IMMUNODIAGNOSE OF NEUROCYSTICERCOSIS: EVALUATION OF AN ANTIGEN FROM TAENIA CRASSICEPS CYSTICERCUS

Abstract
We report here the evaluation of an antigen from Taenia crassiceps cysticercus as a potential reagent in an enzyme-immunoeletrotransfer blotting assay (EITB) and an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of neurocysticercosis using clinical specimens obtained from patients in different phases of the disease. Serum and cerebrospinal fluid (CSF) samples from 64 patients suspected of having neurocysticercosis (NC) according to clinical manifestation and brain computed tomography (CT) were tested by ELISA with Taenia solium total saline antigen (ELISA - Tso) and by immunoblotting with Taenia crassiceps glycoproteins antigen (EITB-gpTcra). From this serum samples 45 were also available for EITB-gpTso and 30 for ELISA-gp14 analysis. Serum samples from apparently healthy individuals without any parasitic disease and serum samples from patients with other parasitic diseases were included as controls. The results of ELISA-Tso with CSF obtained from 64 patients with NC showed that 53 (83%) were reactive. EITB-gpTcra with serum from the same group of patients showed a sensibility of 91%. The EITB-gpTso and EITB-gpTcra tested with serum samples, demonstrating an agreement of a 100% between both tests. When ELISA-gp14 results were compared to EITB-Tso results, an relative sensibility of 95% was observed and showed a specificity of 99. This fraction was purified only in one step with a good yield for use in immunoassay. We suggest that gp14 Tcra antigen can be used for detecting anti-cysticercus antibodies in serum samples for seroepidemiology and also for screening of NC patients.

Key words
Neurocysticercosis, ELISA, glycoproteins, Taenia crassiceps, serodiagnosis

Artículo completo
Introdução
A cisticercose humana é causada pela presença no organismo da larva da Taenia solium. A localização desta no sistema nervoso central (Neurocisticercose - NC) é a forma mais grave da doença.⁵ A doença tem distribuição mais freqüente nos países em desenvolvimento e emergentes em áreas consideradas não endêmicas.²² No Brasil, a maioria das informações referentes a NC é baseada em dados clínicos,¹⁸ resultados de testes imunológicos²¹ ou achados de autopsia.³
O diagnóstico preciso etiológico da cisticercose é muito importante já que esta doença apresenta sinais e sintomas diversos. As técnicas de imagem (tomografia computadorizada / ressonância magnética nuclear – TC/RMN) e as técnicas imunodiagnósticas são consideradas ferramentas importantes nesse caso.²³ A utilização dos ensaios imunoenzimáticos (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA; enzyme-linked immunoelectrotransfer blot – WB) na detecção de anticorpos em amostras de líquido cefalorraquiano (LCR) e amostras de soro tem sido amplamente proposto para o diagnóstico laboratorial da cisticercose.^8,10,24 Um método de WB desenvolvido com grupo de glicoproteínas obtidas de cisticercos da T. solium purificadas por cromatografia de afinidade em lentil lectina, mostrou alta sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos em pacientes com dois ou mais cistos no SNC.²⁰ Entretanto a utilização deste antígeno no ELISA apresentou baixa especificidade, observando-se reação cruzada principalmente com amostras de pacientes com hidatidose. A obtenção de porcos infectados para utilização dos cisticercos no preparo de antígeno é muito difícil e pouco produtivo. Os cisticercos de Taenia crassiceps reapresentam um modelo experimental importante e pode ser usado para preparação de antígeno de um modo simples e em quantidades suficientes. O objetivo desse trabalho foi avaliar o desempenho do método de ELISA para o diagnóstico laboratorial da neurocisticercose, usando antígeno especifico purificado do cisticerco de T. crassiceps. A purificação foi feita em uma única etapa em eletroforese preparativa.
Materiais e métodos
Pacientes e amostras clinicas
Amostras de sangue e líquido cefalorraquiano foram obtidas de 64 pacientes com suspeita de NC de acordo com as manifestações clínicas e imagens de TC compatíveis.¹³ Todas as 64 amostras de LCR foram avaliadas pelo método de ELISA-Tso e todas as amostras de soro (64) foram analisadas no WB-gpTcra, entretanto apenas 45 amostras de soro foram analisadas no WB-gpTso e apenas 30 amostras de soro pelo ELISA-gp14Tcra.O grupo controle negativo (CN) era constituído de amostras de sangue de 8 indivíduos saudáveis e amostras de sangue de 69 pacientes que apresentavam outras parasitoses foram usadas como grupo OP (T. saginata, 6; Hymenolepis nana, 5; Shistosoma mansoni, 13; Ascaris lumbricoides, 10; Ancylostoma sp., 11; Strongyloides stercoralis, 7; Trichiuris trichiura, 7; Echinococcus granulosus, 10). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital da Faculdade de medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil.
Parasitas e antígenos
Antígeno total de cisticerco de T. solium (Tso) foi obtido da Biolab Diagnóstica. Antígeno do fluido vesicular de cisticercos de T. crassiceps (Tcra) foi obtido segundo Vaz et al., 1997.²¹ As glicoproteínas do cisticerco de T. crassiceps (gpTcra) foram isoladas por cromatografia de afinidade em coluna de ConA-Spharoes 4B. O antígeno glicoprotéico de 14 kDa (gp14Tcra) foi obtido a partir do antígeno de fluido vesicular por eletroforese preparativa - SDS-PAGE de acordo com as instruções do fabricante. Através da análise de SDS-PAGE em mini-gel, as condições ótimas para a preparação do gel de poliacrilamida foram estabelecidas, sendo de 12% T com uma altura de 7.5 cm e a corrida eletroforética foi realizada a uma corrente constante de 40 mA (250-350 V). Aproximadamente 14.0 mg de proteína do antígeno Tcra foram aplicadas no gel e as frações coletadas analisadas por eletroforese analítica. A concentração protéica das amostras foi determinada pelo método de BCA.
Procedimento do ELISA
O ELISA –Tso foi feito de acordo com Bueno et al., 2000,¹ e as amostras de LCR foram testadas por este método. O ELISA – gp14Tcra foi padronizado no nosso laboratório utilizando como antígeno a glicoproteína de 14 kDa. A concentração de antígeno usado foi de 5.0 μg/ml em tampão carbonato 0.06 M pH 9.6 e a sensibilização das placas foi feita por 1 hora a temperatura de 37^ºC e 12 horas a 4^ºC. As amostras de soro foram diluídas 1/100 em tampão PBS, pH 7.2, contendo 0.3% de Tween 20 e 5% de leite desnatado. As incubações com soro e conjugado foram de 30 min. a 37^ºC e com o substrato de 20 min. a temperatura ambiente e câmara escura.
Western blot (WB)
A eletroforese SDS-PAGE das glicoproteínas obtidas do antígeno gpTcra foi feita com gel a 12% e o WB realizado de acordo com Teixeira et al., 1994.¹⁹ Também foi realizado um WB com antígeno de Tso, utilizando um conjunto diagnóstico comercial.
Análise da seqüência de protéica
O seqüenciamento do N-terminal foi feito de acordo com De Simone et al., 1994⁴. A fração gp14Tcra, obtida da eletroforese preparativa, foi submetida a um SDS-PAGE (12%) e a proteína eletrotransferida para membrana de fluoreto de poliviniliidene (PVDF-0.2 μm). Após transferência, a banda protéica é visualizada por coloração com Coomassie Brilliant Blue, cortada e levada para o seqüenciador Model PSQ-1 de fase gasosa, utilizando a técnica de degradação de Edman, seguindo recomendações do fabricante.
Resultados e Discussão
O resultado do ELISA-Tso com amostras de LCR dos 64 pacientes mostrou que 53 (83%) foram reativas (tabela 1). A análise do WB-gpTcra com soro do mesmo grupo de pacientes mostrou sensibilidade de 91% (tabela 2). Os métodos de WB-gpTso e WB-gpTcra foram 100% concordantes nas amostras de soro analisadas. Trinta amostras de soro do grupo de pacientes NC foram analisadas pelo ELISA-gp14Tcra. Neste grupo de pacientes, 25 apresentavam resultados positivos nas amostras de LCR pelo ELISA-Tso, enquanto 21 amostras de soro eram positivas no WB-gpTcra e 19 eram também positivas no WB-Tso. O ELISA-gp14Tcra foi positivo em 23 (77%) soros e 22 eram positivos no LCR. Quando os resultados do ELISA-gp14Tcra foram comparados com o WB-Tso, foi observada uma sensibilidade relativa de 95%. Todas as amostras de soro do grupo CN foram negativas no ELISA-gp14Tcra e apenas uma amostra de soro, de um indivíduo com Taenia saginata foi reativo neste ensaio, mostrando uma sensibilidade de 99% (figura 1).

Figura 1. Resultado do ELISA - gp14 para detecção de anticorpos IgG, realizado em amostras de sangue do grupo de pacientes com Neurocisticercose (NC; n = 30), do grupo de indivíduos saudáveis (CN; n = 8) e do grupo de pacientes com outras parasitoses (OP; n = 70). IEU – unidade imunoenzimática. As barras horizontais indicam a média das IEU para cada grupo.

A pureza da fração isolada por eletroforese preparativa foi feita por SDS-PAGE e somente uma banda correspondente ao peso molecular de 14 kDa foi observada (coloração pela prata). A seqüência parcial dos 15 primeiros aminoácidos da subunidade de 14 kDa da T. crassiceps, não mostrou homologia com seqüências depositadas em bancos de dados ("FASTA search of GenBank data base") ou com seqüências do parasita conhecidas (tabela 3).



Com base em evidências recentes indicando que peptídeos com peso molecular abaixo de 20 kDa no antígeno Tcra são imunoreativos,^1,2,6 nós avaliamos o WB-gpTcra e observamos a presença de duas bandas de 14 e 18 kDa que se mostravam mais específicas para pacientes com NC. Por esta razão, nós decidimos purificar o peptídeo de 14 kDa para poder avaliar o seu uso como reagente no sorodiagnóstico da NC. Os resultados mostraram que o ELISA padronizado com o peptídeo de 14 kDa pode ser utilizado para o diagnóstico e diferenciação da NC de outras infecções parasitárias. O uso de cisticercos de Tcra para detecção de anticorpos no LCR em pacientes com NC tem sido descrito na literatura.^12,21 Em amostras de sangue, o ELISA utilizando fluido vesicular de Tcra apresentou 20% de resultados falsos positivos.¹ O WB tem sido indicado como um teste adicional para o sorodiagnóstico da NC^14,20 e o WB-gpTcra utilizando glicoproteínas purificadas pode ser uma alternativa como método diagnóstico. Os nossos resultados mostraram sensibilidades semelhantes para os métodos de ELISA-gp14Tcra e WB-gpTcra. A detecção de anticorpos em amostras de soro, através da utilização de antígenos de baixo peso molecular, tem sido considerada específica^2,15 e nossos resultados confirmam este achado. Outros autores descrevem a utilização do método de ELISA com antígenos diversos, apresentando sensibilidades e especificidades na faixa de 70% a 100%.^7,9,11,16,17 No presente trabalho o método de purificação do antígeno gp14Tcra foi simples com uma única etapa e apresentando bom rendimento (2% do extrato bruto total). Baseado nessa análise seria recomendado a utilização do antígeno gp14Tcra para detecção de anticorpos Anticisticercos em amostras de soro, em estudos epidemiológicos e também como teste adicional para a triagem de pacientes com suspeita de NC. Estudos estão sendo realizados por nosso grupo, para clonar e expressar antígenos de cisticercos de T. crassiceps e também para a produção e utilização de peptídeos sintéticos. Entendemos a necessidade do desenvolvimento de ensaios simples de alta sensibilidade para o diagnóstico da cisticercose, contribuindo para a melhora do tratamento e controle da doença.
Los autores no manifiestan conflictos.

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