ENTEROAGGREGATIVE ESCHERICHIA COLI (EAEC), ITS IMPORTANCE AS CAUSE OF INFANT DIARRHEA IN MENDOZA, ARGENTINA

Abstract
Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an increasingly recognized cause of diarrhea in children in developing and developed countries. EAEC is recognized by a characteristic aggregative pattern of adherence to human epithelial (HEp-2) cells cultured in vitro. This is the gold standard assay. The aggregative phenotype is associated with the presence of a 65 MDa plasmid (pAA) that also encodes several other putative virulence factors, like the aggregative adherence fimbria I (AAF/I) and the enteroaggregative heat-stable enterotoxin (EAST1). The objective of this research was to evaluate the application of PCR (polimerase chain reaction) to identify EAEC strains in cases of acute diarrhea. Eigthy- seven E. coli strains, isolated from patients under 2 years of age with acute diarrhea in Mendoza, Argentina, were characterized by the reference method (HEp-2 assay), and by AAF/I - and EAST1- PCR. The PCR sensitivity and specificity in comparison with the cell culture assay showed 94.4% sensitivity and 78.26% specificity. EAST1- and AAF/I- PCR could be recommended as a screening test, applicable to epidemiological studies.

Key words
Enteroaggregative Escherichia coli, diarrhea, polimerase chain reaction

Artículo completo
Introducción
Hace ya más de un siglo Escherich describió una bacteria aislada de heces de individuos sanos y la denominó Bacterium coli comune.
Este microorganismo anaerobio facultativo, conocido actualmente como Escherichia coli es un habitante normal del intestino grueso de los mamíferos, donde juega un papel importante en su fisiología; la mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas y además pueden ejercer un efecto protectivo por impedir la proliferación de otras más virulentas. Pero la minoría de E. coli que causan enfermedad son un excelente ejemplo del modo por el cual mínimas variaciones en la estructura genética pueden permitir a las bacterias causar diferentes enfermedades como meningitis, septicemia, pielonefritis y diarrea. Recién en 1945 Bray pudo comprobar que E. coli puede ser diarreigénico en humanos, especialmente en niños. Las cepas de E. coli diarreigénicas constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos con diferentes propiedades de virulencia y epidemiología.Categorías diarreigénicas¹
Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) se adhiere al intestino delgado mediante fimbrias y elabora dos tipos de enterotoxinas: termolábil (LT) y termoestable (ST). Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) invade el enterocito y produce una diarrea similar a la producida por Shigella. Escherichia coli enteropatogénica (EPEC) produce la lesión A/E (attaching and effacing) con destrucción de las microvellosidades. Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) posee fimbrias de adherencia y elabora potentes citotoxinas SLT (shiga-like-toxins) que se relacionan con el síndrome urémico-hemolítico (SUH). Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) también posee fimbrias de adherencia y elabora dos enterotoxinas. Escherichia coli con adherencia difusa (DAEC) posee una fimbria mediadora de este tipo de adherencia, pero aún no existen estudios epidemiológicos concluyentes con respecto a su capacidad diarreigénica.²
Factores de patogenicidad¹
Como la mayoría de los patógenos, E. coli sigue una estrategia de infección: 1) colonización de un sitio en la mucosa, 2) evasión de las defensas del huésped, 3) multiplicación, 4) daño al huésped.
El hecho más destacable de las cepas de E. coli diarreigénicas es su habilidad para colonizar la superficie de la mucosa intestinal, a pesar de los movimientos peristálticos y de la competencia de los integrantes de la microbiota normal, incluyendo cepas de E. coli no patógenas.
La presencia de fimbrias de adherencia es una propiedad de todas las cepas de E. coli, incluidas las no patógenas. Sin embargo, las cepas diarreigénicas poseen antígenos fimbriales específicos que incrementan su habilidad colonizadora y permiten su adherencia al intestino delgado, sitio que normalmente no es colonizado.
Una vez que ha colonizado el intestino, sigue diferentes estrategias de patogénesis, según su tipo o categoría, a saber:
- producción de enterotoxinas (ETEC y EAEC),
- invasión (EIEC) y/o
- adherencia íntima con señales o eventos de membrana (EPEC y EHEC).
Cabe aclarar que el modo de interacción es específico para cada categoría.
La versatilidad en el genoma de E. coli, que le confiere las diferentes propiedades de virulencia, se fundamenta principalmente en dos configuraciones genéticas: plásmidos de virulencia e islas cromosomales de patogenicidad. Las seis categorías de E. coli diarreigénicas descritas son portadoras de al menos un plásmido de virulencia. Por una parte, EIEC, EHEC, EPEC y EAEC son portadoras de familias de plásmidos, cada uno de los cuales codifica para múltiples factores de virulencia. Asimismo, EPEC, EHEC y EAEC poseen además genes cromosomales organizados como un grupo denominado "isla de patogenicidad".
Los rasgos de patogenicidad individuales, como la producción de toxinas, pueden ser codificados por transposones (toxina ST de ETEC) o por fagos (toxina Shiga).^3,4,5
Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)
La observación de la adherencia de EPEC a células HEp-2, realizada por Cravioto y col. en 1979, fue crucial no sólo en el campo de la investigación de EPEC, sino que permitió, además, establecer dos categorías más de E. coli patogénicas. El patrón de adherencia de EPEC fue descrito como "adherencia localizada", denotando la presencia de microcolonias en la superficie de las células en cultivo. Las bacterias no EPEC adherían de una manera diferente que fue definida inicialmente como "difusa". Sin embargo, en un estudio realizado por Nataro, en Chile en 1987, se subdividió el fenotipo difuso en dos categorías: agregativas y difusas "verdaderas". Las agregativas se distinguen por la autoaglutinación de las bacterias y por su adhesión, además, a la superficie de vidrio del cubreobjetos. El patrón se define como stacked-brick (pilas de ladrillos). Mientras que en la adherencia difusa las bacterias se observan dispersas sobre la superficie de las células HEp-2 con poca agregación y poca adherencia al vidrio entre las células.
A fines de la década del '80 y comienzos de los '90, la relación inconsistente entre EAEC y diarrea condujo a dudar acerca de su papel como patógeno humano, de manera similar a lo ocurrido con EPEC en los '70.⁶
Si bien la patogenicidad de ETEC y EIEC pudo atribuirse a marcadores específicos y demostrarse en modelos animales, la evidencia de la patogenicidad de EPEC fue sólo epidemiológica hasta 1978, cuando dos cepas de EPEC demostraron su patogenicidad en adultos voluntarios. Y así como con EPEC, en los primeros aislamientos de EAEC no se pudo demostrar la presencia de ningún factor de virulencia conocido como diarreigénico. La observación de que estas cepas a menudo eran recuperadas de individuos aparentemente sanos condujo a un escepticismo sobre la patogenicidad de EAEC, hasta que dos estudios con voluntarios y un número de brotes de diarrea probaron que al menos algunas cepas de EAEC causaban diarrea en humanos. Además, estudios de casos y controles y de vigilancia en los últimos quince años sugieren fuertemente que EAEC constituye una causa importante de diarrea en personas de todas las edades en países industrializados y en vías de desarrollo.^7,8
Patogénesis
Las cepas EAEC producen aumento en la secreción de mucus con atrapamiento de las bacterias formando una biopelícula de mucus y bacterias. Se demostró a través de diversos experimentos que esta película se produce in vivo, y también se observó que la diarrea por EAEC es predominantemente mucosa, aunque no se ha dilucidado completamente el significado de esta característica. Además de esta propiedad, se ha observado que la infección por EAEC está acompañada por efectos citotóxicos en la mucosa intestinal. Vial y col., en 1988, observaron la lesión producida por EAEC a través de microscopia óptica. La lesión se caracteriza por acortamiento de las microvellosidades, necrosis hemorrágica de los extremos de la vellosidad y respuesta inflamatoria leve con edema e infiltración mononuclear de la submucosa. En biopsias de pacientes fallecidos por diarrea persistente causada por EAEC se evidenció la destrucción de la mucosa ileal. Los efectos citotóxicos se demostraron por cultivo en células T84, en las cuales la citotoxicidad causada por EAEC se manifiesta por vesiculización de la membrana, seguida de muerte celular y exfoliación de las células de la monocapa. Además, este efecto se acompaña de incremento en la formación de vacuolas y separación del núcleo del citoplasma circundante. Estos efectos citotóxicos requieren la presencia de genes codificados en un plásmido de 65 mDa, que contiene además los genes que codifican la adherencia. Sin embargo, no todas las EAEC producen efectos citotóxicos sobre la mucosa, lo cual indica la elevada heterogeneidad que presentan estas cepas, y conduce a resultados inconsistentes entre su presencia y diarrea, como demuestran algunos estudios epidemiológicos.^9,10,11
Adherencia
Nataro y col. identificaron en 1992 una estructura fimbrial flexible de 2 a 3 nm de diámetro, denominada fimbria de adherencia agregativa I (AAF/I). La adherencia a células HEp-2 producida por la cepa 17-2 está mediada por esta fimbria. Los genes que codifican para la fimbria están organizados en dos grupos, separados por 9 Kb, dentro del plásmido pAA. La región 1 contiene un grupo de genes requeridos para la síntesis y el ensamblaje de la proteína, incluida la subunidad estructural de la fimbria misma. La región 2 contiene un gen activador de la transcripción, denominado aggR.
Más recientemente se identificó una fimbria que presenta una homología del 25% con la primera y fue denominada AAF/II, cuya cepa prototipo es la 042, aislada en Perú.
No existen datos concluyentes sobre la frecuencia de aparición de una u otra. Las fimbrias AAF son necesarias para la adherencia a células epiteliales y para la formación de la biopelícula. Una proporción considerable de EAEC presenta este fenotipo pero no expresa ninguna de las fimbrias citadas, lo que indica que podrían existir otras adhesinas de naturaleza no fimbrial, lo que aún no se demostró.^12,13
EAST1
Es una proteína de 38 residuos de aminoácidos, homóloga a ST (toxina termoestable de ETEC), sólo que en lugar de 6 residuos de cisteína, EAST1 presenta 4.^14,15 También presenta homología con un péptido de la membrana de las células eucariotas, denominado guanilina, y se observó que produce aumento en la diferencia de potencial y corriente de cortocircuito a través de tejido ileal de conejo montado en using chambers. Se ha visto que el gen astA que codifica para esta proteína, está presente en el 40% de las cepas EAEC, pero también se lo ha encontrado, aun con mayor frecuencia, en cepas EHEC y también asociado a E. coli no patógenas. En un estudio reciente realizado en Japón, cepas de E. coli que presentaron EAST1 como única característica diarreigénica, fueron incluidas como posibles patógenos.¹⁶
Otras citotoxinas
Los efectos tóxicos observados en modelos animales, en explantos de células intestinales y en células T84 no son acompañados por internalización de la bacteria o por adherencia íntima.¹ Diversos grupos informaron la identificación de citotoxinas secretadas por EAEC. Es el caso de Pet, una serinproteasa originalmente identificada como una proteína secretada capaz de reducir la resistencia e incrementar la corriente de cortocircuito a través de tejido yeyunal de rata montado en using chambers. Además de su actividad enterotóxica, Pet tiene efectos citotóxicos en células epiteliales en cultivo y sobre eritrocitos por un mecanismo que probablemente involucra la degradación de la proteína de membrana espectrina.^17,18
Modelo propuesto para el mecanismo patogénico de EAEC
Hasta el presente, con los datos disponibles, se puede formular sólo una hipótesis del mecanismo: Nataro propone un modelo en tres etapas basado en ensayos in vitro y con animales.
La primera etapa involucra la adherencia inicial a la mucosa intestinal o a la capa de mucus o a ambas. Tanto AAF/I como AAF/II parecen ser las mediadoras de esta primera etapa. En la segunda etapa se produciría un incremento en la producción de mucus, que conduciría a la formación de una biopelícula espesa conteniendo bacterias. Esta biopelícula podría facilitar la colonización persistente y contribuir a la mala absorción de nutrientes. La tercera etapa, sugerida por evidencias histopatológicas y moleculares, incluiría la elaboración de citotoxinas que podría resultar en daño de las células intestinales. Con respecto al sitio de colonización, los datos no son concluyentes, pero las evidencias señalan como más probable la colonización del intestino delgado.^19,20
Epidemiología
Un número creciente de publicaciones sostienen la asociación entre diarrea y EAEC en los países en vías de desarrollo, con mayor prominencia en diarreas persistentes (14 días o más).
Parece haber una asociación geográfica entre EAEC y diarrea. En la India, por ejemplo, se publicaron diferentes trabajos en los cuales EAEC fue hallado en diarreas persistentes, pacientes ambulatorios e internados y casos esporádicos detectados durante estudios de vigilancia. También existen estudios realizados en Brasil, en los cuales EAEC se asoció con diarreas persistentes en un elevado porcentaje de casos. EAEC también ha sido implicada como agente causal en casos esporádicos en México, Chile, Bangladesh e Irán.
Si bien la mayoría de los trabajos implican a EAEC en casos esporádicos endémicos de diarrea, cada vez se informa un mayor número de brotes en los cuales este patógeno está involucrado.²¹ Un ejemplo es el trabajo de Eslava²² que describe dos brotes de diarrea ocurridos en el servicio de nutrición de un hospital de la ciudad de México. Smith y col. informaron cuatro brotes en Gran Bretaña en 1994, que involucraron 19, 10, 51 y 53 pacientes. Los síntomas en estos pacientes fueron vómitos y diarrea, habitualmente sin fiebre. Si bien cada uno de estos brotes estuvo relacionado con el consumo de comida en un restaurante, no se pudo identificar un origen único.
Detección y diagnóstico
La infección por EAEC se diagnostica mediante el aislamiento de E. coli de las heces del paciente y la demostración del patrón agregativo en células HEp-2. Esta prueba es el gold standard. Si bien se describieron diferentes variantes de esta técnica, varios estudios comparativos sugieren que la forma original de incubación de las bacterias con las células durante 3 horas, sin cambio de medio, es la que mejor permite discriminar entre los tres patrones, difuso, agregativo y localizado.
Se demostró que el plásmido de 60 mDa presente en la mayoría de EAEC tiene un alto grado de homología entre las diferentes cepas. A partir de él se desarrolló una sonda de 1 Kb que, en general, presenta elevada especificidad.^23,24 Se diseñaron primers para detectar diferentes regiones del plásmido de 60 mDa. Estos primers pueden estar dirigidos a las regiones estructurales o de regulación de la expresión de las fimbrias o a la identificación de los genes codificadores de toxinas.
Los laboratorios de bacteriología clínica no disponen, habitualmente, de un laboratorio de cultivo de células para poder arribar al diagnóstico preciso de EAEC. En nuestro medio, el esquema de diagnóstico no permite discriminar entre EPEC y EAEC, ya que la clasificación se realiza sobre la base de pruebas serológicas. En las figuras 1 y 2 se observa la distribución de frecuencias de patógenos aislados en el Hospital Materno Infantil Dr. Humberto Notti durante 1995 y 1996. Se observa que, en general, EPEC se aísla en segundo lugar entre los patógenos bacterianos, con una frecuencia de alrededor de 20%.

Figura 1. Distribución de frecuencias de patógenos aislados durante 1995 en el laboratorio de Bacteriología del Hospital Materno Infantil Dr. Humberto Notti de la provincia de Mendoza, Argentina.

Figura 2. Distribución de frecuencias de patógenos aislados durante 1996 en el laboratorio de Bacteriología del Hospital Materno Infantil Dr. Humberto Notti de la provincia de Mendoza, Argentina.

El interés por arribar a un diagnóstico certero que permitiera evaluar la importancia de EPEC no sólo en cuanto a su frecuencia, sino a las características de las cepas circulantes en nuestro medio condujo a la realización de un primer trabajo,²⁵ en el que se utilizaron ensayos de adherencia en células para distinguir entre los patrones localizado, difuso y agregativo, relacionados con diferentes categorías diarreigénicas, como se aclaró anteriormente. El fenotipo de adherencia localizada fue encontrado en 15% de las cepas y el agregativo en 21%. Estos resultados señalaron que entre las cepas clasificadas como EPEC sobre la base de la serología existía otra clase de cepas, con factores de patogenicidad específicos, diferentes de EPEC.
A partir de estos resultados se propuso un segundo trabajo, orientado a proponer una metodología alternativa, que se utilice como prueba de tamizaje y que permita restringir el cultivo de células para la confirmación del resultado.
Este estudio estuvo orientado a evaluar la utilidad de PCR como herramienta para el diagnóstico de EAEC, comparando los resultados con los obtenidos a través de la prueba de referencia.
Materiales y método
Se estudiaron 87 cepas de Escherichia coli aisladas durante 1995 y 1996, identificadas por pruebas bioquímicas y serología, correspondiendo cada cepa a un caso de diarrea. La población estudiada corrrespondió a niños menores de 2 años con diarrea aguda, atendidos en el Hospital Materno Infantil Dr. Humberto Notti de la provincia de Mendoza.
Las muestras fueron obtenidas por evacuación espontánea, recogidas en recipientes estériles y procesadas dentro de las 2 horas. Se realizaron extendidos para examen microscópico directo de materia fecal con tinción de Gram, tinción de azul de metileno (observación de leucocitos) y examen en fresco para la detección de Entamoeba histolytica y Giardia lamblia; para la investigación de Cryptosporidium se realizó tinción de Ziehl-Neelsen modificada.
Una dilución adecuada de materia fecal se destinó a la siembra en placas de Petri con agar Mac Conkey. De cada placa se tomaron 3 colonias fermentadoras de lactosa y se les realizaron las pruebas bioquímicas de rutina.
En cada colonia tipificada bioquímicamente como Escherichia coli se investigaron los antígenos somáticos "O", por la técnica de aglutinación en portaobjetos, utilizando sueros monovalentes provistos por el Instituto Malbrán. Los serogrupos investigados fueron los siguientes: O26, O44, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O136, O142. La investigación de factores de patogenicidad por PCR y ensayo de adherencia en células se realizó en las cepas que fueron positivas para alguno de los serogrupos mencionados.
Ensayo de adherencia en células HEp-2
Se utilizaron células HEp-2 (ATCC: American Type Culture Collection), adquiridas en la Asociación Banco Argentino de Células (ABAC). Las células se cultivaron en Minimum Essential Medium (MEM) con sales de Earle (Sigma Co.), suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gen) sin antibióticos, en estufa a 37ºC y 5% de CO₂. Se adaptó el método descrito por Cravioto y col. en 1979. Los frascos de cultivo con monocapas de células fueron tripsinizados para desprender las células, que se resuspendieron en MEM con suero fetal bovino 2%. Se realizó recuento celular en cámara de Neubauer y luego 2.5x10⁴ células se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio dentro de placas de Petri de vidrio de 50 mm y se incubaron hasta que alcanzaron el 70% de confluencia (24 hs.). Se retiró el MEM y se remplazó por medio fresco con 0.5% de D-manosa. Se inocularon las placas con 20 μl de caldos de cultivos bacterianos, durante 3 horas a 37°C, se retiró el caldo, se lavó tres veces con PBS, se fijó con metanol y se coloreó con Giemsa al 7.5%. Las cepas de referencia utilizadas en cada ensayo fueron: 2348/69: patrón de adherencia localizada; AA17-2: patrón agregativo; RS51-1: patrón difuso, HS (O9:H4): patrón negativo. Los ensayos se realizaron por duplicado. Los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos y se observaron con aumento 1 000x.
Amplificación de un fragmento de la fimbria AAF/I
Esta región forma parte del plásmido pCVD432 que está relacionado con el patrón de adherencia agregativa en el ensayo en células HEp-2. Se utilizó el siguiente set de primers:
pCVD432/start (5' CTG GCG AAA GAC TGT ATC AT 3') y pCVD432/stop (5' CAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T 3'). El tamaño del fragmento amplificado es de 630 bp.²⁶
A continuación se transcribe la región amplificada y la ubicación de los primers ensu interior:



Condiciones de la reacción
Mezcla de nucleótidos trifosfato (dNTP): 0.2 mM; MgCl₂: 1.5 mM; cebadores: 0.5 μM de cada uno; Taq polimerasa: 2 unidades; buffer 10x (usar 1X). Volumen final: 50 μl.
Esquema de ciclado
1 paso de 5 min a 94ºC
30 ciclos de 40 s a 94ºC
30 ciclos de 1 min a 53ºC
30 ciclos de 1 min a 72ºC
1 paso de 3 min a 72ºC
Control positivo: cepa AA 17-3
Control negativo: cepa HS
Amplificación de un fragmento del gen de la enterotoxina EAST1 (Enteroaggregative Heat Stable Enterotoxin I)
Los cebadores fueron diseñados para amplificar una región de 108 pares de bases (bp) del gen astA-1, que codifica para la enterotoxina EAST1 de EAEC.
Estos fueron diseñados en el Institut für Hygiene und Mikrobiologie de la Universidad de Würzburg, Alemania (datos no publicados).
START 5´ GCC ATC ACA GTA TAT CCG 3´
STOP 5´ GCG AGT GAC GGC TTT GTA GT 3´
A continuación se reproduce parte de la secuencia del gen obtenida del Genbank N° de acceso L11241



Condiciones de la reacción
Mezcla de nucleótidos trifosfato (dNTP): 0.2 mM; MgCl₂: 1.5mM; cebadores: 0.6 μM de cada uno; Taq polimerasa: 2 unidades; buffer 10x (usar 1X).
Esquema de ciclado
1 paso de 5 min a 94ºC
30 ciclos de 40 s a 94ºC
30 ciclos de 1 min a 65ºC
30 ciclos de 1 min a 72ºC
1 paso de 3 min a 72ºC
Control positivo: cepa AA 17-3
Control negativo: cepa HS
Preparación del templado
Se incubó 1 ml de un caldo de cultivo bacteriano en TSB (tripticasa soya broth) durante 18 horas. Se centrifugó y el sedimento fue tratado con 150 μl de Tritón 1% y hervido durante 10 minutos a 100ºC y centrifugado 5 minutos a 10 000 rpm. Para la reacción de PCR se emplearon 10 μl de templado.
Análisis con enzimas de restricción
El análisis con enzimas de restricción constituye una metodología para comprobar que el fragmento amplificado presenta la secuencia específica. Después de la reacción de PCR se llevó a cabo la digestión con AluI que corta el producto de PCR de los primers de AAF/I en dos fragmentos de 391 y 239 bp²⁶ y con HhaI que corta el producto de PCR de astA-1 en dos fragmentos de 71 y 37 bp.²⁷ En la figura 3 se observa la fotografìa que muestra los productos de PCR.

Figura 3. Productos de PCR de los primers pCVD 432 y astA y análisis con enzimas de restricción. M: Marcador de peso molecular 100 bp. 1: Producto de amplificación de 630 bp de pCVD432. 2,3: Producto de digestión del amplificado de pCVD432, de 391 bp y 239 bp obtenido con la enzima de restricción Alu I. 4: Control negativo. 5: Producto de amplificación de 108 bp de astA. 6,7: Producto de digestión del amplificado de astA, de 71 bp y 37 bp obtenido con la enzima de restricción Hha I.

Resultados
Como se observa en la figura 4, según el ensayo de adherencia en células HEp-2, 22 cepas (25%) mostraron el patrón de adherencia localizada; 18 cepas (21%) presentaron adherencia agregativa; 10 (11%) evidenciaron el patrón difuso. Estos resultados fueron similares a los hallados en un trabajo anterior.²⁵ En las figuras 5, 6 y 7 se observan las fotografìas correspondientes a los patrones de adherencia.

Figura 4. Distribución de los patrones de adherencia en células HEp-2. La figura muestra el porcentaje observado para cada patrón, sobre un total de 87 cepas.

Figura 5. Patrón de adherencia localizada (1 000x) Las flechas señalan los acúmulos de bacterias típicos.

Figura 6. Patrón de adherencia difusa (1 000x). Se observa la distribución de las bacterias sobre la superficie de las células, con escasa o nula adhesión sobre el cubreobjeto.

Figura 7. Patrón de adherencia agregativa (1 000x). Las bacterias forman acúmulos entre sí, sobre las células y sobre la superficie del cubreobjeto.

La tabla 1 muestra los resultados de PCR para AAF/I y de adherencia agregativa en el ensayo en células HEp-2. Ocho cepas de las 18 que presentaron el patrón de adherencia agregativa portaron el gen de AAF/I. Las 10 cepas que presentaron adherencia agregativa pero fueron negativas para AAF/I estarían indicando que otros factores, fimbriales o no, podrían estar involucrados en la adherencia. Cinco cepas positivas para AAF/I no presentaron el fenotipo agregativo, lo que señala la posibilidad de existencia de otras condiciones para la expresión de la fimbria de adherencia.

Tabla 1. Comparación de los resultados de PCR para AAF/I PCR y del patrón de adherencia agregativa en el ensayo en células HEp-2.

La tabla 2 compara el resultado de EAST1 PCR y el ensayo en HEp-2. Mientras que 25 cepas portaron el gen de EAST1, sólo 13 de éstas expresaron el patrón de adherencia agregativa en el ensayo en HEp-2, lo cual parece estar en relación con el hecho de que la presencia del gen de EAST1 fue encontrado en otras categorías de E. coli diarreigénicas como EPEC y EHEC. Cinco cepas que presentaron el fenotipo agregativo en el ensayo en HEp -2 fueron negativas para EAST1.

Tabla 2. Comparación de los resultados de PCR para EAST 1 PCR y del patrón de adherencia agregativa en el ensayo en células HEp-2.

La tabla 3 compara la presencia de uno o ambos genes con el ensayo en HEp-2. Treinta y dos cepas portan los genes, elevando considerablemente la sensibilidad de la reacción de PCR. El fenotipo agregativo se observó en 17 de las 32 muestras portadoras de los genes; en general las cepas EAST1 positivas fueron las que carecían de dicho fenotipo.

Tabla 3. Comparación de los resultados de PCR para AAF/I/EAST 1 PCR y del patrón de adherencia agregativa en el ensayo en células HEp-2.

Discusión
Escherichia coli diarreigénica (DEC) representa un blanco elusivo a la hora del diagnóstico debido a que no resulta fácilmente distinguible de las cepas que no portan factores de virulencia y que son habitantes normales del intestino humano y de los animales.
En el primer trabajo realizado por nuestro grupo,²⁵ se detectó 21% de cepas EAEC, clasificadas sobre la base de su patrón de adherencia. Esto despertó un interés especial por investigar la distribución y relación epidemiológica de estas cepas en nuestra comunidad. Con el propósito de desarrollar una metodología rápida, sensible y específica que permitiera el estudio de un número considerable de cepas, se desarrollaron dos tipos de PCR, aplicables al diagnóstico de EAEC. Se utilizaron primers descritos y probados por otros autores, para identificar AAF/I y EAST1.²⁷
Una de las desventajas de PCR como método de diagnóstico lo constituye el hecho de que la observación de la banda del producto de amplificación otorga información sobre el tamaño de una molécula de ADN, pero no sobre su secuencia. Por ello es que si se utiliza esta reacción como método de diagnóstico único, debería acompañarse de un sistema que permita corroborar que el amplificado corresponde a la secuencia esperada. Existen diferentes metodologías disponibles; una de ellas es la de buscar un sitio de corte para alguna enzima de restricción dentro del sector amplificado que permita distinguir dos fragmentos de tamaño conocido. Para el caso de la PCR para AAF/I, los autores describieron un sitio de corte para la enzima AluI, que fragmentaba el amplificado de 639 bp en dos partes de 391 bp y 239 bp. Para el amplificado del gen astA, para el cual no se había descrito ningún sistema de confirmación, se realizó una búsqueda con el programa PCgene, detectando un sitio diana para HhaI. Los resultados de las digestiones enzimáticas se muestran en la figura 3.
Para poder establecer la utilidad de PCR en el diagnóstico de EAEC se compararon los resultados con los obtenidos por la prueba de referencia (ensayo de adherencia en células HEp-2). En la figura 4 se observa la distribución de los patrones de adherencia. El patrón agregativo apareció, al igual que en el primer trabajo de Ortiz,²⁵ en 21% de las cepas. Si se refieren estos resultados a los datos sobre los diferentes patógenos aislados de coprocultivos en el Hospital Notti, presentados en la Introducción, se observa que durante 1995 y 1996, período durante el cual se realizó este trabajo, el porcentaje de EPEC fue del 20% en promedio. De las 87 cepas estudiadas, 20% correspondieron a la categoría EAEC clasificada sobre la base de la prueba de adherencia. Si se proyecta este dato al total de patógenos aislados durante los dos años de estudio, EAEC tendría una prevalencia similar a la de Salmonella, que es aproximadamente del 3%, lo cual permite postular la importancia de caracterizar las cepas de E. coli por sus factores de patogenicidad, lo que a su vez podría tener impacto considerable en el conocimiento de la etiología de los casos esporádicos de diarrea.
En la tabla 1 se comparan los resultados entre PCR para AAF/I y el patrón agregativo, obteniéndose una sensibilidad del 44%. Se observa que 8 de las 18 cepas que presentaron el fenotipo agregativo eran portadoras de la fimbria I; las 10 cepas que presentaron adherencia agregativa pero fueron negativas para AAF/I, lo que parece indicar que otros factores, fimbriales o no, podrían estar involucrados en la adherencia. Cinco cepas, de las 13 que fueron positivas para AAF/I presentaron un patrón diferente al agregativo. Estos resultados podrían explicarse, por un lado, por la subjetividad del ensayo de adherencia en células, y por otro, por el requerimiento de otros factores, además de la presencia del gen estructural de la fimbria, para que se produzca la adherencia.
En la tabla 2 se muestra la comparación entre PCR para astA (proteína EAST1) y el patrón agregativo. Quince por ciento de las cepas resultaron portadoras del gen astA y presentaron el patrón agregativo, mientras que 6% presentaron el patrón agregativo pero no el gen astA. La prueba resultó con una sensibilidad del 72%, considerablemente mayor que la demostrada por AAF/I, reduciéndose la especificidad del 92.7% al 82.61%.
Se observa, además, que 13.7% de las cepas estudiadas fueron positivas para astA y no presentaron adherencia agregativa. Existen evidencias, descritas por diferentes autores, de que el gen astA tendría una distribución amplia entre las cepas de E. coli diarreigénicas, no encontrándose restringido sólo a EAEC. De hecho, fue hallado en DAEC y EPEC,²⁸ en ETEC²⁰ y en EHEC,^29-31 razón por la cual fue incluido como posible Escherichia coli diarreigénica (DEC).³²
Para el diseño de la tabla 3 se utilizó como criterio considerar positivas las cepas portadoras de AAF/I, de astA, o de ambos (prueba en paralelo). De este modo se observa que el porcentaje de cepas clasificadas como positivas por ambas pruebas es de 19.5%, bastante cercano al valor observado para el patrón de adherencia agregativa en la figura 4. La sensibilidad de la prueba fue 94.4% y la especificidad 78.2%. El valor global, es decir la posibilidad de que la cepa sea clasificada correctamente por la prueba, es de 81.6%.
Estos datos sugieren que la detección de ambos genes es la que otorga mayor utilidad a la prueba, por lo que se postula su empleo como método de tamizaje, limitando el empleo del ensayo de adherencia, más costoso y laborioso, a aquellas cepas portadoras de los genes.²⁷
Conclusión
La implementación de técnicas que detectan factores de patogenicidad específicos permitió identificar EAEC en los coprocultivos de la población infantil estudiada, pone en evidencia la heterogeneidad que presentan las cepas pertenecientes a esta categoría de E. coli diarreigénicas y demuestra la necesidad de métodos de diagnóstico complementarios a los que rutinariamente se utilizan en los laboratorios bacteriológicos. La prevalencia estimada para EAEC fue de 3%; si la búsqueda se ampliara, realizándose en forma independiente del serogrupo, este porcentaje podría ser mayor. Teniendo en cuenta la importancia de EAEC como patógeno emergente se sugiere la implementación del diagnóstico diferencial por PCR y su posterior confirmación por el método de referencia.
Los autores no manifiestan conflictos.

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