Autor: Hromadnikova, Ilona Columnista Experto de SIIC Institución: Cell Biology Lab 2nd Medical Faculty Charles University Prague, Czech Republic Artículos publicados por Hromadnikova, Ilona

Conclusión breve
El análisis prenatal no invasivo del genotipo fetal estuvo en completa concordancia con el análisis del cordón umbilical. Este método permite tipificar el sexo y la condición Rh en fetos con riesgo.

Resumen

Evaluamos la factibilidad de la tipificación genética del sexo fetal así como de su condición RhD y RhCE mediante el análisis con PCR en tiempo real del ADN fetal extraído de muestras de plasma materno. Entre las semanas 10 y 22 de gestación determinamos el sexo fetal en 39 embarazos cuyos fetos estaban en riesgo de padecer trastornos ligados al cromosoma X; correlacionamos nuestros hallazgos con los resultados obtenidos mediante el análisis de muestras de las vellosidades coriónicas y con los de la amniocentesis, o bien verificamos los datos luego del parto. El análisis en plasma materno del gen SRY (región determinante del sexo en el cromosoma Y) mediante PCR en tiempo real estuvo en completa concordancia con el sexo fetal determinado en las 39 mujeres, cuyos embarazos correspondían a 18 varones y 21 niñas. Analizamos 45 mujeres embarazadas negativas para RhD entre las semanas 11 y 40 de gestación y correlacionamos los resultados con el análisis serológico del cordón umbilical luego del parto. La tipificación genética del exón 7 del RhD, del exón 10 del RhD, del exón 2 del RhCE (alelo C) y del exón 5 del RhCE (alelo E) fetales mediante el análisis no invasivo de muestras del plasma materno se llevó a cabo correctamente en 45/45 mujeres embarazadas negativas para RhD, que posteriormente dieron a luz 24 recién nacidos RhD positivos, 17 RhC positivoas y 7 neonatos RhE positivos. Sugerimos que la amplificación del ADN fetal libre en el plasma materno es un enfoque promisorio para la determinación válida y rápida del sexo fetal así como de su condición RhD y RhCE. Recomendamos realizar tipificación genética no invasiva del RhD y RhCE fetal en las embarazadas negativas para RhD aloinmunizadas para estimar su riesgo de enfermedad hemolítica del recién nacido y determinación del sexo fetal en los embarazos con riesgo de presentar trastornos ligados a X; en estos últimos casos, sugerimos que la práctica de procedimientos diagnósticos invasivos quede restringida exclusivamente a los fetos masculinos.

Palabras clave
ADN fetal, plasma materno, PCR en tiempo real, enfermedad hemolítica del recién nacido, trastornos ligados a X

Clasificación en siicsalud
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Especialidades
Principal: Genética Humana, Obstetricia y Ginecología, 
Relacionadas: Bioética, Diagnóstico por Laboratorio, Medicina Interna, Pediatría, Salud Pública, 

Enviar correspondencia a:
Dr. Ilona Hromadnikova, PhD. Clinic of Paediatrics, 2nd Medical Faculty, University Hospital Motol. V Uvalu 84, 150 18 Prague 5. Czech Republic Hromadnikova, Ilona

Patrocinio y reconocimiento
Agradecimientos: Este proyecto fue respaldado por la 2da. Facultad de Medicina, Universidad Charles, Praga, Nº VZ11130003.

NON-INVASIVE PRENATAL DIAGNOSIS BASED ON THE AMPLIFICATION OF PATERNALLY-INHERETED ALLELES IN MATERNAL PLASMA

Abstract
We assessed the feasibility of fetal sex, RhD and RhCE genotyping by analysis of DNA extracted from maternal plasma samples by using real-time PCR. We determined fetal sex in 39 pregnancies at risk of X-linked disorders from 10^th to 22^nd weeks of gestation and correlated with the results of chorionic villus sampling and amniocentesis or checked after the delivery. SRY real-time PCR analysis of maternal plasma was in complete concordance with fetal sex in all 39 tested pregnant women bearing 18 males and 21 females. We analysed 45 Rh D negative pregnant women within 11^th and 40^th week of pregnancy and correlated the results with serological analysis of cord blood after the delivery. Non-invasive prenatal fetal RhD exon 7, RhD exon 10, RhCE exon 2 (C allele) and RhCE exon 5 (E allele) genotyping analysis of maternal plasma samples was well performed in 45/45 Rh D negative pregnant women delivering 24 Rh D, 17 Rh C and 7 Rh E positive newborns. We suggest that amplification of free fetal DNA in maternal plasma is a promising approach for a valid and rapid fetal sex, RhD and RhCE status determination. We recommend to perform non-invasive fetal RhD and RhCE genotyping in alloimunised Rh D negative pregnancies to evaluate the risk of haemolytic disease of the newborn and fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders with a follow-up of invasive diagnostic procedures restricted to male fetuses only.

Key words
Fetal DNA, maternal plasma, real-time PCR, haemolytic disease of the newborn, X-linked disorders

Artículo completo
Los actuales métodos experimentales no invasivos para el diagnóstico prenatal del sexo fetal usan ADN fetal extracelular libre^1-2 y células fetales^3-5 tomados de la sangre materna. Sin embargo, la infrecuencia con que se encuentran células fetales circulantes en sangre materna así como los requerimientos técnicos necesarios para el enriquecimiento de la sangre materna con el objeto de obtener células fetales, limitan el uso rutinario de esta práctica. Por otra parte, el ADN libre extracelular del feto en el suero o el plasma de la mujer embarazada, parece ser una promisoria alternativa, no invasiva, al menos para la determinación del sexo y de la categoría RhD (dímero D del factor Rh) del feto.^6-9
En este estudio prospectivo determinamos el sexo del feto en embarazadas cuyos hijos eran susceptibles de presentar trastornos ligados al cromosoma X y la condición RhD y RhCE (dímeros C y E del factor Rh) en las embarazadas negativas para el factor RhD, cuyos hijos estaban en riesgo de sufrir enfermedad hemolítica del recién nacido mediante el análisis del ADN en el plasma materno con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.
Material y métodos
Para este estudio se convocó a 39 mujeres que se hallaban entre las semanas 10 y 22 de gestación cuya descendencia era susceptible de presentar trastornos ligados al cromosoma X (29 hemofilias A, 2 hemofilias B, 1 agammaglobulinemia, 1 displasia ectodérmica hipohidrótica, 1 neurofibromatosis, 1 agenesia testicular, 2 distrofias musculares de Duchenne, 1 hidrocefalia y 1 síndrome de Barth). En todos los casos, se obtuvo sangre materna con anterioridad al procedimiento invasivo de diagnóstico prenatal, cuando éste estaba indicado.
También fueron convocadas para el estudio 45 embarazadas Rh negativas que se encontraban entre las semanas 11 y 40 de gestación, incluyendo aquellas aloinmunizadas (1 anti-D, 3 anti-D+C, 1 anti-Kell) cuyos hijos tenían riesgo de sufrir enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN).
En todos los casos del estudio, se obtuvo la aprobación del Comité de Etica Local y el consentimiento informado de todas las participantes.
Extracción del ADN de las muestras de plasma
En tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) se colocaron 10 ml de sangre periférica tomados de las embarazadas y se procesaron por no más de 24 horas. Las muestras de sangre fueron centrifugadas por 10 minutos, primero a 1 200 g (protocolo 1)^8,10 y a 3 000 g (protocolo 2);⁷ las muestras de plasma fueron centrifugadas nuevamente y se recogieron los sobrenadantes para almacenarlos a -80º hasta su procesamiento ulterior. El ADN se extrajo de 400 μl de plasma utilizando un equipo QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para minimizar el riesgo de contaminación, el ADN fue aislado en flujo aéreo laminar y se utilizaron filtros resistentes a los aerosoles. El ADN fue eluido en 50 μl de solución amortiguadora AE y se utilizaron 5.0 μl como plantilla para el RhD y 2.5 μl de ADN para la β-globina en la reacción de PCR.
Análisis mediante PCR en tiempo real
El análisis PCR en tiempo real se realizó mediante el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystem, Branchburg, Nueva Jersey, EE.UU.).
Las secuencias de iniciador y de la sonda se muestran en la tabla 1.^7,10-14 La β-globina (GLO) sirvió como control para confirmar la presencia y la calidad del ADN en cada muestra.^7,10 En todos las muestras analizadas se detectó una amplificación del gen control de la β-globina.



Las reacciones de amplificación TaqMan se llevaron a cabo con un volumen de reacción de 25 μl por medio del sistema TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Branchburg, Nueva Jersey, EE.UU.) Se optimizaron los iniciadores y las sondas para determinar sus concentraciones mínimas requeridas para proporcionar el máximo de actividad Rn. La sonda para el exón 10 del RHD fue utilizada en concentraciones de 100 nM y las sondas para el gen SRY, el exón 7 del RHD, el RHCE y la β-globina en concentraciones de 200 nM. Los iniciadores de PCR fueron utilizados en una concentración final de 200 nM y 300 nM. Las amplificaciones del ADN fueron realizadas en 8 bandas de reacción óptica (Applied Biosystems, Branchburg, Nueva Jersey, EE.UU.). Las condiciones para PCR TaqMaq fueron aplicadas de acuerdo con los lineamientos de TaqMan, empleando 50 ciclos de 95ºC por 15 seg y 60ºC por 1 min con incubación previa de 2 min a 50ºC, lo cual se requiere para la óptima actividad AmpErase UNG, y una incubación previa de 10 min a 95ºC, requerida para la activación de la ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Cada muestra se analizó en por lo menos 5 dispositivos para la replicación de la copia. El espécimen de un paciente fue considerado positivo si una o más muestras individuales en replicación eran positivas (ciclo umbral < 40).
Resultados
Determinación del sexo fetal mediante el análisis del plasma materno
La determinación del SRY en plasma materno mediante PCR en tiempo real estuvo en completa concordancia con respecto al sexo fetal en las 39 mujeres cuyos hijos presentaban riesgo de sufrir trastornos ligados al cromosoma X; fueron 18 masculinos y 21 femeninos.
En todos los embarazos con riesgo de padecer hemofilia ligada a X se indicó un procedimiento diagnóstico prenatal invasivo. Los resultados de los análisis no invasivos se correlacionaron con los resultados obtenidos por biopsia de muestras de vellosidades coriónicas o por amniocentesis.
En otros casos de embarazo con riesgo de presentar trastornos ligados a X –los pacientes nº 699, 935 y 1030– no existió la indicación de diagnóstico prenatal invasivo dado que el examen no invasivo repetido del plasma materno reveló que se trataba de embarazos de feto femenino, lo cual fue confirmado posteriormente por ecografía (tabla 2).
Tabla 2Tipificación de RHD, RHC y RHE mediante el análisis del plasma materno
La genotipificación prenatal no invasiva de los exones 7 y 10 del RHD fetal en plasma materno estuvo en completa concordancia con el análisis del cordón umbilical en las 45 embarazadas negativas para el RhD, que posteriormente dieron a luz 24 recién nacidos positivos para Rh D y 21 negativos para Rh D. La genotipificación prenatal no invasiva del exón 2 del RHC fetal fue bien ejecutada en la totalidad de las 41 embarazadas Rh c homocigotas, que dieron a luz 17 neonatos RhC positivos y 24 RhC negativos. Similarmente, la genotipificación prenatal no invasiva del RHE fue realizada correctamente en las 45 embarazadas homocigotas Rh e que dieron a luz 7 recién nacidos Rh E positivos y 38 Rh E negativos.
Discusión
Los resultados obtenidos en nuestro estudio realizado sobre un número comparable de pacientes apoyan los resultados de otros estudios.^7-9,12,15-21 Por lo tanto, concluimos que la amplificación del ADN fetal libre en plasma materno es un enfoque promisorio para una determinación válida y rápida del sexo fetal, así como de su condición RHD y RHCE. Sugerimos que mediante el análisis con PCR en tiempo real de por lo menos 5 copias de cada muestra de ADN, se podría incrementar considerablemente la sensibilidad para detectar el ADN fetal presente en el plasma materno.
De este modo, los procedimientos invasivos de diagnóstico prenatal en mujeres portadores de trastornos genéticos ligados a X podrían quedar restringidos a los embarazos de fetos masculinos.
La identificación de un feto D-negativo en los embarazos Rh D negativos excluye el riesgo de la enfermedad hemolítica del recién nacido causada por los aloanticuerpos anti-D; estos anticuerpos podrían estar presentes en la circulación materna desde embarazos previos, por diversas razones. Sin embargo, con el fin de evitar resultados falsos negativos, el análisis para la genotipificación del RhD fetal mediante el uso de muestras de plasma materno debería incluir la amplificación de por lo menos dos productos específicos para Rh D. Sugerimos la evaluación de uno de los nucleótidos específicos del RhD, presente en el exón 7 del RHD, y por lo menos una segunda región; exón 4, intrón 4²¹ o exón 10 del gen RHD. La genotipificación del RHD basada únicamente en las secuencias específicas 3´UTR del exón 10 del RHD no se consideró un procedimiento seguro.²²
En las embarazadas aloinmunizadas con riesgo de EHRN debido a la presencia de aloanticuerpos anti-D+C y anti-D+C+E recomendamos realizar simultáneamente la genotipificación fetal de RHD, RHC y RHE.
En tanto, se necesitan estudios mayores y confirmatorios, estos datos presentan una argumentación convincente en cuanto a que este tipo de análisis deberían ser incorporadas a nuestro algoritmo de diagnóstico clínico para el seguimiento de los embarazos cuyos fetos tienen riesgo de sufrir trastornos ligados al cromosoma X o la enfermedad hemolítica del recién nacido.
Los autores no manifiestan conflictos.

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