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Introducción
La investigación de la enfermedad de Chagas es motivadora debido a que afecta a millones de personas en América Latina. El deseo de contribuir a entender aspectos de la morfogénesis del Trypanosoma cruzi con propósitos terapéuticos nos lleva a la publicación de trabajos científicos que deben aceptar rígidas normas, que de algún modo limitan la posibilidad de transmitir la experiencia y detalles complementarios de la investigación. A veces esos detalles se suman y pueden, en conjunto, abrir nuevos caminos. La Sociedad Iberoamericana de Información Científica (SIIC) fomenta un lenguaje científico que permite hacer conocer esos resultados.
En este caso, se comienza con una exploración bibliográfica de investigaciones sobre obtención de amastigotes extracelulares de Trypanosoma cruzi. Esta investigación lleva a un trabajo experimental que pretende comprobar mecanismos desencadenantes de la morfogénesis in vitro para luego extrapolar resultados y elaborar una hipótesis que podría explicar los mismos fenómenos in vivo.
La enfermedad de Chagas, o mal de Chagas, es provocada por el Trypanosoma cruzi. Es una de las infecciones parasitarias más importantes en el hemisferio occidental, especialmente en América Latina. Se estima que 35 a 50 millones de personas corren el riesgo de ser afectadas y un 20% de esa cifra padece probablemente la enfermedad.²⁴ El 10% de los infectados sufren enfermedad cardíaca que los convierte prácticamente en incapacitados en la edad más productiva de su vida. Estos hechos demuestran ampliamente la necesidad de continuar la investigación en esta área.
El ciclo de vida del T. cruzi,⁴ es uno de los más complicados entre los parásitos que afectan al hombre.²² El estadio tripomastigote se encuentra circulante en la sangre, mientras que el estadio amastigote, el cual es responsable directa o indirectamente de las lesiones producidas en corazón y cerebro, es intracelular y allí se reproduce como tal.
La forma o estadio epimastigote solo se encuentra en el insecto vector,⁴⁹ ha sido ampliamente estudiado desde el punto de vista bioquímico e inmunológico, utilizando cultivos in vitro.³⁷ Sin embargo, son los otros dos estadios mencionados, tripomastigote y amastigote, responsables in vivo de las alteraciones que caracterizan la enfermedad. Para entender el ciclo del parásito y la enfermedad resultante, es prioritario el estudio de los mecanismos funcionales del estadio amastigote.
Los cultivos de T. cruzi in vitro, especialmente aquellas cepas aisladas de vertebrados en medios definidos o semidefinidos libres de células, son importantes ya que aportan información sobre mutación, metabolismo y transformación de sus diferentes estadios morfológicos. Esta misma información se utilizó para el estudio del parásito desde el punto de vista inmunológico y para la obtención de antígenos.³¹ Por otra parte, el cultivo de amastigotes se realizó utilizando cultivos de tejidos,^{1,18,19,21,38} y estudiando sus propiedades inmunológicas.³⁶
Se han obtenido amastigotes en forma temporal en medios de cultivos definidos o semidefinidos.^4,22,30,33 Estos métodos de cultivos –al igual que los obtenidos en cultivos celulares ya mencionados– no son realmente apropiados para estudiar la fisiología, la bioquímica, la mutación, la inmunología y la transformación de los diferentes estadios del parásito, debido a la característica de indefinición de su formulación química o contaminación con material celular.
Finalmente, tras una serie de experimentos en un medio de cultivo libre de células, Pan^25,26 obtuvo cultivos seriados de amastigotes a partir de epimastigotes que evolucionaron vía tripomastigotes. Estos amastigotes tienen características fisiológicas y morfológicas similares a las de aquellos que han sido obtenidos en cultivo de tejidos in vivo.²⁹
Las causas de los cambios de los diferentes estadios de T. cruzi en cultivo libre de células no son bien conocidas. Se ha informado que el suero de pollo contiene por lo menos dos factores que afectan el estadio epimastigote provocando lisis.^40,41 Otras investigaciones en medio de cultivo libre de células incubadas a 24.5ºC, 29.5ºC, 32.5ºC y 35.5ºC permitieron obtener en forma predominante amastigotes y propagarlos indefinidamente por subcultivo. En estos trabajos se sugirió que el plasma de pollo en ellos utilizado fue responsable directa o indirectamente en la inducción de amastigotes.^25,26 En otras investigaciones se comprobó una proporción alta de tripomastigotes metacíclicos en la fase final de crecimiento logarítmico en cultivos in vitro.^6,7 Esa diferenciación de epimastigotes a tripomastigotes metacíclicos fue estimulada por la acumulación de ácidos orgánicos al final de la curva de crecimiento.¹²
Pan²⁷ describe un medio libre de células incubado 37ºC por el cual se obtienen amastigotes a partir de epimastigotes, vía tripomastigotes. Estos amastigotes han podido ser subcultivados y mantenidos indefinidamente. En este nuevo método de cultivo, los factores responsables por la inducción de amastigotes no fueron identificados.
Engel y Dvorak¹¹ describen un método de obtención de amastigotes extracelulares a partir de epimastigotes mediante el cambio del medio de cultivo en intervalos preseleccionados.
Los factores que actúan contra epimastigotes que se encontraban en suero de pollo^40,41 fueron observados por Zaidenberg.^43-48 En estos trabajos se utilizaron distintas fracciones de plasma de pollo, lo que confirma el papel en la génesis de lisis de epimastigotes y al mismo tiempo inducción de amastigotes. Simultáneamente encontró que el plasma humano posee propiedades similares de efectos líticos y morfogénicos. Además comprobó que para que actúe el plasma humano o de pollo o ambos, el ión Ca⁺⁺ es indispensable. Por otra parte, una preincubación de epimastigotes con otras proteínas, como por ejemplo suero fetal de ternera, bloquea el proceso de transformación provocado por los plasmas mencionados si son agregados en forma casi inmediata después de la incubación. Esta actividad bloqueante no se observaba si los plasmas de pollo o humano eran agregados cierto tiempo después. Esto sugirió la presencia de una cubierta artificial formada por las proteínas del suero fetal de ternera, las cuales inhibieron la acción de los plasmas. También se sugirió que un fenómeno similar fuese la causa de que los parásitos que no se transformaban in vitro eran siempre tripomastigotes, debido probablemente a que poseen una capa natural²⁹ que los protegería contra el efecto del plasma. Estos tripomastigotes no afectados son equiparables a los mismos que se observan in vivo en la sangre de pacientes infectados por T. cruzi.
Hasta 1990,⁴⁷ el de plasma de pollo o humano in vitro fue utilizado únicamente para obtener transformaciones permanentes de epimastigotes en amastigotes. La transformación de tripomastigotes, aislados de sangre, en amastigotes en medio de cultivo libre de células por medio de los mencionados plasmas y sus fracciones no había sido intentada, Zaidenberg⁴⁷ indujo la transformación de tripomastigotes, aislados de sangre, en amastigotes y estudió el ciclo evolutivo desarrollado en ese proceso. Por otra parte, y a partir de la contradicción demostrada acerca de que los plasmas de pollo y humano son inductores de morfogénesis^{25,26,43,45,46} y al mismo tiempo de lisis del parásito^40,41 por activación de la cadena del complemento,^23,17 sugirió que las mismas sustancias que afectan la supervivencia del parásito sean señales que podrían desencadenar adaptaciones biológicas de resistencia que implican cambios de estadios morfofisiológicos y multiplicación.
Estos fenómenos que se presentan en la complejidad de la condición in vitro, tanto en el huésped mamífero como en el insecto vector, fueron estudiadas por Zaidenberg⁴⁷ en un modelo in vitro a partir de poblaciones puras de epimastigotes, tripomastigotes y amastigotes.
En esa investigación se utilizaron dos cepas clonadas de T. cruzi, la Bra C15C2, de baja patogenicidad, y la H510C8C3, de alta patogenicidad.³⁰ El medio de cultivo empleado fue F69²⁷ al que se agregaban modificaciones de prueba: plasma de pollo (F69PP), plasma humano (F69 PH) o complemento de cobayo (F69 CC). Las técnicas utilizadas fueron las de rutina en ese tipo de trabajos.^25-28,46
Las temperaturas de incubación fueron 26.5ºC ± 0.5, 35.5ºC ± 0.5 y 36.5ºC ± 0.5. Los cultivos se cuantificaron por conteo en cámara y se colorearon con Wrigth Giemsa para su diagnóstico morfológico y su clasificación por estadio¹⁴ cada 96 horas, en ocasiones por lapsos mayores.
En los experimentos con tripomastigotes del clon H510 C8 C3 obtenidos in vivo de ratones infectados y sembrados en el medio F69 incubado a 36.5ºC ± 0.5 se observó que los tripomastigotes se transformaron en el siguiente orden: formas regresivas, amastigotes, formas progresivas, tripomastigotes jóvenes que pasaron nuevamente a amastigotes, presumiblemente a través de formas regresivas y que a su vez evolucionaron hacia formas progresivas y epimastigotes.
La presencia de considerable número de amastigotes a las 24 horas y su falta de multiplicación, inferida por el bajo o disminuido incremento de parásitos, permitió suponer que esos amastigotes requirieron más de 24 horas para comenzar su multiplicación. Ese período silencioso (lag period) de aproximadamente 40 horas coincidió con el descrito por Hyde y Dvorak,¹⁵ infectando cultivos celulares de mamíferos con T. cruzi. Lo que podría indicar que en ese medio acelular el período de adormecimiento es propio del estadio amastigote y no provocado por las células en las que usualmente se encuentra.
La presencia de una única y original generación de tripomastigotes inmaduros, que en sí fue un nuevo marcador morfológico –puesto que no existía inicialmente– parece indicar que los tripomastigotes obtenidos de la condición in vivo de ese clon, al ser colocados en condición in vitro en medio F69 a 36.5ºC ± 0.5, realizaron un solo ciclo para después continuar su transformación en amastigotes y epimastigotes que siguieron multiplicándose como tales (figura 1).

Figura 1. Probable morfogénesis de T. cruzi; tripomastigote después de inoculado en F69 a 36.5ºC ± 0.5. 1, Inóculo: tripomastigote (de ratón infectado); 2, 3 y 4, formas regresivas; 5, amastigotes; 6 y 7, formas progresivas; 8 y 9, tripomastigotes jóvenes; 10 y 11, amastigotes en división; 12, epimastigote; 13, epimastigote en división.

Cuando se realizaron los mismos experimentos con el agregado de plasma humano (F69 PH) incubado a la misma temperatura se comprobó que el parásito cumple un ciclo secuencial similar al descrito para el F69 (sin plasma humano) con dos importantes diferencias: éste fue multicíclico, no se redujo a un ciclo, y no permitió la "desviación" del ciclo vía epimastigote (figura 2). La multisecuencia cíclica se presumió por la presencia permanente de tripomastigotes inmaduros desde que hicieron su primera aparición hasta el fin del experimento. Existió la posibilidad que algunos tripomastigotes jóvenes hubiesen madurado, ya que aparecieron formas maduras después de haberse agotado las originales. El efecto del plasma humano, además de impedir la aparición de epimastigotes, se evidenció por impedir la multiplicación de amastigotes. Excepcionalmente se observaron algunas divisiones celulares de amastigotes. Esta circunstancia no invalida la tendencia general observada. Pudo interpretarse que se trató de un lag period menos prolongado o que algunos amastigotes escaparon al "efecto represor" del plasma o que la "sustancia represora" incluida en el plasma varió su parámetro cuantitativo.

Figura 2. Probable morfogénesis de T. cruzi; tripomastigote después de inoculado en F69 a 36.5ºC ± 0.5. 1, Inóculo: tripomastigote (de ratón infectado); 2, 3 y 4, formas regresivas; 5, amastigotes; 6 y 7, formas progresivas; 8 y 9, tripomastigotes jóvenes; 10 y 11, amastigotes en división.

Ese ciclo en el F69 modificado con plasma humano (F69PH) tiene similitud, en lo referente a la secuencia cíclica y morfológica y a la ausencia de epimastigotes, con la descripción hecha por Wood⁴² con la cepa de T. cruzi NIH Brazilian en ciclo hematológico e intramuscular en ratones. Las condiciones in vitro de aquel experimento tendrían en común con las condiciones de los experimentos de Wood in vivo, la presencia del mencionado "factor modulador" que se encontraría en el plasma humano y en el plasma y tejido de ratón.
En las condiciones del medio F69 para el clon de T. cruzi H510 C8 C3, comparadas con las condiciones del F69 PH, la temperatura de 35ºC ± 0.5 fue aparentemente optima para el desarrollo del estadio epimastigote a partir de tripomastigotes vía amastigote. Lo más llamativo de ese experimento fue un gran crecimiento de epimastigotes. Pudo interpretarse que el parásito en su estadio epimastigote al encontrar temperatura óptima, por un lado, y un medio adecuado libre de las funciones lítica y represora del "factor modulador", por otro, generó una explosión de multiplicación después de cumplir un ciclo similar al ilustrado en la figura 1.
Al variar las condiciones experimentales, especialmente descenso del pH y agotamiento del "factor modulador" del plasma, se comprobaron modificaciones en la línea de morfogénesis que coincidieron con la descripción de otros trabajos, como el descenso del pH y la acumulación de metabolitos in vitro estudiados por Fernández, Castellani y Kimura,¹² que provocaron la diferenciación de epimastigotes a tripomastigotes al final de la fase exponencial.
Finalmente estos experimentos permitieron comprobar que la temperatura y factores presentes en el plasma humano tienen efecto regulador en la morfogénesis de T. cruzi, el efecto del plasma es dominante sobre la temperatura. Estos resultados son los siguientes: el plasma humano a mayor temperatura 36.5ºC influye a la población de tripomastigotes para mantener el estadio inicial, retraar su transformación en amastigotes, impedir la aparición de epimastigotes y disminuir o impedir la multiplicación del parásito. A 26.5ºC ± 0.5 la tendencia se hace menos notoria.
En ausencia del plasma humano, la temperatura mostró, per se, un efecto regulador de morfogénesis que se evidenció por: tendencia a mantener el estadio tripomastigote a 36.5ºC ± 0.5, inducir su transformación en epimastigote vía amastigote a 35ºC ± 0.5 y mantener el estadio epimastigote a 26.5ºC ± 0.5. Podría atribuirse a que la acción de la temperatura en la morfogénesis de los tripomastigotes fue debida a un mecanismo de activación de genes específicos, heat shock genes, descrito para T. brucei por Van der Ploeg.³⁹
Continuando con el análisis de los resultados obtenidos en los experimentos realizados con el otro clon de T. cruzi, Bra C15 C2, se comprobó que tanto la temperatura como el plasma de pollo también tienen efecto modulador de morfogénesis sobre los epimastigotes. Estos cambios consistieron en la transformación de epimastigotes en amastigotes vía tripomastigotes. Este fenómeno se produjo al elevar la temperatura de incubación de 26.5ºC ± 0.5 a 36.5ºC ± 0.5. El mecanismo de acción parece ser por activación de los heat shock genes ya mencionado. Este fenómeno podría ser acelerado por el plasma de pollo debido al "factor modulador". Este mismo "factor" sería el responsable del favorecimiento de la multiplicación de amastigotes a 36.5ºC ±0.5. Estas observaciones confirman los resultados obtenidos por Pan^25,26 en los medios de cultivo F4, F7y F32, en los que encontró que el plasma de pollo juega un importante papel en el desarrollo de amastigotes a partir de epimastigotes de T. cruzi y su mantenimiento; además, aparece como promotor del desarrollo de blood stream tripomastigotes. Cabe señalar que el plasma de pollo sobre epimastigotes del mismo clon a 27ºC produce lisis de los parásitos. No obstante, algunos epimastigotes, probablemente formas progresivas, sobreviven y se transforman en amastigotes que siguen reproduciéndose como tales. Estos amastigotes, en ausencia de plasma, vuelven a transformase en epimastigotes en forma gradual.
En todos estos experimentos de interacción de temperatura y plasma, esta última fue la condición de variable más simple de obtener. En cambio la estabilidad de los factores plasmáticos (homeostasis in vitro) en los cultivos fue dificultosa. Requirió su cambio periódico mediante centrifugación. Por otra parte, el efecto modulador fue diferente si las muestras de plasma provenían de productos comerciales liofilizados o de dadores humanos o pollos recientemente obtenidos. Esto podría indicar un aspecto cuantitativo o cualitativo, o ambos, de este "factor modulador" que parece alterase durante el procesamiento. Por ejemplo, el estadio epimastigote jamás apareció en el medio F69 modificado con plasma humano (F69PH) si éste era mantenido "fresco" y estable, por recambio diario de la mitad del volumen. El epimastigote podía aparecer si el plasma agregado no era completamente "fresco", si estaba parcialmente coagulado o si no era renovado diariamente. Esto parece indicar que hay "labilidad" en el "factor modulador" o "consumo" del mismo.
Otro aspecto importante que se deduce de esos experimentos es que el "factor modulador", afecta más al epimastigote que a los otros estadios en lo que respecta el efecto lítico. Así es que en el medio F69 modificado con plasma humano a concentración del 5%, el estadio epimastigote nunca sucedió al estadio amastigote. Fue sustituido, en cambio, por una de las que Wood denominó "formas progresivas"⁴² que dieron lugar a tripomastigotes jóvenes, tripomastigotes maduros y amastigotes. Puede sugerirse, entonces, que este "factor modulador", a determinada concentración y temperatura, se comportaría como una señal que regula la presencia del estadio epimastigote. Si la señal está "encendida" el amastigote proveniente del tripomastigote va hacia la forma progresiva sustituyendo o evitando el estadio epimastigote. Por lo tanto, esta forma progresiva no parece ser afectada por el factor plasmático de la misma manera que no son afectados los tripomastigotes y los amastigotes. Por otra parte, si existiendo una población establecida de epimastigotes se "enciende" la señal del "factor modulador" presente en el plasma de pollo, un porcentaje de epimastigotes es inducido a transformarse en tripomastigotes y amastigotes, y otros son lisados. Es como si el parásito recibiera una señal precisa para transformarse en una forma biológica resistente al factor.
Este mecanismo de señales ejecutado en este modelo in vitro de variables reguladas podría simular distintos fenómenos in vivo. Por ejemplo, si se toma el caso de un tripomastigote circulante en la sangre de un huésped infectado (F69 PH) el parásito está en permanente contacto con la "señal" del "factor plasmático modulador" que evita su cambio de estadio. Si ocasionalmente escapa de las condiciones normales de homeostasis de la sangre del huésped, por ejemplo, cuando es deglutido por un insecto vector, a temperatura cutánea (menor que la sanguínea) y se dirige a la luz de su intestino; tienen lugar las mismas transformaciones que las observadas in vitro en el medio F69 no modificado (F69); esto es: tripomastigote, amastigote y epimastigote, estadio que finalmente se fija en la pared intestinal del insecto vector.³ Siguiendo con este modelo hipotético, la transformación de estos epimastigotes en tripomastigotes metacíclicos que se acumulan en el recto del insecto vector en su natural evolución en el triatomideo, podría explicarse tomando en cuenta los resultados obtenidos en los experimentos de Piesman y Sherlock,³⁴ quienes observaron que la metaciclogénesis de T. cruzi es mayor en los insectos vectores que han sido alimentados que en los sometidos a ayuno. Estos autores consideraron que la diferencia se debió a un factor nutricional. No obstante, de acuerdo con estos razonamientos podría interpretarse que la metaciclogénesis no se debió a un factor nutricional sino a una "señal" precisa que indujo a la diferenciación de epimastigotes en tripomastigotes, proveniente del mismo "factor modulador", en este caso presente en la sangre de los cobayos utilizados para alimentar a los insectos. De igual forma podría interpretarse, a partir de los experimentos realizados por Isola y col.,¹⁶ que la diferenciación de epimastigotes en tripomastigotes metacíclicos después de interactuar con homogenato de intestinos aislados de Triatoma infestans alimentados semanalmente en pollos, pudiera deberse al "factor modulador" presente en la sangre del pollo y, en consecuencia, presente en el contenido intestinal.
Otro fenómeno relatado en condiciones in vivo, como es la presencia de formas regresivas de tripomastigotes circulantes en la sangre del huésped⁴² podría explicarse tomando en cuenta los experimentos previamente relatados en este trabajo, observados in vitro en el medio F69 modificado con plasma humano. Aparentemente, en condiciones de homeostasis del "factor modulador", el tripomastigote tiene tiempo limitado para permanecer como tal. En la situación in vivo podría "escapar" del "factor" introduciéndose en una célula, en el medio acelular F69 PH; esta posibilidad no existe y sucedería lo mismo con el tripomastigote circulante in vivo que por causa desconocida no pudiera penetrar a una célula pasando, en consecuencia, a formas regresivas. Cabría preguntarse si estas transformaciones de tripomastigotes en formas regresivas hacia amastigotes y éstos a su vez en formas progresivas, son cíclicas y automáticas y si ésta es una forma que tiene el parásito de prolongar su existencia hasta encontrar una célula penetrable y continuar su ciclo.
Otro aspecto destacable en el tema de la morfogénesis es que el estadio epimastigote no se ha descrito dentro de las células en cultivos de tejidos in vitro 35 y esto se debería posiblemente a la incapacidad del epimastigote de sobrevivir al medio ambiente intracelular.²⁸ Se ha descartado, asimismo, la presencia en el huésped invertebrado.¹⁰ Los estadios observados han sido siempre amastigote y tripomastigote. Esto podría indicar, como ya fue expresado anteriormente,⁴⁶ que una sustancia intracelular actúa de igual forma que el "factor modulador" del plasma, tal vez en concentración menor que la plasmática, de acuerdo con un gradiente de mayor (plasma) a menor (célula) suficiente para permitir al tripomastigote encontrar, entre otras, las condiciones necesarias para su transformación en amastigote y su multiplicación como tal e impedir la aparición de epimastigotes sensibles que serían sustituidos por formas progresivas resistentes al factor. Como excepción se han encontrado epimastigotes en tejidos de una especie animal infectada³² atribuidos a una especial característica de una cepa en particular.
Finalmente, sobre la naturaleza del "factor modulador" del plasma, sea humano o de pollo, que en forma directa o indirecta influye la morfogénesis del parásito^25,26,43,45 e incluso de una fracción de plasma de pollo,⁴⁶ nada se conoce en profundidad. No obstante, podría considerarse que estas sustancias deberían encontrarse dentro de los componentes de la "cascada del complemento". Esta consideración se basa paradójicamente en el hecho de que en la mayoría de los experimentos se encontró lisis de algunos parásitos, especialmente epimastigotes, y sobre la demostración de que este fenómeno se debe a la activación de la cascada del complemento.^17,23 Esta posibilidad se encuentra reforzada por los experimentos de Zaidenberg,⁴⁶ quien demostró que para que actúen los factores plasmáticos (factores moduladores) en función morfogenética, el ion Ca⁺⁺ es imprescindible. El calentamiento a 56ºC durante 30 minutos del plasma, disminuye considerablemente el efecto lítico de la cantidad de epimastigotes que se transforman en amastigotes. Zaidenberg⁴³ consideró que el factor morfogenético se encontraba entre los componentes de la coagulación del plasma, ya que los sueros obtenidos por coagulación de aquellos no evidenciaron acción morfogenética. Al efecto se hicieron experimentos de morfogénesis con coágulos totales, fibrinógeno, fibrina, protrombina activada y sin activar y que dieron resultados negativos. Estos resultados negativos se explican al tener en cuenta que durante la coagulación del plasma algunos componentes del complemento son consumidos² y, en consecuencia, disminuir o desaparecer su papel modulador. Por lo tanto, una vez más el complemento parece ser el responsable de la morfogénesis.
Suponer qué factores del complemento a través de su activación alterna¹⁷ sean directa o indirectamente responsables de inducir morfogénesis tiene sentido. Es lícito suponer, desde el punto de vista biológico, que el parásito en su adaptación evolutiva a huésped vertebrado y a una sustancia dañina (complemento) al menos para algunos de sus estadios, haya generado mecanismos que tienen acción directa o indirecta en su ciclo de vida, es decir, en su morfogénesis. La cuestión es, que in vitro y en experimentos que suponen un largo plazo es muy dificultoso reproducir la delicada situación cualitativa y cuantitativa y de homeostasis bioquímica y térmica que implica la condición in vivo.
Finalmente, y con el propósito de observar los efectos de un preparado comercial de complemento de cobayo en una reacción cuantitativa sobre una población de 99.7% de epimastigotes, se realizó un experimento utilizando el clon de T. cruzi H510 C8 C3 en medio F69 obtenida mediante subcultivos en el mismo medio cada 8 a 10 días a 27ºC. Los medios experimentales fueron F69 modificado con 2 UI/ml de complemento y F69 modificado con 20 UI/ml de complemento. La incubación se realizó a 27ºC durante 48 horas. Se pudo observar que el medio control mantuvo las características originales del inóculo, mientras que en el F 69 con 20 IU/ml de complemento se produjo marcada lisis de los parásitos. En tanto, en la concentración de 2 UI/ml de complemento, se observó transformación de epimastigotes en amastigotes y tripomastigotes. Estos resultados parecen confirmar el papel del complemento en el desencadenamiento del mecanismo de morfogénesis regulado por una variable cuantitativa.
Desde la actual perspectiva, luego del análisis de los resultados de morfogénesis obtenidos, puede sugerirse la hipótesis de que el ciclo de T. cruzi in vivo, tanto en el huésped infectado como en el insecto vector, está regulado por una secuencia genética del parásito que sigue el orden espimastigote, formas progresivas, tripomastigote, amastigote y formas regresivas. Esta secuencia es activada o frenada por el "factor modulador", que posiblemente sea el complemento a nivel plasmático y otro con acción similar localizado intracelularmente. Este factor modulador podría interactuar con estructuras externas del parásito, de donde partirían señales que regularían su morfogénesis y con el "factor temperatura", que podría activar genes durante el cambio térmico al pasar de la temperatura del huésped infectado a la del ambiente del insecto vector y viceversa.
Esta hipótesis estaría de acuerdo con los conceptos de Deane,⁸ quien dice que "los cambios son regulados a través de mecanismos genéticos que representan obviamente respuestas especificas para estímulos externos. La interrelación de todos los factores y mecanismos involucrados conlleva complejos problemas de interpretación y explica por qué, en experimentos repetidos, los resultados son a menudos incongruentes".El autor no manifiesta conflictos.

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