MOLLUSCAN SHELLFISH CONTAMINATION BY ENTERIC VIRUSES: USEFULNESS OF THE LEGAL STANDARDS AND INDICATOR MICROORGANISMS

Abstract
Illness outbreaks caused by enteric viruses after mollusc consumption are an important public health hazard worldwide. The virus responsible for those outbreaks are mainly Norovirus (Norwalk virus group), highly prevalent throughout the world, and the hepatitis A virus, due to the severity of the disease it causes. Though effective to reduce bacterial contamination, depuration techniques for molluscan shellfish, do not wholly eliminate the viral particles. On the other hand, evidence has lately been obtained on the relevance of international trade operations involving fresh or semipocessed molluscs in the transmission of viral diseases among distant geographic areas. Sanitary controls included in the current legislation are based on the number of fecal coliforms, although this bacterial group has been described as a bad indicator of viral contamination and, therefore, its effectivity in preventing the appearance of disease outbreaks is limited. All these data indicate the necessity to include parameters of viral contamination in the sanitary control of molluscan shellfish, either obtained in local production or through imports from third countries.

Artículo completo
Introducción
La importancia creciente de los moluscos como proteínas para consumo, junto con la estabilización de la producción pesquera mundial, ha llevado a un desarrollo importante de este campo de la acuicultura. En los últimos años, tanto el número de explotaciones de cultivo de moluscos como su volumen de producción se incrementaron notablemente en nuestro país y sobre todo en Galicia, debido al amplio mercado de este producto. Dicho incremento en el consumo conlleva un problema sanitario asociado, ya que en el medio acuático donde se desarrollan estos organismos se pueden encontrar más de 100 especies distintas de virus infecciosos para el ser humano, que normalmente se transmiten por vía fecal-oral y que se denominan genéricamente "virus entéricos".^1,2
La contaminación viral de los moluscos
La prevalencia de los virus entéricos en el ambiente depende de varias causas, pero fundamentalmente de la contaminación humana por aguas fecales, ya que las partículas virales son vertidas al medio con las heces de los individuos afectados, donde se encuentran en elevadas cantidades. A través de las aguas residuales, estos virus acceden a todo tipo de aguas superficiales, donde representan un serio riesgo sanitario.^3-5
Los moluscos son organismos filtradores, se demostró que el flujo que atraviesa su tracto digestivo puede alcanzar los 20 litros en una hora. Como consecuencia de este flujo se retienen todo tipo de partículas sólidas, muchas de las cuales son flóculos sedimentarios que pueden transportar partículas virales adheridas, o bien partículas virales libres.⁶Así, moluscos como mejillones, lapas, berberechos, almejas y ostras actúan a modo de concentradores virales naturales. Aunque esta bioacumulación es pasiva (los virus entéricos no se multiplican en el interior del molusco), las partículas víricas se pueden acumular en diferentes órganos y tejidos del molusco, donde permanecen estables durante largos períodos de tiempo. El hecho de que muchos de estos moluscos se consuman crudos o sólo mínimamente cocinados es una de las causas de que estas partículas virales lleguen perfectamente viables a los consumidores y sean capaces de producir enfermedad.
Todo lo anteriormente descrito explica por qué estos organismos filtradores actúan a modo de vectores en la transmisión de enfermedades como hepatitis infecciosa, causada por el virus de la hepatitis A (HAV), gastroenteritis (principalmente cusadas por Norovirus [NV]), etc. (tabla 1). Este hecho está, además, potenciado por el crecimento de moluscos en áreas típicamente contaminadas por la influencia del hombre, lo cual implica un riesgo serio para la salud pública y la necesidad de una vía de prevención de esta transmisión.
Tabla 1Generalmente, los moluscos responsables de los brotes y epidemias virales provienen de zonas de aguas contaminadas, pero no es infrecuente que procedan de áreas de agua de "buena calidad"; según las exigencias sanitarias actuales, para aguas de cultivo de moluscos únicamente se incluyen normativas en cuanto al número de coliformes fecales y presencia de Escherichia coli.⁷ Por ello, una de las líneas de investigación que más se potenció se dirige al desarrollo de técnicas para una detección viral eficaz, tanto a partir del agua y sedimentos como de tejidos de organismos.Control sanitario
Como ya se comentó, la normativa en vigor sobre control sanitario de moluscos destinados a consumo se basa en la determinación de los niveles de coliformes fecales y E. coli presentes, bien en carne y líquido intervalvar de los moluscos, bien en las aguas de cultivo.
Actualmente, según los criterios de la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 1991 (91/142/CEE),⁸ la calidad sanitaria de los moluscos se fija según una clasificación de las zonas de producción en función del número de coliformes fecales y E. coli, de la siguiente forma.
Zonas A: Para consumo humano directo. Moluscos con menos de 300 coliformes fecales o menos de 230 E. coli por 100 g de carne y líquido intervalvar.
Zonas B: Moderadamente contaminados. Moluscos con menos de 6 000 coliformes fecales o menos de 4 600 E. coli por 100 g de carne en el 90% de las muestras tomadas. Sólo se pueden destinar a consumo después de tratamiento en un centro de depuración o tras su reinstalación en una zona A.
Zonas C: Fuertemente contaminados, molucos con menos de 60 000 coliformes fecales por 100 g de carne de molusco. Se podrían destinar a consumo tras un largo período de reinstalación en una zona limpia.
Sin embargo, diversos trabajos demostraron que no existe una buena correlación entre la presencia viral y bacteriana, la persistencia viral es mucho más elevada que la bacteriana, tanto en moluscos como en el medio ambiente. Por tanto, el uso de coliformes fecales como indicadores de presencia viral no es fiable.^9-13
En este sentido, nuestro grupo de investigación realizó diferentes estudios sobre la prevalencia de diferentes virus entéricos en poblaciones naturales y cultivadas de moluscos en Galicia (noroeste de España).^9,13 En el primero de ellos,⁹ se estudió la prevalencia de HAV y enterovirus mediante las técnicas de hibridación dot-blot y RT-PCR, comparando los valores de contaminación viral con los de contaminación bacteriana, evaluados mediante recuentos de E. coli en las mismas muestras. Entre las especies de moluscos estudiadas figuraban mejillón, natural y cultivado en batea, almeja y berberecho. Los recuentos bacterianos mostraron que la mayoría de las muestras (40.8%) se clasificaban como moderadamente contaminadas según los estándares de la UE (categoría B), y por lo tanto debían someterse a procesos de depuración (tabla 2). Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre los valores de contaminación bacteriana de mejillón cultivado y los de moluscos silvestres. Así, el porcentaje de muestras limpias (< 230 E. coli/100 g de molusco) fue claramente superior en mejillón cultivado (49.1%) que en mejillón silvestre (22.8%) o almejas y bereberechos (10.7%). Por otro lado, se detectó HAV en 27.4% de las muestras y enterovirus en 43.9% (tabla 2). La detección simultánea de ambos tipos virales se obtuvo en 14.1% de las muestras. En este sentido, también se demostró que la técnica de RT-PCR es más sensible y eficaz para la detección de HAV. Los análisis estadísticos realizados mostraron que no existía correlación entre la contaminación bacteriana y viral, ni entre la presencia de HAV y enterovirus. Únicamente pudo encontrarse dicha relación en áreas muy contaminadas, normalmente asociadas a zonas con elevada concentración de población.



En el segundo de los trabajos¹³ se amplió el número de grupos virales a estudiar incluyendo NV y adenovirus (AV) y se evaluó la validez de los bacteriófagos RNA F+ como indicadores de contaminación viral. En este estudio se utilizó la técnica de nested-PCR para aumentar la sensibilidad en la detección viral. Los resultados de los recuentos de E. coli mostraron de nuevo una menor contaminación en los moluscos cultivados (62.5% de las muestras en categoría A) que en los obtenidos de poblaciones naturales (0 en categoría A) (tabla 2). Por niveles de bacteriófagos, únicamente 37.5% de las muestras de moluscos cultivados se podrían considerar limpias, mientras que el 100% de las muestras de poblaciones naturales estarían consideradas como contaminadas (tabla 2). Con respecto a los niveles de los diferentes grupos de virus entéricos, 66.6% de las muestras fueron positivas para AV y 16.6% para NV (tabla 2). Es interesante señalar que se detectaron ambos genogrupos (I y II) de Norovirus, incluso en una misma muestra. No se encontraron muestras positivas para HAV, probablemente debido al rápido descenso de la incidencia de este virus en España.¹⁴
Los resultados obtenidos en estos dos estudios son similares a los descritos por otros autores,^10-12 e indican la necesidad de utilización de nuevos indicadores más fiables o bien de realizar análisis específicos de contaminación viral.^7,15 En este sentido, es importante señalar que el Consejo de la Unión Europea adoptó en 1999 una Decisión (1999/313/CE)¹⁶ vinculante para todos los países miembro, en la que se establece la necesidad de estandarización e inclusión en la normativa de métodologías adecuadas para el control virológico de moluscos bivalvos.
Depuración
El método tradicional utilizado para prevenir la posible contaminación bacteriana o viral de moluscos es el de depuración, consistente en la colocación del molusco en agua no contaminada o limpia durante 48 horas como término medio, se basa en la capacidad autopurgante de los moluscos por sus características de organismos filtradores.^17-19 Un gran número de trabajos publicados en los últimos años demostraron que las reducciones en el número de coliformes fecales y virus (particularmente HAV) tras el proceso de depuración no están muy relacionadas.^12,20-23 Teniendo esto en cuenta, parece que la efectividad de la depuración necesita ser evaluada por separado para cada grupo de patógenos.
Recientemente nuestro grupo de investigación llevó a cabo estudios comparativos de las dinámicas de depuración de diferentes microorganismos en mejillón,²⁴ incluyendo E. coli y bacteriófagos RNA F+, como ejemplo de microorganismos indicadores, y los virus HAV y NV. Los resultados mostraron la falta de correlación entre los niveles de E. coli y bacteriófagos, así como entre los niveles de ambos indicadores y la presencia viral (tabla 3), lo que indica la existencia de dinámicas de eliminación diferentes y la necesidad de más estudios para determinar las condiciones idóneas del proceso de depuración para que pueda asegurar un producto de calidad virológica destinado a consumo. Además, se observó que en algunas se incrementan los niveles de contaminación tras el proceso de depuración, lo que puede deberse a malas prácticas operacionales durante el proceso (tabla 3). Es necesario por tanto un mayor control del funcionamiento de las plantas depuradoras de moluscos.



Papel de las importaciones y otras operaciones comerciales en la transmisión de virus entéricos
En los últimos años se demostró la importancia de las operaciones comerciales internacionales en la transmisión de patógenos asociados al consumo de determinados alimentos. Un buen ejemplo de la implicación de estas operaciones en la aparición de brotes epidémicos es el brote de hepatitis A ocurrido en España, que pudo asociarse al consumo de almejas coquinas (Donax sp.) importadas de Perú, que es una zona endémica para esta enfermedad.²⁵ Los primeros casos del brote se registraron en septiembre de 1999 y se dio por concluido a finales del mismo año. El número de personas afectadas fue de 188, todas en la Comunidad Valenciana, en las que se observaron varios casos de gastroenteritis, vómitos, dolores abdominales y fiebre. Los análisis virológicos realizados mediante métodos moleculares a partir de tejidos de las almejas implicadas demostraron la presencia del HAV en 75% de las muestras. Sobe la base de estas evidencias, las autoridades sanitarias autonómicas y estatales procedieron a la inmovilización de 176 544 kg de coquinas en la Comunidad Valenciana y 12 544 kg en el resto de España.
A partir del brote de hepatitis A ocurrido en la Comunidad Valenciana, y pese a no existir legislación al respecto, las autoridades sanitarias españolas adoptaron como medida preventiva el análisis sistemático de las importaciones de moluscos, principalmente almejas (Donax sp. y Tapes sp.) y vieiras (Argopecten sp.), para la detección del HAV. Nuestro laboratorio en la Universidad de Santiago realizó, entre noviembre de 1999 y mayo de 2001, el análisis virológico específico para el virus de la hepatitis A de un total de 16 importaciones de moluscos bivalvos procedentes de Sudamérica llegadas a distintas comunidades autonómicas españolas.²⁶ Estas importaciones incluían 6 envíos de almeja fina (Tapes sp.), 6 de coquinas, así como 5 de vieiras, que tomadas en conjunto implicaban un volumen de importación de 300 toneladas de moluscos. Además, se analizaron las muestras inmovilizadas en la Comunidad Valenciana asociadas con el brote de hepatitis A ocurrido en septiembre de 1999.
De las 16 importaciones analizadas, en 3 de ellas se demostró la presencia de HAV mediante la técnica de RT-PCR (amplificación del ácido nucleico viral extraído de tejidos de molusco) combinada con hibridación de los productos de amplificación con sondas específicas para el virus. De estas importaciones, dos se correspondieron con lotes de almeja fina, mientras que la tercera consistía en un envío de vieiras (figura 1).

Figura 1. Detección del virus de la hepatitis A en moluscos procedentes de importaciones, por RT-PCR (A) y correspondiente Southern blot (B). Líneas: a, marcador de peso molecular (PCR marker 50-2 000 bp, Sigma); b-e, muestras de almeja; f-h, muestras de vieira; i, control negativo; j, control positivo. Los números indican la talla en pb de las bandas del marcador (izquierda) y el producto específico (derecha).

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