Autor: Miranda Gomes, Yara Columnista Experto de SIIC Institución: Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ Recife-PE, Brasil Artículos publicados por Miranda Gomes, Yara

Conclusión breve
Algumas vantagens do kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos são: impede reações falso-positivas; o ELISA direto aumenta a sensibilidade do método; o uso de amostras não diluídas reduz a possibilidade de erro.

Resumen

As técnicas sorológicas convencionais utilizadas no diagnóstico da doença de Chagas são limitadas devido às reações cruzadas com outras doenças parasitárias, à falta de padronização dos reagentes e pela diversidade de procedimentos técnicos. Métodos têm sido desenvolvidos para melhorar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico utilizando abordagens moleculares. O kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos (EIE-Rec) que emprega o ELISA direto e as proteínas recombinantes CRA e FRA de T. cruzi como antígenos, tem se mostrado promissor. Em estudos o EIE-Rec mostrou uma especificidade de 100% e uma sensibilidade de 98.2-100%. A utilização do kit EIE-Rec para monitorar a cura da doença de Chagas humana, cujos resultados concordaram em 90.9% com os métodos clássicos de diagnóstico, abre caminho para o uso do EIE-Rec em ensaios iniciais para avaliar a cura de pacientes chagásicos tratados. A análise comparativa do EIE-Rec com o ELISA convencional e o teste de hemaglutinação indireta mostrou que o uso de dois ELISAs com preparações antigênicas diferentes prove uma combinação de testes eficiente para a triagem da doença de Chagas em bancos de sangue. Algumas vantagens do EIE-Rec são: impede reações falso-positivas; o ELISA direto aumenta a sensibilidade do método; o uso de amostras não diluídas reduz a possibilidade de erro.

Palabras clave
Doença de Chagas, diagnóstico, testes sorológicos, antígenos recombinantes, Trypanosoma cruzi

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Especialidades
Principal: Infectología, 
Relacionadas: Bioquímica, Cardiología, Diagnóstico por Laboratorio, Medicina Interna, 

Enviar correspondencia a:
Dra. Yara M Gomes. Departamento de Imunologia. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ. Av. Moraes Rêgo, s/n, Cidade Universitária, CEP: 50670-420, Recife, PE, Brasil Miranda Gomes, Yara

Patrocinio y reconocimiento
AgradecimentosA John Wiley & Sons Inc pela permissão da reprodução de uma tabela do Journal Clinical Laboratory Analysis 16:132-136, 2002, e a Blackwell Publishing pela permissão do reprodução de duas tabelas do Vox Sanguinis 85:165-170, 2003.

USE OF THE EIE-RECOMBINANTE-CHAGAS-BIOMANGUINHOS FOR DIAGNOSIS OF CHRONIC CHAGAS' DISEASE

Abstract
Conventional serological techniques for the diagnosis of Chagas' disease are limited due to cross-reactivity with other parasitic diseases, non-standardization of reagents and the diversity of technical procedures available. Thus, methods are being developed to improve the sensitivity and specificity of the diagnosis using molecular approaches. The EIE-Recombinant-Chagas-Biomanguinhos (EIE-Rec) kit, that uses direct ELISA and the recombinant proteins CRA and FRA of T. cruzi as antigens has given promising results. We have previously showed that the EIE-Rec kit gives a specificity of 100% and a sensitivity of 98.2-100%. The use of the EIE-Rec kit in order to monitor the cure of human Chagas'disease, agreed in 90.9% with classical diagnostic methods. These results encourage further work using the EIE-Rec kit in initial trials to investigate the cure of treated chagasic patients. The comparative analysis of the EIE-Rec with the conventional ELISA and indirect hemmaglutination tests showed that, the combination of both enzyme immunoassays using different antigen preparations generates an efficient diagnostic test for blood bank screening of Chagas' disease. Advantages of the EIE-Rec include the use of specific recombinant parasite antigens avoiding false positive results, the sensitivity of the method is improved by using direct ELISA and the possibility of error is also reduced by using undiluted samples.

Key words
Chagas' disease, diagnosis, serological assays, recombinant antigens, Trypanosoma cruzi

Artículo completo
Introdução
A doença de Chagas ou tripanosomíase americana, causada pelo hemoflagelado Trypanosoma cruzi afeta milhões de pessoas na América Latina e devido a migração, indivíduos infectados podem ser encontrados em aproximadamente todas as regiões do mundo. Não existe quimioterapia segura disponível para o tratamento da doença. Os tradicionais antiparasitários, nifurtimox e benzonidazol, são parcialmente eficazes apenas na fase aguda da infecção¹ e seu potencial de cura parasitológica é dependente do tipo de cepa albergada pelo hospedeiro.²
O T. cruzi é transmitido a mamíferos, incluindo o homem, por um inseto vetor hematófago da família Reduviidae. Em condições naturais, o inseto ingere sangue contendo parasitas, tripomastigotas sangüíneos, de um hospedeiro vertebrado infectado. Na porção anterior do intestino do inseto essas formas tripomastigotas se diferenciam em formas epimastigotas (não infectivas). Após vários ciclos de replicação, os epimastigotas migram para o intestino posterior e, na ampola retal, diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos, que são formas infectivas. Durante o repasto sangüíneo do inseto infectado em um hospedeiro mamífero, as formas tripomastigotas são liberadas nas fezes e urina do inseto, penetrando no interior do hospedeiro através da pele (no local do ferimento provocado pela picada) ou através de mucosa.^3,4 Uma vez na circulação, os tripomastigotas metacíclicos se interiorizam em células, seja através da fagocitose promovida pelos macrófagos, seja através da penetração ativa em células não fagocíticas, como células musculares. No interior dessas células, os tripomastigotas metacíclicos transformam-se em formas amastigotas que se multiplicam por divisão binária. Quando o citoplasma da célula está repleto de amastigotas, ocorre a transformação dessas formas em tripomastigotas (figura 1) que são liberados na corrente sangüínea após a lise celular. Esses tripomastigotas infectam novas células ou podem ser ingeridos por triatomíneos durante o repasto de sangue, recomeçando o ciclo. Entretanto, o T. cruzi pode ser transmitido ao homem por um número de mecanismos alternativos: transmissão sanguínea, transmissão congênita, contaminação acidental em laboratório, transplante de órgãos de doadores infectados e transmissão por via oral.^3,5 A transfusão sanguínea é o meio dominante de transmissão nas áreas em que a doença não é endêmica. Consequentemente, a triagem de sangue é obrigatória para doadores de áreas endêmicas e para doadores em regiões onde ocorre a migração de indivíduos provenientes de áreas endêmicas.^6,7

Figura 1. Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi em células Vero (cultivo in vitro). a -adesão do tripomastigota sanguíneo 1000 x; b, c, d – célula parasitada 24, 48 e 72 h pós-infecção 1000 x; e – célula parasitada 72 horas pós-infecção 400 x; f – tripomastigotas obtidos do sobrenadante de cultura no 7o. dia de cultivo. A seta em a, mostra o tripomastigota. (Segundo Gomes.³²)

Embora o controle vetorial tenha sido alcançado em pelo menos 3 países (Chile, Uruguai e Brasil), após a implementação da Iniciativa do Cone Sul para eliminação da doença de Chagas,⁸ e o sangue ser triado nessas áreas, novos casos ainda estão aumentando em países sem controle próprio. Estes fatos mostram que indivíduos infectados necessitam ser diagnosticados e que candidatos a doação de sangue deverão ser adequadamente triados. Isso implica no emprego de métodos de diagnóstico seguros.
O diagnóstico da doença de Chagas crônica é baseado na detecção do parasita por métodos parasitológicos indiretos (xenodiagnóstico e hemocultura) ou mais rotineiramente pela detecção de anticorpos IgG contra T. cruzi no soro de pacientes através de uma série de métodos imunológicos que abrange desde a obsoleta reação de fixação do complemento (FC) aos ensaios imunoenzimáticos tais como o enzyme-linked immunosorbent assay-ELISA.^3,9 Dos testes convencionais, os mais amplamente usados, para diagnóstico e triagem de doadores em bancos de sangue, são a hemaglutinação indireta-HAI, imunofluorescência indireta-IFI e o ELISA. A Organização Mundial de Saúde¹⁰ recomenda a realização de pelo menos dois testes de princípios metodológicos diferentes em paralelo. Se ambas reações forem reagentes o resultado será positivo; se não reagente, será negativo e se positivo em apenas um dos testes o resultado será indeterminado ou inconclusivo devendo a amostra ser retestada.
Os métodos baseados na detecção do parasita, apesar de específicos, são de limitada sensibilidade, porque os parasitas são detectados em somente 20-50% dos indivíduos sabidamente infectados, resultando em vários resultados falso-negativos.³ Por outro lado, os métodos baseados na detecção de uma resposta imune do hospedeiro ao parasita faltam especificidade, uma vez que os mesmos utilizam extratos totais ou semipurificados do parasita. Reações cruzadas com o T. cruzi têm sido observadas com doenças parasitárias relacionadas, particularmente leishmaniose, bem como um grande número de resultados inconclusivos.
Tentativas têm sido feitas para substituir os antígenos brutos convencionais por proteínas purificadas do parasita.^11,12 No entanto, a purificação de tais pela bioquímica clássica é muito laboriosa e apenas pequenas quantidades são obtidas. Estes problemas têm sido superados pelo uso da engenharia genética que permitem a produção de grandes quantidades de antígenos definidos com elevado grau de pureza e qualidade padronizada. A tecnologia do DNA recombinante possibilitor a clonagem molecular de vários genes que codificam proteínas antigênicas de T. cruzi. Vários gens de T. cruzi têm sido clonados e alguns antígenos recombinantes têm sido testados para seu uso em diagnóstico.^13-20 No entanto, apesar da maioria ter sido testada e usada em pesquisa com bons resultados, eles não têm sido incluídos em kits por razões técnicas e financeiras.⁹
Dois antígenos recombinantes (CRA e FRA) foram caracterizados molecularmente mostrando uma estrutura com epitopos repetitivos.^19,21 Em função dessa estrutura e pela localização, esses antígenos foram denominados de CRA (cytoplasmic repetitive antigen ou antígeno citoplasmático repetitivo) e está presente nas formas epimastigotas e amastigotas e FRA (flagelar repetitive antigen ou antígeno flagelar repetitivo) presente nas formas epimastigotas e tripomastigotas do T. cruzi.²¹ Esses antígenos foram analizados por Krieger et al¹⁹ em um teste de diagnóstico para doença de Chagas. Os dados indicaram que os antígenos recombinantes mostraram melhor resultado quando usados em combinação do que separadamente. Estes autores desenvolveram um ELISA direto que envolve o uso dos antígenos conjugados a peroxidase para detectar os imunocomplexos. Os resultados indicaram que o recombinante ELISA (CRA+FRA) mostrou melhor desempenho do que o ELISA convencional no diagnóstico da doença de Chagas, apresentando 100% de especificidade e sensibilidade.^16,19 Os antígenos foram considerados úteis para proposta de diagnóstico de acordo com um estudo multicêntrico conduzido pela OMS.^15-17,19,22
Posteriormente, um kit para o diagnóstico da doença de Chagas, EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos® (EIE-Rec), que usa os antígenos CRA+FRA, foi desenvolvido pela Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasil. Esse kit é baseado em um ensaio imunoenzimático, o ELISA direto (figura 2) e está comercialmente disponível no Brasil. Recentemente nós avaliamos a performance do EIE-Rec, para o diagnóstico da infecção pelo T. cruzi em amostras de soro caracterizadas de indivíduos provenientes de áreas endêmicas para doença de Chagas, e de indivíduos com outras doenças infecciosas.²³ O EIE-Rec mostrou elevada sensibilidade e especificidade (100%). Além disso, os dados obtidos estavam em concordância com a clínica e a sorologia convencional e nenhuma reação cruzada foi observada com soro de pacientes com outras doenças infecciosas, incluindo leishmaniose visceral e cutânea. Esses resultados levaram a investigar o desempenho do kit EIE-Rec no monitoramento de pacientes chagásicos submetidos ao tratamento específico para doença de Chagas²⁴ bem como analisar a performance do referido kit frente aos testes ELISA convencional (ELISA-Con) e HAI.²⁵ Os protocolos utilizados nesses trabalhos foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa do CPqAM/FIOCRUZ, cujos resultados serão discutidos na presente revisão.

Figura 2. Representação esquemárica do ELISA direto empregado no kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos.

O desempenho do kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos no monitoramento da cura da doença de Chagas humana
O tratamento de pacientes na fase aguda da doença de Chagas com drogas nitroheterocíclicas, benzonidazol e nifurtimox, pode impedir um resultado fatal e produzir algumas curas. A cura nesta fase é acompanhada pela sorologia convencional (SC), tornando-se completa e consistentemente negativa após um período de cerca de 12 meses. Entretanto, na fase crônica da doença a soroconversão negativa é lenta, levando anos para ser completada e requer um longo acompanhamento para provar a cura da doença crônica.²⁶ A eficácia do tratamento é avaliada através de métodos parasitológicos (hemocultura-HC e xenodiagnóstico-XD) e testes da SC. O teste de lise mediada pelo complemento-LMCo²⁷ que detecta anticorpos líticos contra tripomastigotas vivos tem sido relacionado à presença de infecção ativa e é também usado para essa finalidade.
Com base nos testes parasitológicos e sorológicos, os pacientes tratados são classificados como: 1) pacientes curados (PC) quando os testes parasitológicos, SC e LmeCo são negativos; 2) pacientes dissociados (PD) quando os testes prasitológicos e LMCo são negativos mas são positivos para pelo menos 2 dos 3 testes da SC; e 3) pacientes não curados (PNC) quando os testes parasitológicos, SC e LMCo são positivos. Esta é uma classificação sorológica e parasitológica que avalia a presença de infecção ativa. De acordo com essa classificação, PC e PD não apresentam infecção ativa, e a diferença entre esses dois grupos é que os PD continua a produzir anticorpo contra antígenos do T. cruzi detectado pela SC.²⁸ Um teste de LMCo negativo prediz a eliminação do T. cruzi; no entanto, esse teste tem limitações práticas desde que ele requer parasitas vivos e infectivos. Esses fatos mostram que há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de testes sorológicos que usem antígenos purificados específicos do T. cruzi. Tais testes poderão evitar a ocorrência de resultados positivos na SC após o parasita ter sido eliminado.²⁸
Nós avaliamos o desempenho do EIE-Rec²⁴ em 22 pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil, que foram tratados com nifurtimox (Bayer, São Paulo Brasil) ou benzonidazol Roche, São Paulo Brasil). Estes pacientes foram previamente analisados através de testes parasitológicos (HC ou XD), SC (IFI, HAI ou FC) e LMCo (tabela 1) com os seguintes resultados: PC = 10, PD = 6 e PNC = 6.²⁹ O soro desses pacientes foi analizado atavés do kit EIE-Rec utilizando como controles negativo e positivo amostras de indivíduos não chagásicos-NCh (n = 10) e de pacientes cronicamente infectados não tratados-PNT (n = 10), respectivamente. Os seguintes resultados foram obtidos: 1) todos os soros dos PNC e dos PC mostraram reações positivas e negativas, respectivamente. Esses resultados foram concordantes com aqueles previamente obtidos pelos testes clássicos (parasitológico, SC e LMCo); 2) A análise dos seis PD mostrou que 2 deles (33.4%) apresentaram reação positiva e considerados PNC, enquanto os quatros restantes (66.6%) foram negativos e considerados PC. Analisando trabalhos prévios sobre a especificidade (100%) do EIE-Rec, as reações positivas e negativas não parecem ser falso negativas. Além disso, para os quatro PD que mostraram reações negativas, os resultados foram concordantes com testes parasitológicos e LMCo realizados previamente. Analisando os resultados dessas abordagens em conjunto, os resultados foram 99.9% concordantes com os métodos clássicos de diagnóstico.²⁴



De acordo com Cançado,²⁶ um resultado negativo apenas pela LMCo não é um critério de cura para a doença de Chagas porque a ausência de tripomastigotas vivos não significa necessariamente ausência de infecção ativa. O parasita pode persistir no hospedeiro na forma amastigota. Mesmo circulando no sangue periférico esses parasitas poderiam não estimular a produção de anticorpos líticos, mas poderiam ser a causa da positiva SC uniforme na maioria dos pacientes tratados portadores da Chagas crônica. Além disso, Cançado²⁶ enfatiza que o controle de cura baseado na SC é importante por várias razões: 1) os testes parasitológicos (XD e HC) tem pobre sensibilidade, são demorados e somente disponíveis em instituções de pesquisa; 2) é impossível ocorrer um teste de SC negativo com um teste parasitológico positivo, exceto possivelmente no caso de imunosupressão; 3) na fase aguda da doença, a SC é o critério de cura universalmente aceito; 4) todas as pesquisas sobre antígenos refinados para serem utilizados na avaliação sorológica da quimioterapia, usa como seu "padrão ouro" para a cura de pacientes quem apresenta testes da SC consistentemente negativos. O motivo pelo qual a SC permanece positiva não é claro; entretanto, algumas hipóteses tm sido sugeridas: i) camundongos infectados com T. cruzi, mas parasitologicamente curados após tratamento quimioterápico específico, continua a apresentar testes de IFI positivos 3-6 meses após tratamento devido a antígenos do parasita retidos por certas células no baço;³⁰ ii) estudos mostraram que uma elevada proporção de anticorpos detectado pela SC, em pacientes tratados chagásicos são direcionados contra o resíduo carbohidrato Galα1→3Gal, um determinante também reconhecido por anticorpos de indivíduos não infectados.³¹ Em virtude de sua ampla distribuição da microflora intestinal e pulmonar, esses determinantes podem continuar estimulando limfócitos sensibilizados com epitopos Galα1→3Gal, desse modo concorrendo para resultados falso-positivos em pacientes curados. Estes fatos sugerem que o uso de um antígeno reconhecido pelo soro da maioria dos pacientes chagásicos cronicamente infectados que não expressa resíduos Galα1→3Gal, pode ser útil na eliminação de reações falso-positivas.³¹ Os antígenos CRA+FRA utilizados no EIE-Rec, além de serem específicos do parasita, não possuem esse tipo de resíduo.
O desempenho do kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos frente ao ELISA convencional e ao teste de hemaglutinação indireta
Visando o aumento da segurança do receptor de sangue doado, a diminuição das reações cruzadas com outras parasitoses e do número de resultados inconclusivos, que levam ao descarte, muitas vezes desnecessário, de bolsas de sangue, realizamos um estudo comparativo do desempenho do kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos (ELISA-Rec) e ELISA convencional (ELISA-Con) com o teste de HAI, os dois últimos bastante utilizados em banco de sangue.²⁵
Nesse estudo analisamos soros de 112 pacientes provenientes do Hospital Universitário Oswaldo Cruz, provenientes de áreas endêmicas do estado de Pernambuco, Brasil com doença de Chagas crônica: forma assintomática (n = 15); forma cardíaca (n = 82); forma digestiva (n = 9) e forma mista (n = 6). Todos os indivíduos foram investigados por um questionário epidemiológico e submetidos a exames laboratoriais (eletrocardiograma, raio-X ou imagem radiológica do trato gastrointestinal). A investigação sorológica foi realizada conforme recomendação da OMS utilizando dois testes sorológicos diferentes. Nós avaliamos esses soros caracterizados através dos testes ELISA-Rec, ELISA-Con e HAI. Como controle negativo, soro de 143 indivíduos não chagásicos que nunca receberam transfusão de sangue e nunca habitaram em zona endêmica foram utilizados. Além disso, soro de pacientes portadores de outras doenças infecciosas e parasitárias tais como, leishmaniose cutânea-LC (n = 5), vírus da hepatite C-HCV (n = 7), sífilis (n = 11) ou vírus da imunodeficiência humana-HIV (n = 9) foram também utilizados.²⁵ O teste de HAI foi realizado com o kit HEMACRUZI (Biolab Mérieux S.A., Rio de Janeiro, Brasil). O ELISA-Con foi realizado com o kit Premier^TM Chagas' IgG ELISA (Meridian Diagnostic, Inc., Ohio, USA). Para o ELISA-Rec utilizamos o kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos (Biomanguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil). Todos os testes foram realizados conforme instruções do fabricante. Um indivíduo foi considerado positivo quando o resultado de 2 testes foram reagentes, negativos quando ambos os resultados foram não reagentes, e inconclusivos quando apenas um teste foi reagente.²⁵
Os resultados mostraram que o HAI foi capaz de identificar apenas 59 dos 112 pacientes chagásicos. Além disso, ele não foi capaz de identificar 13 paciente chagásicos e produziram 40 resultados inconclusivos. A sensibilidade do HAI foi de 52.75%. (tabela 2). Os ELISAs (ELISA-Rec e ELISA-Con) não reconheceram apenas 2 dos pacientes chagásicos e nenhum resultado inconclusivo foi detectado. A sensibilidade mostrada por cada ensaio foi de 98.2%. Os dois pacientes não identificados pelo ELISA-Rec não foram os mesmos não identificados no ELISA-Con. Quando analisamos em combinação o ELISA-Con com o HAI, que são rotineiramente usados no diagnóstico e triagem nos bancos de sangue do Brasil, obtivemos 51 resultados inconclusivos e 2 falso-negativos. Em banco de sangue, utilizando a triagem padrão, estas 2 doações estariam disponíveis para transfusão. Entretanto, quando analisamos em combinação o ELISA-Rec com o ELISA-Con, o número de resultados inconclusivos foi reduzido para quatro (tabela 3). Entre eles estavam 2 amostras falso-negativas obtidas pela combinação do ELISA-Con e o teste HAI que foram reagentes no ELISA-Rec. Em uma triagem sorológica usando a combinação do ELISA-Rec e o ELISA-Con esses doadores não teriam o sangue transfundido. Com relação as outras 2 amostras, se ambos ELISAs fossem usados em uma triagem sorológica, essas unidades de sangue também não seriam transfundidas.²⁵






Quando o soro de pacientes com outras doenças parasitárias foram analisados pelo ELISA-Rec e ELISA-Con nenhuma reação falso-positiva foi observada. No entanto, quando estes soros foram testados pelo teste HAI reações cruzadas foram observadas em pacientes com sífilis (1/11), HCV (1/7) e LC (2/5). Um teste de diagnóstico que desenvolve resultados falso-positivos deve ser evitado pois pode criar um problema social para indivíduos chagásicos falso-positivos e produzir dados errôneos em estudos epidemiológicos.
Os dados obtidos nessas abordagens indicam que para o diagnóstico da doença de Chagas o uso de dois ELISAs, com diferentes preparações antigênicas, tais como o ELISA-Rec e o ELISA-Com concorre para: i) redução de resultados falso-negativos; ii) redução de resultados inconclusivos; iii)redução de reações cruzadas, iv) segurança e rapidez nos resultados que podem ser obtidos por automação.
Conclusão
A busca sistemática de um teste sorológico para o diagnóstico da doença de Chagas que evite reações falso-positivas, falso-negativas e resultados inconclusivos tem contribuído para a produção de testes com elevada especificidade e sensibilidade. O kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos apresenta algumas vantagens importantes para o diagnóstico pelas seguintes razões: (i) a utilização de antígenos recombinantes específicos de T. cruzi evitam reações falso-positivas; (ii) o ELISA direto aumenta a sensibilidade do método permitindo a avaliação de soro com baixo título, e corrobora sua especidade; (iii) a utilização de amostras de soro não diluídas (50 μl) reduz a possibilidade de erro devido à manipulação; (iv) o procedimento é rápido (2 horas), fácil de realizar e de baixo custo.
Los autores no manifiestan conflictos.

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