MELATONIN PREVENTS OXIDATIVE STRESS INDUCED BY OKADAIC ACID AND HYDROGEN PEROXIDE IN N1E-115 CELLS

Abstract
The present study with N1E-115 neuroblastoma cells evaluated the oxidative stress induced by okadaic acid, hydrogen peroxide and okadacia acid plus hydrogen peroxide, as well as the protective effect of melatonin. We demonstrated that exposure of cells to 50 nM acid and hydrogen peroxide (200 μM) for 2 h induced an intense oxidative stress characterized by a decrease of the GSH content and a reduction in cellular glutathione transferase and catalase activity. Likewise, these experimental conditions prompted an increase in lipid peroxidation products. The degree of oxidative stress induced by okadaic acid was almost duplicated in the presence of hydrogen peroxide. The effects induced by okadaic acid, hydrogen peroxide and okadaic acid plus hydrogen peroxide are prevented by melatonin (10^-5 M). These data indicate the great importance of oxidative stress in the okadaic acid model, as well as its participation in the biochemical changes originated in the course and development of this experimental model, similar to Alzheimer's disease. These results seem to indicate the antioxidative and protective effect of melatonin.

Key words
N1E-115 cells, Alzheimer's disease, okadaic acid, oxidative stress, hydrogen peroxide, melatonin

Artículo completo
Introducción
Es un hecho aceptado que las especies reactivas de oxígeno (ROS), además de participar en el envejecimiento, se involucran en la patogenia y evolución de procesos neoplásicos e inflamatorios así como en los ligados a radiaciones y agentes tóxicos de distinta naturaleza. Asimismo, son numerosos los estudios que relacionan las ROS con las enfermedades neurodegenerativas más frecuentes (Alzheimer, Parkinson, Huntington y esclerosis lateral amiotrófica).^1-8 Por ejemplo, en la patogénesis y acción neurotóxica mediada por el péptido beta-amiloide (Aβ), presente en la enfermedad de Alzheimer, se invoca la concurrencia de dos principales cascadas moleculares: la mediada por Ca²⁺, activación de la óxido nítrico sintasa (NOS) y enzimas proteolíticas, cuyos mecanismos en conjunto conducen a la generación de cambios genéticos y muerte celular por apoptosis, y los procesos oxidativos generadores de productos finales de glucosilación avanzada (AGE), radicales libres (FR) y activación del factor nuclear κB (NFκB).^9-11 Junto a estos procesos interesan en las enfermedades neurodegenerativas los mecanismos de fosforilación/desfosforilación en los que participan, entre otras, las proteínas fosfatasa tipo 1 (PP1) y tipo 2A (PP2A),^12-13 proteínas que son inhibidas por ácido ocadaico (ácido okadaico).
El ácido ocadaico es un poliéter de ácidos grasos producido por dinoflagelados marinos y acumulado en el tracto digestivo de crustáceos y de la esponja negra (Halichondria okadaii), en la que fue aislado por vez primera.^14-16 Se trata de un potente y específico inhibidor de PP1 y PP2A, las que desfosforilan residuos serina y treonina en células eucariotas.^17-19 También promueve la aparición de tumores, lipoperoxidación y apoptosis en cultivos celulares, órganos y medios biológicos de ratón.^20-24 De igual modo, produce alteraciones bioquímicas, fisiológicas y morfológicas compatibles con las encontradas en enfermedades neurodegenerativas^25,17 y que se caracteriza por cambios en la organización del citoesqueleto, fosforilación de la proteína tau, estrés oxidativo y apoptosis.^26-36 Datos de Pérez y col. tanto en cultivos de neuroblastoma SH-SY5Y como COS-1 ponen de manifiesto aumento de los niveles de 4-hidroxi-2-nonenales, cuya interacción con la proteína tau se relaciona con la formación de filamentos helicoidales apareados (PHF).^37-39 Estas sugerencias han sido demostradas por Mattson y col. en cultivos de neuronas de hipocampo de rata tratadas con 4-hidroxinonenales.⁴⁰ En este mismo modelo, He y col. constataron que la administración de ácido ocadaico determina cambios en la conducta y memoria espacial de ratas.⁴¹
Nuestro grupo realizó estudios in vitro e in vivo que apoyan la hipótesis de una participación del estrés oxidativo en la génesis y evolución del modelo experimental inducido por ácido ocadaico en células N1E-115.^42,43Otros grupos de investigadores han puesto de manifiesto la regulación in vivo e in vitro de proteínas fosfatasa, tales como PP1, PP2A, fosfatasa tipo 2C (PP2C), calcineurina y tirosina fosfatasa por ROS. En efecto, el H₂O₂ desencadena la inhibición de vías de señalización intracelular que involucran calcineurina, PP1 y PP2A, mientras que la incorporación de ascorbato y superóxido dismutasa evita la inactivación de PP1 y calcineurina, respectivamente.^44-49Sobre la base de lo anteriormente expuesto, el presente estudio tiene como objetivo principal valorar, comparativamente, el estrés oxidativo inducido tanto por el ácido ocadaico como por el H₂O₂ y ácido ocadaico + H₂O₂. También, explorar el efecto protector de la melatonina en las tres condiciones experimentales, tomando como marcadores para su valoración: el contenido en glutatión reducido, los niveles de lipoperoxidación y la actividad de glutatión transferasa, glutatión reductasa y catalasa.
Material y métodos
Materiales
El medio de cultivo, el suero de caballo y el suero bovino fueron provistos por Gibco BRL (Gaithersburg, MD, EE.UU.). El ácido ocadaico, el peróxido de hidrógeno, la melatonina y el resto de los productos químicos fueron obtenidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).
Cultivo celular
Las células de neuroblastoma N1E-115 fueron sembradas a una densidad de 200 000 células/mm² en placas de Petri de 35 mm. Las células en medio Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) complementado con 10% de suero bovino, 5% de suero de caballo, 100 UI/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina fueron cultivadas durante 96 horas a 37ºC en atmósfera de CO₂ al 5%.
Diseño experimental
Se prepararon neuroblastomas N1E-115 incubados durante 2 horas con: i) 50 nM de ácido ocadaico (AO) en dimetilsulfóxido (DMSO), que se incorporó al medio de cultivo; ii) 200 μM de peróxido de hidrógeno (HP), y iii) 10^-5 M de melatonina (MEL) en DMSO. Todos los cultivos celulares fueron preincubados con melatonina o vehículo durante dos horas antes de añadir ácido ocadaico o peróxido de hidrógeno o ambos, manteniéndose hasta el final del estudio.
Productos de lipoperoxidación
El grado de lipoperoxidación se determinó en homogenados celulares, expresándose como malonildialdehído+4-hidroxialquenales nanomol/miligramo de proteína (MDA+4-HDA nmol/mg proteína). La determinación se realizó con equipo LPO 586 (Oxis Internacional Inc., Portland, OR, EE.UU.).
Contenido en glutatión reducido
La determinación de GSH se realizó en homogenados celulares. Los resultados son expresados en nanomoles/miligramo de proteína (nmol/mg proteína). La cuantificación se valoró con el sistema GSH-400 (Oxis Internacional Inc., Portland, OR, EE.UU.).
Actividad enzimática
La actividad de la glutatión transferasa (GSH-Tr, E.C. 2.5.1.18) y la glutatión reductasa (GSH-Rd, E.C. 1.6.4.2) fue valorada de acuerdo con el método descrito por Jaskot (1983).⁵⁰ La actividad se expresa en unidades/miligramo de proteína (U/mg proteína).
La catalasa se analizó en la fracción citosólica de acuerdo con el procedimiento desarrollado por Aebi (1984).⁵¹ Sus resultados se expresan en unidades/miligramo de proteína (U/mg proteína).
Contenido en proteínas
El contenido en proteínas totales de los homogenados celulares se valoró mediante la técnica de Bradford,⁵² usando albúmina bovina como estándar.
Estudio estadístico
El análisis estadístico se realizé con el paquete estadístico SPSS 11.0 para Windows®. La distribución de los valores de las diferentes variables estudiadas no mostró significación para la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Para revelar la significación estadística entre diferentes grupos de tratamiento se realizó un análisis de varianza de una vía (One-way ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Las diferencias fueron consideradas significativas con una p < 0.05. Todos los valores se expresan como la media ± error estándar.Tabla 1Resultados
Perfil basal
Los resultados muestran que la exposición de células N1E-115 al ácido ocadaico desencadena un estado oxidativo similar al desarrollado por la adición de peróxido de hidrógeno. En ambas situaciones experimentales se observa un aumento significativo en los niveles de lipoperoxidación (figura 1), depleción en el contenido de GSH (figura 2) y decremento de la actividad de las enzimas GSH-Tr, GSH-Rd y catalasa (tabla 1). Asimismo, se observa que los efectos del ácido ocadaico fueron potenciados por la presencia simultánea de peróxido de hidrógeno (figuras 1 y 2, y tabla 1, respectivamente).

Figura 1. Efecto de la melatonina (MEL) sobre los cambios en los niveles de lipoperoxidación inducidos por ácido ocadaico (AO) en células N1E-115 incubadas con peróxido de hidrógeno (HP). Los resultados se expresan como la media ± SD de seis experimentos individuales expresados como nanomoles pro miligramo de proteína (nmol/mg proteína). * p < 0.001 versus control; • p < 0.001 versus ácido ocadaico; º p < 0.001 versus ácido ocadaico; + p < 0.001 versus peróxido de hidrógeno; # p < 0.001 versus ácido ocadaico + peróxido de hidrógeno.

Efecto de la incubación con melatonina
La incorporación de melatonina a los cultivos de neuroblastoma N1E-115 revirtió los efectos oxidativos producidos por el ácido ocadaico y el peróxido de hidrógeno tal como indica el significativo descenso de los niveles de malonildialdehído y 4-hidroxialquenales (figura 1), el mantenimiento en contenido de GSH (figura 2) y la normalización de las actividades de las enzimas analizadas (Tabla 1).

Figura 2. Efecto de la melatonina (MEL) sobre los cambios en los niveles de GSH inducidos por el ácido ocadaico (AO) en células N1E-115 incubadas con peróxido de hidrógeno (HP). Los resultados se expresan como la media ± SD de seis experimentos individuales expresados como nanomoles por miligramo de proteína (nmol/mg proteína). * p < 0.001 versus control; • p < 0.001 versus ácido ocadaico; º p < 0.001 versus ácido ocadaico; + p < 0.001 versus peróxido de hidrógeno; # p < 0.001 versus ácido ocadaico + peróxido de hidrógeno.

Discusión
En el presente estudio se observa cómo la adición al medio de cultivo de ácido ocadaico, H₂O₂ o de ambas a la vez en neuroblastomas N1E-115 determina incrementos en la lipoperoxidación, depleción en el contenido de GSH y descensos de las actividades enzimáticas estudiadas. Cuando estos cultivos son pretratados con melatonina todos los cambios son evitados, tanto en el caso del ácido ocadaico, como con H₂O₂ y con ácido ocadaico más H₂O₂.
Nuestro grupo ha puesto de manifiesto la participación in vitro del estrés oxidativo inducido por ácido ocadaico en cultivos de neuroblastoma N1E-115⁴² e in vivo por la adiministración de este ácido por vía intracerebroventricular.⁴³ Paralelamente, en estos modelos se estudia el efecto protector de la melatonina, demostrándose que tales guardan relación en tiempo y dosis. Datos similares fueron aportados por Benítez-King y col. que demuestran además que el ácido ocadaico induce en este neuroblastoma colapso del citoplasma, alteración del citoesqueleto y apoptosis, cambios que son bloqueados por la presencia de melatonina.⁵³
Por otra parte, diferentes oxidantes y antioxidantes se relacionan con el control de proteínas fosfatasa, como calcineurina y fosfatasa tipo 2C (PP2C). Asimismo, son abundantes los datos que refieren la influencia del H₂O₂ en la génesis del estrés oxidativo y en la regulación de señales y vías implicadas en la muerte celular programada [proteína quinasa 1 reguladora de señales de apoptosis (ASK1), NFκB, proteínas quinasa p53, proteínas de choque térmico (HSP) y cisteinil aspartato proteinasa (caspasa-3)].^54,59 Fisiológicamente, los efectos nocivos del H₂O₂ son anulados por las enzimas catalasa (E.C.: 1.11.1.6) y glutatión peroxidasa (GSH-Px; E.C.: 1.11.1.9), cuyas actividades y expresiones génicas están reguladas por factores tales como estrés oxidativo, envejecimiento, inflamación, hormonas y presencia de antioxidantes.⁵⁵
Rao y Clayton demostraron que el peróxido de hidrógeno (H₂O₂) inhibe la actividad de PP2A e incrementa la fosforilación de proteínas en células Caco-2 y que la actividad de PP2A es regulada por el estado redox del glutatión. Así, el glutatión oxidado (GSSG) inhibe la actividad de la enzima, mientras que el glutatión reducido (GSH) restaura la actividad de PP2A.⁵⁶ Resultados que avalan la hipótesis de una estrecha relación entre el estrés oxidativo y el grado de fosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP), como la proteína tau, lo que apoya de forma indirecta en nuestro modelo experimental la participación de un estrés oxidativo así como el mantenimiento del estado de fosforilación proteica inducido por el ácido ocadaico. Esta situación crea un círculo vicioso que se inicia con la inhibición de fosfatasas, continúa con el estrés oxidativo que parece pontenciar aun más el efecto del ácido ocadaico sobre el estado de fosforilación. La presencia de la melatonina, por su acción antioxidante, podría romper este círculo vicioso.
En resumen, nuestro estudio muestra y confirma dos fenómenos principales: i) la generación de un intenso estrés oxidativo inducido tanto por el ácido ocadaico como por H₂O₂ y ácido ocadaico + H₂O₂; y ii) el efecto protector de la melatonina. De lo que se extrae como hecho de interés, en el primer caso, el empleo de ácido ocadaico como herramienta útil para el estudio de mecanismos involucrados en las enfermedades neurodegenerativas y, respecto del segundo, por su acción antioxidante, la posible aplicación de la melatonina con fines terapéuticos.
Los autores no manifiestan conflictos

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