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DEFINIÇÃO DOS VÁRIOS PARÂMETROS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA O DIAGNÓSTICO DA DENGUE
(especial para SIIC © Derechos reservados)
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fmrp.jpg lopesda9.jpg Autor:
Lopes da Fonseca, Benedito Ant
Columnista Experto de SIIC

Institución:
 Departamento de Clínica Médica Facultad de Medicina de Ribeirão Preto Universidad de São Paulo SP, Brasil

Artículos publicados por Lopes da Fonseca, Benedito Ant  
Coautor
Sérgio Oliveira de Paula* 
D.V.M., M.Sc. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil*

Recepción del artículo: 6 de julio, 2004

Aprobación: 16 de septiembre, 2004

Primera edición: 7 de junio, 2021
Segunda edición, ampliada y corregida:  7 de junio, 2021

Conclusión breve
Dengue é a mais importante doença causada por um arbovírus no mundo. O desenvolvimento de novos métodos diagnósticos ou a melhoria dos métodos já disponíveis certamente resultarão em um melhor cuidado dos pacientes que apresentam esta doença

Resumen

Dengue é a mais importante doença causada por um arbovírus no mundo. O desenvolvimento de novos métodos diagnósticos ou a melhoria dos métodos já disponíveis certamente resultarão em um melhor cuidado dos pacientes que apresentam esta doença. Recentemente, nós temos trabalhado, em nosso laboratório, na definição de parâmetros que melhorem o diagnóstico molecular da dengue. Nesta revisão, nós discutimos a padronização das várias etapas da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) visando a definição de qual é a melhor amostra clínica a ser usada no diagnóstico da dengue; qual é a melhor técnica de extração do RNA viral de amostras clínicas; e qual é o melhor kit usado regularmente nos ensaios de RT-PCR para o diagnóstico da dengue. Nós também desenhamos uma nested-PCR, baseada em um protocolo publicado anteriormente e mostramos que esta técnica pode ser usada com sucesso na detecção e diferenciação dos vírus dengue presentes em amostras clínicas que contenham IgM. Finalmente, nós melhoramos a capacidade de detecção de infecções pelos vírus dengue em células C6/36 através do uso da PCR ao invés da IFA. Resumidamente, nossos dados mostram que esta técnica pode substituir o isolamento e identificação dos vírus dengue no futuro.

Palabras clave
Dengue, PCR, diagnóstico

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
página www.siicsalud.com/des/expertos.php/69189

Especialidades
Principal: Infectología, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Epidemiología, 

Enviar correspondencia a:
Benedito Antônio Lopes da Fonseca MD, PhD - Laboratório de Virologia Molecular, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo. Avenida dos Bandeirantes, 3900. Ribeirão Preto – São Paulo, CEP: 1404 Lopes da Fonseca, Benedito Antônio

OPTIMIZATION OF PCR PROTOCOLS FOR DENGUE DIAGNOSIS

Abstract
Dengue is the most important arboviral disease transmitted to humans. Development of new diagnostic methods or improvement of old ones will result in a better management of this disease. Currently, in our laboratory, we have been working on the improvement of the molecular diagnosis of this disease. In this review, we discuss the standardization of several steps of the polymerase chain reaction (PCR) aiming at the definition of which is the best technique for extracting viral RNA from human samples; which is the best clinical sample to be used for dengue diagnosis; and which is the best kit regularly used on RT-PCR protocols for dengue diagnosis. We have also designed a nested RT-PCR, based on previously published protocol and showed that this technique may be successfully used on the detection and differentiation of dengue viruses present in IgM-containing samples. Finally we have improved the detection rate of dengue virus detection on C6/36 cells by using PCR instead of IFA for detection of infection. In summary, our data show that this technique could replace dengue virus isolation and identification in the future due to its ease of manipulation and the rapidity of virus identification.

Key words
Dengue, PCR, diagnostic

DEFINIÇÃO DOS VÁRIOS PARÂMETROS DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA O DIAGNÓSTICO DA DENGUE

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo
A dengue é uma doença resultante da infecção por qualquer um dos quatro sorotipos dos vírus dengue. Atualmente, é a doença mais importante causada por um arbovírus no mundo, sendo que sua distribuição global é mais importante nas áreas tropicais e sub-tropicais. Anualmente, as infecções causadas pelos vírus dengue são responsáveis por mais de 100 milhões de casos de dengue clássico e mais de 500 000 casos de febre hemorrágica. A transmissão destes vírus é feita por mosquitos do gênero Aedes, principalmente o Aedes aegypti, caracterizando-se assim por ser predominantemente urbano na sua distribuição.1 A incidência da dengue nas Américas aumentou substancialmente de 1980 a 1994. Durante este período, toda a atividade dos vírus dengue nas Américas foi principalmente associada com os sorotipos 1, 2 e 4 (DEN-1, DEN-2 e DEN-4). O isolamento do vírus dengue-3 de 2 crianças hospitalizadas com manifestações hemorrágicas na Nicarágua, e de 2 pessoas com dengue clássico no Panamá no final de 1994, marcaram o começo da detecção de todos os 4 sorotipos nas Américas.2 No Brasil, durante a década de '90, a incidência da dengue aumentou grandemente como conseqüência da disseminação do Aedes aegypti no país, começando principalmente em 1994. A dispersão do vetor para a maioria das regiões do Brasil foi seguida pela disseminação dos sorotipos 1 e 2 em 20 dos 27 estados do país. Entre 1990 e 2003, várias epidemias ocorreram, principalmente nos maiores centros urbanos do sudeste e nordeste do país, e a maior incidência da doença no país foi observada em 2002, com 780 644 casos. A circulação do sorotipo 3 foi detectada pela primeira vez em dezembro de 2000 no estado do Rio de Janeiro, e subseqüentemente, no estado de Roraima, em novembro de 2001.3 Desde então, este sorotipo tem se disseminado para quase todos os estados do país (figura 1).



Figura 1. Sorotipos circulantes do vírus da dengue por Estados, Brasil, 2003*. Mapa mostrando a extensão da distribuição dos sorotipos dos vírus dengue no Brasil. Note que apenas 2 estados brasileiros não relatam casos de dengue e que, na maioria dos estados, há a prevalência dos 3 sorotipos.
As manifestações clínicas da dengue variam desde infecções assintomáticas até quadros graves de doença hemorrágica que são responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade, sendo uma das principais causas de mortalidade infantil no Sudeste Asiático. Nas Américas, sendo todos os grupos etários ainda suscetíveis, mesmo a forma menos severa da doença é responsável por uma grande perda econômica, pois acomete principalmente a população economicamente ativa. Clinicamente, as formas mais graves da dengue, a febre hemorrágica da dengue e a síndrome do choque da dengue (FHD/SCD), são de difícil diagnóstico, sendo confundidas com a dengue clássica nas fases iniciais e com outras doenças caracterizadas por distúrbios da permeabilidade capilar na sua apresentação característica.4 A patogênese da forma hemorrágica da dengue não está bem definida e várias hipóteses existem. A de maior aceitação refere-se a um fenômeno denominado "aumento da infecção mediado pelo sistema imune" (immune enhancement of infection), fenômeno comum a outras infecções virais, como por exemplo, a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV).5 Esta hipótese defende a idéia de que anticorpos adquiridos em infecções prévias por um determinado sorotipo do vírus do dengue não seriam neutralizantes ou teriam títulos muito baixos para neutralizarem o sorotipo responsável pela infecção atual (anticorpos sub-neutralizantes). Estes anticorpos se ligariam a outros epítopos do sorotipo responsável pela infecção atual, epítopos estes, comuns aos 4 sorotipos virais, mas não o neutralizaria, formando então, complexos vírus-anticorpos que facilitariam a penetração do vírus dengue nas células monocitárias, que são as células-alvo do nosso organismo para a replicação dos vírus dengue. Células mononucleares expressam na sua superfície receptores para a porção Fc das imunoglobulinas, região implicada na ligação dos complexos vírus-anticorpos a estas células, facilitando assim a ligação dos vírus dengue ao seu receptor bem como a internalização dos complexos vírus-anticorpos. Esta facilidade de penetração do vírus nestas células resulta em uma maior carga viral, maior intensidade da resposta imune a esta infecção com liberação de citocinas e aminas vasoativas e como conseqüência, uma doença mais grave.6
Com o intuito de prevenir esta doença e controlar a grave situação em que o Sudeste Asiático e as Américas se encontram um comitê de especialistas da Organização Mundial de Saúde propôs diretrizes que incluem o estabelecimento de um sistema de vigilância ativa para as formas mais graves da dengue.7 Dentre estas diretrizes, encontra-se a recomendação de que, para prover informações precisas e precoces às autoridades de saúde pública, um diagnóstico laboratorial rápido e preciso é de fundamental importância para um efetivo controle epidemiológico.
Apesar das técnicas sorológicas usadas no diagnóstico da dengue serem satisfatórias, falsos resultados, tanto positivos quanto negativos, freqüentemente acontecem na rotina laboratorial, devido a vários fatores como agentes contaminantes (químicos, biológicos), agentes físicos (temperatura), tipo de amostras e outros. Deste modo, novas estratégias diagnósticas devem ser investigadas, em particular, as técnicas que empregam os conhecimentos de biologia molecular. Dentre estas técnicas, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é a que tem sido investigada mais intensamente. A PCR tem sido desenvolvida para o diagnóstico de uma infinidade de doenças virais e nos últimos anos tem revolucionado o diagnóstico laboratorial de várias doenças infecciosas. O método é rápido, sensível, simples, e se corretamente reproduzido, pode ser usado para detecção de genomas virais em amostras clínicas humanas (como sangue, urina, escarro, etc), tecidos de biópsias, autopsias; ou de mosquitos.8,9
Ultimamente, a PCR precedida da transcrição reversa (RT-PCR) tem sido usada para amplificar, in vitro, o genoma dos vírus dengue em cultura de células e no soro de pessoas com dengue. Os resultados destes trabalhos sugerem que o método de RT-PCR, dependendo dos primers em uso, pode ser tipo-específico com relação à detecção dos vírus dengue e que a sensibilidade de detecção é menor que 100 unidades formadoras de placas (ufp) para todos os sorotipos em questão.10-20 Buscando aperfeiçoar o diagnóstico molecular destas infecções, temos trabalhado na melhoria dos vários parâmetros envolvidos na técnica de PCR para o diagnóstico molecular da dengue. Assim, investigamos a detecção dos vírus dengue em diferentes amostras clínicas afim de otimizarmos a técnica hoje empregada, com a finalidade de obtermos um diagnóstico rápido, seguro e confiável, dando com isso maiores subsídios para os profissionais de saúde intervirem rapidamente, tanto do ponto de vista curativo quanto preventivo.
Existem assim, vários protocolos para o uso da PCR no diagnóstico da dengue, mas não existe um kit de referência para este fim. Assim, visando a otimização de todas as etapas de uma PCR a ser usada no diagnostico molecular da dengue, nos comparamos 3 métodos de extração de RNA do soro de pacientes com suspeita clínica de dengue. Os métodos investigados foram o kit QIAamp® Viral RNA, a técnica de Chomczynski-Sacchi e a extração de RNA pelo TRIzol®. Os dados obtidos nestes estudos indicaram que o melhor método de extração de RNA de amostras clínicas para ser usado no diagnóstico da dengue pela RT-PCR é o QIAamp® Viral RNA kit.21
Em outro estudo, avaliamos qual a melhor amostra clínica a ser usada para a detecção do vírus da dengue pela RT-PCR. Esta técnica foi usada em sangue, soro e no buffy-coat de 75 amostras IgM-positivas para os vírus dengue. Das 75 amostras, 17 foram positivas na RT-PCR, e destas, 3 foram positivas no sangue, 14 foram positivas no soro, enquanto 8 foram positivas no buffy-coat, indicando desta forma, o soro como a melhor amostra clínica para o diagnóstico molecular da dengue quando usarmos a RT-PCR.22
Devido à baixa detecção dos vírus dengue pelo isolamento viral, em amostras IgM-positivas quando se usa a imunofluorescência indireta (IFA) em células C6/36 inoculadas com amostras clínicas, decidimos testar a capacidade da detecção dos vírus dengue nesta cultura celular através do uso da RT-PCR, com o intuito de aumentarmos a sensibilidade da detecção viral. Para tanto, comparamos a eficiência da RT-PCR e da IFA na detecção do vírus dengue-1 após inoculação em células C6/36 de amostras obtidas no período de convalescença. Das 75 amostras IgM-positivas inoculadas na cultura celular, 2 foram positivas na IFA enquanto 17 foram positivas pela RT-PCR. Nós também investigamos o tempo necessário para a detecção viral por ambos os métodos usando uma dose fixa de 1x104 vírus/ml. A RT-PCR e a IFA detectaram o vírus da dengue com 1 e 4 dias após a inoculação viral, respectivamente, mostrando ser a RT-PCR muito mais sensível do que a IFA na detecção de amostras contendo vírus dengue.23
Baseado nos bons resultados obtidos em nosso laboratório e no fato de que a Organização Mundial de Saúde (OMS) ainda considera a PCR como uma técnica experimental para o diagnóstico da dengue, nós conduzimos um estudo de validação do diagnóstico baseado na PCR em amostras clínicas coletadas em Ribeirão Preto, Brasil. Na época do estudo, o vírus dengue-1 era o sorotipo predominate nesta região e, portanto, foi usado na validação do teste. A detecção viral pela RT-PCR foi avaliada usando o soro de pacientes com o diagnóstico clínico de dengue, e os resultados foram comparados àqueles obtidos pelo MAC-ELISA e o isolamento viral. Nossos resultados demonstraram que a RT-PCR é mais sensível que o isolamento viral em amostras clínicas, permitindo uma rápida detecção da dengue.20
Outra importante característica da RT-PCR é sua capacidade em identificar o sorotipo viral responsável pela infecção. Vários protocolos tem sido desenvolvidos com esta finalidade, sendo o desenvolvido por Lanciotti e colegas um dos mais empregados.24
A PCR e a análise por restrição enzimática têm sido usadas de forma combinada no desenvolvimento de uma técnica rápida e simples para identificação dos sorotipos e dos subgrupos dentro dos sorotipos dos vírus dengue em investigações epidemiológicas.25,26 Baseado no trabalho de Henchal e colaboradores nós desenvolvemos uma nested-PCR seguida de restrição enzimática dos amplicons para diferenciar os sorotipos DEN-1 e –2, que na época do estudo eram os sorotipos prevalentes no Brasil. As amostras foram submetidas à amplificação pela nested-PCR, e os amplicons foram digeridos com a enzima Kpn I. Os resultados deste estudo também foram comparados com o isolamento viral, MAC-ELISA e a RT-PCR convencional. O uso na nested-PCR aumentou em 3 a 4 vezes a detecção do vírus dengue. Todos os implicons digeridos pela enzima Kpn I identificaram o sorotipo DEN-1 como a linhagem infectante. Estes resultados indicaram que a nested-PCR promoveu um aumento na amplificação do genoma viral mesmo na presença de anticorpos IgM, e que a restrição enzimática dos amplicons definiu rapidamente o sorotipo circulante.27
Concluindo, a PCR pode assumir um importante papel no que tange ao rápido diagnóstico da dengue, porém devido ao fato que todos os protocolos de RT-PCR são padronizados in-house, todos os passos envolvidos neste teste devem ser bem padronizados para serem usados em espécimes clínicos. Assim, cada um deles deve ser otimizado para que a reação atinja o seu maior grau de eficiência. Após a definição dos parâmetros ideais para o processamento das amostras de pacientes infectados pelos vírus dengue, decidimos investigar qual seria o melhor kit comercial disponível para a realização da RT-PCR no diagnóstico da dengue. Há vários kits de confecção de DNA complementar e PCR disponíveis comercialmente que podem oferecer algumas vantagens sobre os protocolos in-house. Devido a falta de estudos que indicassem qual o melhor kit para o uso no diagnóstico da dengue pela RT-PCR, nós comparamos 5 kits comerciais de RT-PCR (2 kits two-step e 3 kits one-step) regularmente usados na rotina laboratorial. Neste trabalho, nossos dados demonstraram que os kits one-step foram mais eficientes na detecção do vírus dengue do que os kits two-step, e que eles são menos laboriosos, rápidos e eliminam o passo de confecção do cDNA em um tubo diferente, que pode levar a uma diminuição substancial na contaminação das amostras.28
Recentemente, utilizando a PCR em Tempo Real, alguns autores têm relatado sucesso com o uso desta técnica já que ela combina o uso de ensaios qualitativos para a detecção do vírus dengue bem como ensaios quantitativos para a detecção da viremia em pacientes com dengue. Warrilow et al (2002) desenharam um único par de primers e uma sonda para a detecção específica dos quatro sorotipos do dengue, sem detectar nenhum outro flavivírus.29 Houng et al (2001), utilizaram 134 amostras clínicas para validarem a sensibilidade e especificidade do ensaio de PCR em Tempo Real utilizando primers e sondas sorotipo-específicos, correspondentes a seqüência conservada 3'- não codificadora dos vírus dengue. Os resultados demonstraram altos níveis de sensibilidade e especificidade de 92.8% e 92.4% respectivamente, para a detecção dos quatro sorotipos dos vírus dengue.30
Resumo
Em nosso laboratório foi avaliado a PCR em Tempo Real, incluindo a padronização desta técnica para o diagnóstico dos 4 sorotipos da dengue. A metodologia usada neste trabalho foi capaz de combinar detecção, identificação e quantificação de uma seqüência específica, onde foi comparado o uso da PCR em Tempo Real usando os kits One-Step e Two-Step em 77 amostras clínicas utilizando os dois sistemas de detecção o Taqman e o Sybr Green. A relação linear verdadeira dos coeficientes de correlação foi excelente para todos os quatro sorotipos dos vírus dengue e a eficiência das reações variou de 86% a 99%. O limite mínimo de detecção foi de 10 PFU/mL no sistema TaqMan e 5x102 PFU/mL no sistema Sybr Green. O kit One-Step demonstrou ser mais eficiente que o kit Two-Step na detecção e identificação dos vírus dengue. Já com relação aos sistemas TaqMan e Sybr Green, o TaqMan mostrou ser mais preciso que o Sybr Green na quantificação viral (Alessandra C. G. Ruiz e Benedito A. L. Fonseca, comunicação pessoal).
Em suma, estes trabalhos contribuiram de maneira significante para a padronização do diagnóstico das infecções pelo vírus dengue pela PCR, pois de uma maneira controlada e prospectiva, analisamos as várias etapas de amplificação do genoma destes vírus à partir de amostras clínicas. Além disso, proporcionamos pela primeira vez na literatura a oportunidade de detecção (amplificação) de vírus dengue, em grande escala, na presença de anticorpos IgM, contribuindo assim para possíveis estudos sobre a patogênese das formas graves desta doença.
Los autores no manifiestan conflictos.


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