomioma uterino é uma neoplasia benigna de células musculares lisas do miométrio, responsiva aos hormônios ovarianos. O desenvolvimento e o crescimento dos leiomiomas resulta de uma complexa interação entre hormônios esteróides, progestágenos, fatores de crescimento, citocinas e mutações somáticas. Tanto o estrógeno como a progesterona são considerados fatores promotores, estimulando o crescimento do leiomioma.^1-3
O desenvolvimento e o crescimento dos leiomiomas envolvem múltiplos fatores. A história familiar e a raça constituem os mais importantes. Por outro lado, o risco de leiomioma é menor em mulheres com maior número de gestações a termo e usuárias de contraceptivos orais.^4,5
O volume do leiomioma parece estar relacionado a uma série de fatores celulares e extracelulares, entretanto existe uma correlação significante entre os receptores de estrógeno e progesterona e o crescimento do leiomioma.^6,7 Desta forma, pacientes que necessitam um tratamento conservador podem receber agonista do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) para induzir depleção de estrógeno e conseqüente redução do volume do leiomioma.^8,9 Bozzini et al,² assim como Cirkel et al¹⁰ demonstraram uma correlação significante negativa entre a quantidade de células positivas para receptor de estrógeno e a intensidade de redução do volume do leiomioma, em pacientes tratadas com GnRH.
O tumor requer para seu crescimento duas etapas: iniciação e promoção. O estrógeno é considerado o principal promotor, havendo estudos bioquímicos que indicam seu papel na estimulação do crescimento do leiomioma, estando em maior concentração no tumor do que no miométrio adjacente.¹¹
Muitos autores tem demonstrado que administração mensal de agonista do hormônio liberador de gonadotrofina reduz significativamente o tamanho dos leiomiomas uterinos.^12-15 Pacientes portadoras de leiomioma uterino tratados com análogos do GnRH apresentam variação percentual na redução volumétrica do conjunto útero-leiomioma, demonstrando com isso que a substância atua de maneira particular em cada mulher.¹⁶ Bozzini et al² observou redução variável do conjunto útero-leiomioma em mulheres nuligestas tratadas com análogo do GnRH (goserelina).
Friedman et al¹⁶ sugerem que a variação de volume do leiomioma uterino em pacientes tratadas com GnRH parece estar relacionada à redução da matriz extracelular. Já, Rein et al¹¹ propuseram a possibilidade de redução de água da matriz e do número de células. Kalir et al¹⁷ sugerem que a polimerização das fibras colágenas após o tratamento com GnRH, pode causar aumento da concentração de colágeno. Bozzini et al² demonstraram também aumento de colágeno nos leiomiomas que tiveram maior redução de volume após tratamento com GnRH.
A variação nos efeitos hormonais sobre o leiomioma está relacionada em parte ao seu crescimento autônomo. Este crescimento autônomo pode estar relacionado à mutações somáticas que induzem à alterações cromossômicas. Aproximadamente 40% dos leiomiomas exibem anormalidades citogenéticas, sendo mais freqüentes as translocações envolvendo a região 12q15 e as deleções no braço longo do cromossoma 7.^18-24 O significado biológico destas anormalidades cromossômicas, envolvendo o crescimento ou à resposta a drogas ainda não foi definitivamente demonstrada.
A alteração citogenética mais freqüente dos leiomiomas é a deleção 7q22, encontrada em aproximadamente 35% dos casos estudados. Verificaram esta mesma deleção do 7q22 em neoplasias malignas sugerindo que um gene supressor de tumor poderia estar alocado nesta região cromossômica.²³
A análise de deleção cromossômica através de estudos de perda de heterozigosidade de microssatélites tem mostrado melhores resultados que a análise citogenética, pois detecta deleções pontuais. Estudos genéticos moleculares revelaram perda da heterozigosidade de regiões críticas de contenção de gene supressor em leiomiomas. Esta perda caracteriza-se por alteração em regiões de repetições de nucleotídeos, conhecidas como microssatélites, definidas por marcadores como D7S518, D7S471, CULT1. Takahashi et al²⁵ observaram perda de heterozigosidade da região D7S491 em leiomiomas que tiveram maior redução de volume de pacientes tratadas com GnRH.
Apesar das incertezas a respeito de sua real importância no genoma, os STRs têm sido amplamente utilizados como ferramentas em estudos de mapeamento genético, genética de populações, análise de ligação, estudos de evolução e identificação genética.^26,27
Objetivo
O presente estudo teve por objetivo verificar a existência de associação entre anormalidades do cromossomo 7 e a redução volumétrica do conjunto útero-leiomioma de pacientes nuligestas tratadas com análogo do GnRH.Casuistica e método
Casuística
Foram selecionadas 29 pacientes portadoras de leiomioma uterino, com idade entre 20 e 39 anos, que fazem acompanhamento no Serviço de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Estas pacientes foram submetidas ao tratamento com o análogo GnRH (goserelina) por um período de 6 meses, à cada 28 dias, e submetidas a miomectomia no sexto mês, após o tratamento. O volume do conjunto útero-leiomioma foi avaliado por ultra-som, avaliação admissional e ao final do tratamento medicamentoso. Após seis meses de uso de análogo do GnRH (goserelina), constatou-se, pelo ultra-som, diferentes reduções volumétricas do conjunto útero-leiomioma, o que motivou a divisão do grupo de pacientes em 2 subgrupos. A divisão baseou-se na média da porcentagem da redução. Assim, o subgrupo 1, constou das pacientes que tiveram redução igual ou inferior a 36% (tabela 1); o subgrupo 2 constou das pacientes com redução acima de 36% (tabela 2).






O DNA genômico foi extraído dos blocos de parafina contendo leiomioma das pacientes e do sangue periférico, após consentimento livre e esclarecido. Este protocolo de pesquisa foi aprovado pela CAPPesq do HC-FMUSP sob numero 066/02.
Método
Extração de DNA genômico de material parafinado
A extração do DNA genômico de material parafinado foi realizada conforme referido em artigo anterior²⁸ utilizado um kit de extração (Wizard Genomic – Promega).
Extração de DNA genômico de sangue total
Foi coletado 10 ml de sangue periférico de cada paciente, que foi transferido para um tubo de fundo cônico e submetido ao método de extração de DNA genômico conforme descrito por Miller et al.²⁹ O DNA genômico depois de extraído e quantificado foi submetido a avaliação da integridade por eletroforese em gel de agarose 2%.
Tecnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)
Os iniciadores sensi (forward) e anti –sensi (reverse) foram sintetizados pela Invitrogen do Brasil, sendo o iniciador sensi marcado com fluorocromos conforme as seqüências abaixo:
D7S471: 5’CAACATATGCAAGGTGCCTA, 3’AGCAATTCCATAATAGCTGCT
D7S496:5’AACAACAGTCAACCCACAAT, 3’TTTTGGTTTNTTATGGGTTATAGC
D7S501: 5’CACCGTTGTGATGGCAGAG, 3’AGCAGTCTGCCTG GTAAGAAAT
D7S515: 5’GGGAGTTACTACCCTCACTTAATG, 3’CTTTGCTGCCCAGTCC
D7S518: 5’CAGTAGGCAGGGGTGG, 3’GTTGTCACACAGACACACCCC
D7S666:5’GCCTTCTCAGCAAATTGAT, 3’CTCTTTCATTACCTCACA TATCAGG
A reação da PCR foi realizada com a seguinte solução: DNTPs (0.4 U dATP, 0.4 U dCTP, 0.4 U dGTP, 0.4 U dTTP), Buffer 10X, Enzima Taq Platinum 1.5 U, Água Ultra Pura Autoclavada, Primer Forward e Reverse (10 pmol para sangue periférico e para amostras de parafina 50 pmol) e DNA. O sucesso da reação foi verificado em gel de agarose 2% com 0.1% de Brometo de Etídeo, em cuba de eletroforese horizontal e visualizados sob luz ultravioleta. Os programas de PCR utilizados foram semelhantes para o DNA de material parafinado e de sangue periférico em relação à quantidade de ciclos (34 ciclos) e ao tempo de extensão (10 min). O programa variou no tempo de desnaturação que foi de 15’ para material parafinado e de 5’ para sangue periférico e nos tempos de anelamento que foram de 1’30” para material parafinado e de 30” para sangue periférico. As temperaturas utilizadas para anelamento foram: primers D7S496, D7S501 e D7S666: 55ºC; primer D7S515: 53ºC; primers D7S471 e D7S518: 57ºC.
Análise da instabilidade e perda da heterozigosidade de microssatelites
Os produtos de amplificação marcados com fluorocromos foram submetidos a sequenciamento automático MegaBace (Amersham Pharmacia Biotech, USA).
A instabilidade de microssatélites (IMS) foi definida por mudanças de comprimentos dos segmentos de DNA amplificados causados por inserção ou deleção de unidades repetitivas, do tumor em comparação ao tecido normal. Os tumores com IMS em dois ou mais marcadores foram considerados de alta instabilidade, os com um marcador foram considerados de baixa instabilidade e os tumores que não apresentaram IMS em nenhum dos marcadores estudados foram considerados estáveis.
A perda de heterozigozidade foi avaliada nos casos informativos e foi considerada presente quando um dos dois alelos estava completamente ausente no tecido leiomiomatoso ou quando a relação entre a área dos alelos do tecido tumoral com o tecido normal fosse menor que 0.5 conforme descrito por Cawkwell et al.³⁰
Análise estatítica
A comparação entre os dois grupos de pacientes foi realizada através de teste de Exato de Fisher. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio de programa de Estatística (SigmaStat, Jandel Scientific). O nível de significância adotado foi de 5%.
Resultados
Análise dos microssatélites
Através do sequenciamento automático obtivemos os cromatogramas dos marcadores de microssatélites do presente estudo (D7S471, D7S496, D7S501, D7S515, D7S518, D7S666). A análise dos cromatogramas revelou alelos de mesmo tamanho no DNA de sangue periférico, tecido normal, para alguns marcadores de microssatélites estudados. Estes casos foram considerados homozigotos e não informativos (figura 1).
Figura 1Casos que apresentaram presença de dois alelos foram considerados heterozigotos e foram informativos para o estudo. A análise das áreas dos alelos, obtida pelo produto do valor do pico do alelo com o valor da largura do pico, bem como o resultado da relação entre os alelos do tumor com os alelos do tecido normal revelou que em muitos casos os valores obtidos foram maiores que 0.5, portanto nestes casos não houve perda da heterozigosidade. A figura 2 apresenta os cromatogramas obtidos por sequenciamento automático dos produtos de PCR do marcador D7S471 do DNA genômico normal do sangue periférico e do DNA do tecido leiomiomatoso de dois casos informativos, nos quais não houve perda da heterozigosidade. Nestes casos podemos também verificar que o tamanho dos alelos não se modificou no tecido tumoral, portanto estes casos foram considerados estáveis para o marcador estudado. Quando observamos presença de dois alelos que mostraram tamanhos diferentes aos do tecido normal, consideramos estes casos com IMS. A figura 3 exemplifica casos com IMS.
Figura 2Figura 3Os casos em que o produto de PCR do DNA normal e do DNA tumoral, após análise em sequenciamento automático, revelaram ser heterozigotos no tecido normal e apresentaram ausência de um dos alelos no tecido tumoral foram considerados como perda da heterozigosidade (figura 4). Da mesma forma, os casos onde o tecido tumoral apresentaram dois alelos semelhantes ao tecido normal, mas a relação entre as áreas dos alelos foi menor que 0.5, foram considerados casos com LOH. As figuras 5 e 6 exemplificam estes casos com LOH.
Figura 4Figura 5Figura 6Resultados do grupo com redução ≤ 36% do volume útero-leiomioma
Os valores da relação entre os alelos do tecido tumoral com o tecido normal dos 06 microssatélites estudados dos casos que tiveram redução do conjunto útero-leiomioma menor ou igual a 36%, após tratamento com GnRH, estão especificados na tabela 3.



Uma análise global dos casos deste grupo de pacientes revelou pequeno número de casos com LOH, para cada um dos marcadores de microssatélites estudados. Ocorreu LOH em todos os marcadores, entretanto com freqüência baixa: no marcador D7S471 tivemos 20% (2/10) de LOH, no D7S496 tivemos 33% (3/9), no D7S501 22% (2/9), no D7S515 20% (1/5), no D7S518 11% (1/9) e no D7S666 9% (1/11) de LOH dos casos deste grupo.
Estes resultados mostram que, neste grupo de pacientes com redução igual ou inferior a 36%, a LOH foi mais freqüente para os marcadores de microssatélites que incluem um cluster de genes da família DRA (down-regulated in adenoma), DLD (desidrogenase dihidrolipoamide), PRKAR2B (regulação da subunidade RII beta do cAMP-protein kinase dependente) e LAMB1 (laminina B1). O gene DLD é um gene de manutenção, o DRA e PRKAR2B também estão expressos em outros tecidos que não o útero, portanto parecem não estar envolvidos com o leiomioma uterino. O gene LAMB1 pode de alguma forma modificar a matriz extracelular e produzir sinal de proliferação³¹ (Zeng et al 1997).
Observamos que estas pacientes com redução do volume útero-leiomioma ≤ 36% mostraram baixa freqüência de LOH para os microssatélites D7S518, D7S666 e D7S515, que marcam genes da família CUTL1, ou seja, genes supressores de tumor³¹ (Zeng et al 1997).
Analisando a LOH em relação a estas duas famílias de genes do cromossoma 7, CUTL1 (marcadores D7S515, D7S518 e D7S666) e marcadores para DRA, PRKAR2B, DLD e LAMB1 (D7S471, D7S496 e D7S501), observamos que este grupo de pacientes com redução do conjunto útero-leiomioma ≤ 36% apresentaram maior frequencia de LOH (64%; 7/11) para genes que parecem não estar relacionados à supressão de tumor. Pequeno número de pacientes apresentaram LOH (22%, 2/9) nos marcadores da família CUTL1, genes relacionados à supressão de tumor.
Analisando os resultados do grupo de pacientes com redução ≤ 36%, comparamos a proporção de pacientes (2/9) que apresentaram LOH na categoria de marcadores de microssatélites relacionados ao gene CUTL1 (D7S515, D7S518 e D7S666) com a proporção de pacientes (7/11) que apresentaram LOH nos marcadores relacionados a genes pouco expressivos para o leiomioma (D7S471, D7S496 e D7S501). Verificamos não haver diferença estatisticamente significante entre estas duas categorias (p = 0.092) nestas pacientes com redução ≤ 36%.
A análise de IMS dos 06 marcadores de microssatélites do cromossoma 7q22 revelou presença de IMS no marcador D7S471 em 9% (1/11), D7S496 em 50% (6/12), D7S501 em 36% (4/11), D7S515 em 22% (2/9), D7S518 em 36% (4/11) e D7S666 em 33% (4/12) dos casos estudados. Considerando a presença de IMS em todos os 06 marcadores, temos que 58% (7/12) das pacientes deste grupo (redução ≤ 36%) apresentaram alta freqüência de instabilidade, ou seja, apresentaram IMS em 2 ou mais dos 06 marcadores estudados (tabela 3).
Resultados do grupo com redução > 36% do volume útero-leiomioma
Os resultados da relação entre os alelos do tecido tumoral com o tecido normal dos 06 microssatélites estudados das pacientes que tiveram redução do conjunto útero-leiomioma > 36%, após tratamento com GnRH, estão especificados na tabela 4.



Nesta tabela 4 podemos visualizar que um grande número de pacientes apresentou LOH na grande maioria dos microssatélites estudados. Observamos LOH em todos os marcadores, sendo alguns com maior freqüência de casos: no D7S471 tivemos 13% (2/15) de LOH, no D7S496 tivemos 20% (3/15), no D7S501 43% (6/14), no D7S515 43% (6/14), no D7S518 26% (4/15) e no D7S666 40% (6/15) de LOH.
Neste grupo de pacientes com redução > 36%, a LOH foi mais freqüente para o marcador de microssatélite que inclui o gene LAMB1, relacionado à matriz extracelular e principalmente observamos alta freqüência de LOH nos marcadores relacionados à família CUTL1, genes supressores de tumor.
Analisando a freqüência de LOH em relação a estas duas famílias de genes do cromossoma 7, CUTL1 (marcadores D7S515, D7S518 e D7S666) e marcadores para DRA, PRKAR2B, DLD e LAMB1 (D7S471, D7S496 e D7S501), observamos que estas pacientes com redução >36% apresentaram maior frequencia de LOH (75%; 12/16) na família CUTL1, genes relacionados à supressão de tumor. Em relação à outra família observamos também uma freqüência elevada de LOH 53% (9/17), decorrente da alta freqüência de LOH no marcador D7S501.
Analisando os resultados do grupo de pacientes com redução > 36%, comparamos a proporção de pacientes (12/16) que apresentaram LOH na categoria de marcadores de microssatélites relacionados ao gene CUTL1 (D7S515, D7S518 e D7S666) com a proporção de pacientes (9/17) que apresentaram LOH nos marcadores relacionados a genes pouco expressivos para o leiomioma (D7S471, D7S496 e D7S501). Verificamos não haver diferença estatisticamente significante entre estas duas categorias (p = 0.282) nestas pacientes com redução > 36%.
Em relação ao estudo da IMS dos 06 marcadores de microssatélites do cromossoma 7q22, observamos presença de IMS em todos os marcadores: D7S471 em 11% (2/17), D7S496 em 23% (4/17), D7S501 em 41% (7/17), D7S515 em 38% (6/16), D7S518 em 18% (3/17) e D7S666 em 35% (6/17). Considerando a presença de IMS em todos os 06 marcadores, temos que 53% (9/17) das pacientes deste grupo (redução > 36%) apresentaram alta freqüência de instabilidade, ou seja, apresentaram IMS em 2 ou mais dos 06 marcadores estudados. Três casos dos 17 estudados apresentaram baixa IMS, ou seja, apresentaram IMS em um único marcador dos 06 estudados. Cinco casos não apresentaram IMS e foram considerados estáveis para estes marcadores de microssatélites.
Análise comparativa dos resultados entre os grupos estudados
Analisando os resultados da presença de alta IMS (dois marcadores ou mais) e comparando-se, pelo Teste Exato de Fisher, a proporção de pacientes do grupo redução ≤ 36% (7/12) com as pacientes com redução > 36% (9/17), verificamos não haver diferença estatisticamente significante (p > 0.05) das proporções de IMS entre estes dois grupos.
Comparando-se nos dois grupos estudados, pelo Teste Exato de Fisher, a proporção de pacientes que apresentaram LOH em qualquer dos 06 marcadores foi de 9/12 pacientes com redução ≤ 36% e 16/17 pacientes com redução > 36% do conjunto útero-leiomioma após tratamento com GnRH. Verificamos não haver diferença estatisticamente significante (p = 0.279) da proporção de LOH entre estes grupos.
Comparando-se a proporção de pacientes que apresentaram LOH na categoria de marcadores relacionados ao gene CUTL1 (D7S515, D7S518 e D7S666) do grupo redução ≤ 36% (2/9) com as do grupo redução > 36% (12/16), verificamos diferença estatisticamente significante (p = 0.017).
Comparando-se a proporção de pacientes que apresentaram LOH na categoria de marcadores relacionados a genes pouco expressivos para o leiomioma (D7S471, D7S496 e D7S501) do grupo redução ≤ 36% (7/11) com as do grupo redução > 36% (9/17), verificamos não haver diferença estatisticamente significante (p = 0.705).
Analisando a proporção de pacientes que apresentaram 02 ou mais marcadores com LOH com a proporção de pacientes que apresentaram apenas um marcador com LOH, verificamos pelo Teste Exato de Fisher que existe diferença significante (p = 0.040) entre os dois grupos estudados. Assim o grupo com redução > 36% apresentou maior proporção de pacientes com LOH em dois ou mais marcadores.
Discussão
Estudos tem demonstrado que a administração do agonista GnRH, para pacientes com leiomioma uterino, reduz o volume do tumor, o nível dos hormônios ovarianos e alguns fatores de crescimento que são requeridos para o crescimento do tumor.^14,15 Embora o mecanismo pelo qual o agonista GnRH atua no leiomioma uterino ainda não esteja esclarecido, tem sido sugerido a indução de atrofia celular, redução do número de células, provavelmente resultante de apoptose. Evidencias existem a favor do dano celular, degeneração e necrose que contribuiriam para a redução de volume do tumor após tratamento com análogo GnRH.^32,33
Sabe-se que o tratamento com GnRH reduz o fluxo sanguíneo uterino, devido a aumento da resistência vascular.^34,35 A isquemia causa estresse oxidativo que danifica o DNA sendo então ativados os mecanismos de reparo do DNA e de proteção celular.³⁶ Para a maioria das células o estresse oxidativo é subletal e reversível. Entretanto, para células que apresentam dano de DNA a depleção de energia causa morte celular.
Estudos experimentais verificaram uma expressão aumentada da enzima nuclear relacionada ao reparo de DNA: PARP (polimerase poli-ADP ribose) em resposta ao dano oxidativo do DNA. Esta enzima estimula o reparo do DNA, silencia a transcrição para crescimento celular e aumenta a geração de ATP para manter a sobrevivência da célula.³⁷ Uma ativação prolongada de PARP causa um elevado consumo de ATP e em células injuriadas isto promove morte celular por depleção de energia.³⁸ Huang et al³⁹ demonstraram um acúmulo de PARP no leiomioma em comparação ao miométrio e acentuada expressão de PARP, principalmente na porção central do tumor, após tratamento com GnRH.
Em relação aos tumores que apresentam alteração do DNA, poderiamos inferir que os leiomiomas com IMS ou LOH, seriam mais susceptíveis a ação do GnRH, pois o hipoestrogenismoque promove estresse oxidativo, que leva à maior dano do DNA. Desta forma, estes tumores apresentariam uma acentuada expressão da PARP, com função de reparo do DNA, levando a um alto consumo de energia com consequente morte celular. Entretanto, em nosso estudo não verificamos uma associação significante entre leiomiomas com IMS e quantidade de redução dos mesmos. Em relação a presença de LOH, em qualquer dos 06 marcadores estudados, também não obervamos associação com a quantidade de redução do leiomioma após tratamento com GnRH. Takahashi et al²⁵ também não encontraram correlação significante entre LOH e quantidade de redução do leiomioma uterino após tratamento com GnRH. Entretanto, quando selecionamos as pacientes que apresentaram LOH em 03 marcadores relacionados ao gene supressor de tumor (D7S515, D7S518 e D7S666), observamos maior proporção de LOH nas pacientes com redução > 36%, havendo associação significante entre a presença de LOH dos marcadores de genes supressores de tumor e maior redução do leiomioma, após tratamento com GnRH. Estes resultados são a favor de que esta região do 7q22 é crítica para o leiomioma uterino, onde o gene CUTL1 é considerado gene supressor de tumor, com função de suprimir o proto-oncogene c-myc.⁴⁰ Outros autores também verificaram este fato demonstrando expressão reduzida de RNAm do gene CUTL1 nos leiomiomas uterinos.³¹
Outra categoria de microssatélites estudados (D7S471, D7S496 e D7S501), que se encontram na região 7q22, incluim os genes DRA, PRKAR2B e DLD, que são pouco relacionados à tumor ou ao leiomioma uterino.³¹ Ainda nesta região 7q22, junto ao marcador D7S501, encontra-se o gene LAMB1 (laminina B1), que apresenta importante interação entre células malignas e matriz extracelular.⁴¹ Neste contexto, não é muito evidente como a perda de função do gene LAMB1 poderia contribuir para a transformação celular do leiomioma uterino. Nossos resultados demonstraram que as pacientes com menor redução do leiomioma após tratamento com GnRH apresentaram maior frequencia de LOH nestes marcadores pouco relacionados a patogênese do leiomioma. Estes dados sugerem que o estímulo de proliferação destes tumores possa ser diferente e pouco afetado pela ação do GnRH.
Quando correlacionamos os dados do presente estudo com os dados obtidos de estudo prévio, neste mesmo grupo de pacientes,² verificamos que os leiomiomas uterinos com maior redução apresentaram menor quantidade de receptores de estrógeno. Sabe-se que o estrógeno é altamente proliferativo para estas células, assim células com pouco receptor de estrógeno parecem sofrer maior ação do hipoestrogenismo decorrente do tratamento com GnRH.
Cheng et al⁴² demonstraram que a supressão de fatores de crescimento, como o estrógeno, causa lesão no DNA. Quando o DNA é lesado a replicação celular é inibida e o sistema de reparo do DNA é ativado para manter a integridade dos genes e função normal da célula. Assim, a redução de volume do leiomioma após tratamento com GnRH parece ser decorrente do hipoestrogenismo, que promove dano no DNA por isquemia, ativando os mecanismos de reparo, que consomem muita energia, promovendo morte celular. Estes dados vão de encontro com nossos achados de maior proporção de dano do DNA, revelado pela presença de LOH, principalmente nos marcadores relacionados ao gene supressor de tumor, nas pacientes que apresentaram maior redução do leiomioma após tratamento com GnRH.
A favor desta hipótese temos que as pacientes que apresentaram maior redução do leiomioma após tratamento com GnRH apresentaram LOH em 2 ou mais marcadores. Enquanto, as pacientes com menor redução apresentaram LOH em 01 só marcador. Assim, encontramos uma associação significante entre maior dano de DNA e maior redução do leiomioma.
Conclusão
Leiomiomas uterinos com maior número de alterações no cromossoma 7q22 ou alterações na porção ligada ao gene CUTL1 parecem ser mais susceptíveis a ação do GnRH. A base patogenética da diversidade de redução dos leiomiomas uterinos após tratamento com GnRH, parece estar relacionada à quantidade de receptores de estrógeno e ao dano do DNA destas células.
Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo

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