Autor: Elsa Beatriz Damonte, Columnista Experto de SIIC Institución: Departamento de Química Biológica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires Artículos publicados por Elsa Beatriz Damonte,

Conclusión breve
Los resultados obtenidos coinciden con informes de otros autores sobre la eficacia y seguridad de carragenanos y polisacáridos comerciales como microbicidas vaginales y avalan las excelentes perspectivas para el tratamiento tópico preventivo de las infecciones herpéticas.

Resumen

Los carragenanos denominados 1C3 y 1T1, extraídos del alga roja Gigartina skottsbergii, mostraron marcada actividad antiviral in vitro contra los virus herpes simple tipo 1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2). En este trabajo se estudian sus propiedades antivirales in vivo. En el caso de 1C3, cuando ratones OF1 inoculados con HSV-1 por vía intraperitoneal fueron tratados con el compuesto (dosis: 30 mg/kg peso) por la misma vía, al momento de la infección, se registró una protección superior al 80%, mientras que todos los animales infectados y no tratados murieron. Por el contrario, todos los animales murieron cuando el tratamiento se inició 24 horas después de la infección. Cuando el compuesto se administró por vía intravenosa, la protección disminuyó al 40%. En el modelo de tratamiento tópico, ratones BALB/c inoculados con HSV-2 por vía intravaginal fueron tratados por la misma vía con 1T1 (50 mg/kg peso). El tratamiento con 1T1 al momento de infectar produjo protección en el 90% de los animales, mientras que sólo el 10% de los animales infectados sin tratar sobrevivieron a la infección. El efecto protector de 1T1 resultó evidente aun aplicado 1 hora antes de realizar la infección, lo que indica la capacidad profiláctica de este carragenano ante la infección herpética.

Palabras clave
Carragenanos, virus herpes simplex, antiviral, enfermedad de transmisión sexual, microbicida

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
página www.siicsalud.com/des/expertos.php/68044

Especialidades
Principal: Bioquímica, Dermatología, Infectología, 
Relacionadas: Bioquímica, Dermatología, Infectología, Medicina Interna, Medicina Reproductiva, Obstetricia y Ginecología, 

Enviar correspondencia a:
Elsa Beatriz Damonte. Departamento de Química Biológica-FCEN- Ciudad Universitaria-Pabellón 2- Piso 4- 1428 Buenos Aires Damonte, Elsa Beatriz

Patrocinio y reconocimiento
Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica y la Universidad de Buenos Aires (Argentina).

PERSPECTIVES OF CARRAGEENANS FOR PREVENTION OF SEXUALLY TRANSMITTED DISEASES

Abstract
The carrageenans 1C3 y 1T1 obtained from the red seaweed Gigartina skottsbergii exhibited a marked in vitro antiviral activity against herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and 2 (HSV-2). In this paper we investigate the in vivo antiviral properties of these compounds. The inoculation of OF1 mice with HSV-1 by intraperitoneal route and the simultaneous treatment with 1C3 (30 mg/kg of body weight) by the same route protected more than 80% of the animals whereas 100% of non-treated animals died. No animal survived when treatment was performed at 24 h post-infection. Treatment with 1C3 intravenously reduced the survival rate to 40%. For the model of topical treatment, BALB/c mice were intravaginally inoculated with HSV-2, MS strain, and simultaneously treated with 1T1 (50 mg/kg of body weight) by the same route. Under these conditions of treatment, 90% of animals were protected from infection whereas only 10% of non-treated animals survived. The protective effect of 1T1 was also achieved even when the compound was administered up to 1 h prior to infection, indicating the prophylactic properties of this carrageenan against herpetic infection.

Key words
Carrageenan, herpes simplex virus, antiviral, sexually transmitted disease, microbicide

Artículo completo
Introducción
Los carragenanos son polisacáridos sulfatados formados por cadenas lineales de unidades repetidas alternadamente de 1-3 β-D-galactopiranosas (unidades A) y 1-4 α-D-galactopiranosas o D-3,6-anhidro galactopiranosas (unidades B). De acuerdo con el patrón de sulfatación o la presencia de 3-6 anhidro-derivados en la unidad B, los carragenanos se agrupan en cuatro familias, kappa, lambda, omega y beta, que a su vez incluyen distintos tipos estructurales. Según el tipo estructural al que pertenecen, los carragenanos varían en las propiedades físicas y químicas de los geles que forman al hidratarse en agua, así como en su reactividad ante las proteínas.¹
Hace algunos años, los carragenanos comenzaron a emplearse en la fabricación de geles anticonceptivos a fin de mejorar la adherencia de los compuestos espermicidas al epitelio vaginal. Sobre la base de esta aplicación y de la actividad antiviral informada para polisacáridos sulfatados y otras sustancias polianiónicas ante virus de importancia en el campo de la salud humana,² se impulsaron los estudios de la actividad microbicida de los carragenanos a fin de definir sus perspectivas reales como agentes para el control de las enfermedades de transmisión sexual. Es así que el producto denominado Carraguard, desarrollado a partir de un carragenano por el Consejo Popular de Nueva York con apoyo de la Agencia para el Desarrollo Internacional de los Estados Unidos (USAID) y la Fundación Gates, de Seattle, fue aprobado para ser aplicado en ensayos de eficacia en 6 000 mujeres de Botswana y de Sudáfrica, debido a su capacidad para bloquear la multiplicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) tanto in vitro como en modelos animales.³
En nuestro laboratorio se investigó la actividad antiviral de varios tipos de carragenanos, en particular contra los virus herpes simple tipo 1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2). Las infecciones por estos dos virus tienen distribución universal, se estima que 60% a 95% de la población adulta está infectada al menos por uno de ellos. En general, HSV-1 está asociado más frecuentemente con infecciones orales y encefalitis y HSV-2 con infecciones del tracto genital. Ambos virus establecen infecciones latentes en las neuronas sensoriales, que pueden reactivarse y dar episodios recurrentes que en los pacientes inmunocompetentes son en general controladas por la respuesta inmune del huésped y el tratamiento con aciclovir (ACV).⁴ Sin embargo, en los pacientes inmunocomprometidos, la recurrencia de infecciones por HSV puede causar lesiones persistentes y graves, que se tornan resistentes a la quimioterapia antiviral prolongada con ACV u otros compuestos aprobados para uso clínico en humanos.⁵ Todas las drogas antivirales utilizadas en la quimioterapia antiherpética actúan como inhibidoras de la síntesis del ADN viral.Nuestros estudios demostraron la presencia de una marcada actividad antiviral in vitro contra HSV-1 y HSV-2 en distintos tipos de carragenanos aislados de algas rojas de las costas sudamericanas.^6-8 En particular, dos carragenanos extraídos del alga roja Gigartina skottsbergii, el carragenano tipo mu/nu 1C3 (PM: 198 kDa) y el carragenano lambda 1T1 (PM: 83 kDa), con porcentajes de sulfatación de 33.6% y 40.0%, respectivamente, fueron inhibidores muy efectivos de los herpesvirus. Estos dos compuestos inhibieron la formación de placas de lisis en células Vero de cepas de referencia, aislamientos clínicos y variantes resistentes al ACV de HSV-1 y HSV-2, con valores de concentración efectiva 50% (CE₅₀: concentración requerida para reducir el número de placas virales al 50%) < 1 μg/ml y resultaron totalmente atóxicos para las células, ya que utilizados en concentraciones de hasta 1 000 μg/ml no afectaron la viabilidad celular.⁶ Por lo tanto, el índice de selectividad de ambos carragenanos, es decir la relación citotoxicidad/efectividad antiviral fue > 1 000, parámetro indicativo de sus excelentes perspectivas de uso en la quimioterapia antiherpética.
Los estudios sobre el modo de acción de ambos compuestos mostraron que el principal blanco de acción de estos carragenanos fue la adsorción viral,⁹ al interferir con la unión del virión al heparán sulfato, receptor primario de HSV en la membrana celular.¹⁰ Además, 1T1 se caracterizó por presentar actividad virucida notable, al producir inactivación directa de la infectividad por contacto con las partículas virales.⁹
La multiplicación del virus en presencia de concentraciones crecientes de estos compuestos durante períodos prolongados dio lugar a la aparición de mutantes sinciciales que resultaron ligeramente más resistentes a los compuestos que el virus original, manteniendo su sensibilidad al ACV.¹¹
Estos resultados previos sentaron las bases de los estudios preclínicos de actividad antiviral de 1C3 y 1T1 en modelos de infección experimental de ratones por vía intraperitoneal o intravaginal, que se presentan en este trabajo.
Materiales y métodos
Compuestos
Los carragenanos 1C3 y 1T1 se obtuvieron a partir de los estadios cistocárpicos y tetraspóricos, respectivamente, del alga roja Gigartina skottsbergii,¹² y fueron provistos por el equipo de investigación dirigido por el Dr. A. Cerezo, del Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (FCEyN) de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Ambos compuestos se emplearon como soluciones acuosas en PBS en una concentración de 10 mg/ml esterilizadas en autoclave.
Virus y células
Se utilizaron las cepas KOS y MS de HSV-1 y HSV-2, respectivamente. Los virus se propagaron y titularon por la técnica de unidades formadoras de placas (UFP) en células Vero. Las células Vero crecieron como monocapas en medio mínimo esencial de Eagle (MEM) (Gibco, EE.UU.) suplementado con 5% de suero de ternera inactivado y con el agregado de gentamicina a una concentración de trabajo de 50 μg/ml.
Actividad antiviral in vivo
Los ensayos de actividad antiviral in vivo se llevaron a cabo empleando modelos de infección experimental de ratón adulto. En el caso de 1C3 se utilizaron ratones machos de exocría cepa OF1 (Iffa, Credo, Lyon, Francia) del bioterio de Microbiología, FCEyN, UBA, de 8 a 12 semanas de edad, inoculados por vía intraperitoneal (i.p.) con 5x10⁵ UFP de HSV-1 cepa KOS en 0.1 ml de inóculo y tratados con dosis de 1C3 de 30 mg/kg de peso cada una. Los protocolos seguidos incluyeron los siguientes lotes: a) control de mortalidad en animales infectados y tratados con PBS; b) tratamiento con una dosis de la droga por vía i.p. simultáneo con el momento de la infección; c) tratamiento con una dosis de la droga por vía i.p. simultáneo con el momento de la inoculación de virus, y dos dosis 1 y 24 horas luego de la infección; d) tratamiento con dos dosis de droga 1 y 24 horas luego de la infección; e) tratamiento con una dosis de la droga por vía intravenosa simultáneo con el momento de la infección.
En el caso de 1T1 se utilizaron ratones hembras endocriados cepa BALB/c del bioterio del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) (Castelar, Argentina) de 6 a 8 semanas de edad, inoculados por vía intravaginal con 1x10⁵ UFP de HSV-2 cepa MS. Cinco días antes de la inoculación los animales fueron tratados con 20 μl de medroxiprogesterona (Medrosterona, Gador, Argentina), 25 mg/ml, por vía subcutánea, para aumentar la susceptibilidad a la infección viral. La dosis de 1T1 utilizada fue de 0.1 ml de solución del compuesto de concentración 10 mg/ml (50 mg/kg peso). Se utilizaron los siguientes lotes de animales: a) control de mortalidad de animales infectados y tratados con PBS; b) tratamiento inmediatamente antes de la infección con una dosis de 1T1; c) tratamiento inmediatamente antes de la infección con una dosis de 1T1 y dos dosis 2 y 4 horas después de la infección; d) tratamiento con dos dosis de 1T1 2 y 4 horas después de la infección.
Tanto en el caso de 1C3 y como de 1T1 se realizaron controles de toxicidad de droga sin detectarse signos de morbimortalidad en ninguno de los casos.
Estudios farmacocinéticos
El comportamiento farmacocinético de 1C3 se estudió mediante el seguimiento en plasma y órganos del compuesto marcado radiactivamente y mediante el bioensayo de la actividad antiviral debida al compuesto presente en suero ensayada a distintos tiempos luego de su administración. En el primer caso, 5 ratones se inyectaron por la vena caudal con 0.1 ml de [³H]-1C3 (2.10⁵ dpm, 5 mg/ml). A los 5, 10, 30, 60 y 120 minutos se tomaron muestras de 200 μl de sangre de dos animales con aguja heparinizada (25Gx5/8"), se separó el plasma por centrifugación a 1 500 x g durante 5 minutos. Los tres ratones restantes se sacrificaron a los 10, 60 y 120 minutos. Las muestras de plasma se mezclaron con 3 volúmenes de isopropanol y se mantuvieron durante 1 hora a 0°C. Los polisacáridos precipitados se filtraron por papel Whatman n° 1. Los filtros se dejaron secar a temperatura ambiente y la radiactividad asociada de determinó en un contador de centelleo líquido. A los 10, 60 y 120 minutos también se procedió a sacrificar un animal y se extrajeron hígado y riñones. Los óragnos se cortaron en trozos pequeños y se mezclaron con 10 volúmenes de acetona. Luego de 24 horas se descartó la acetona y los trozos de órgano se rehidrataron con PBS. Los trozos se cortaron finamente, se homogeneizaron y los homogenatos se centrifugaron a 10 000 x g durante 10 minutos. A los sobrenadantes se les agregaron 3 volúmenes de isopropanol y se mantuvieron durante 1 hora a 0°C y el precipitado se filtró por papel Whatman nº 1, la radiactividad asociada se determinó del mismo modo descrito anteriormente.
A fin de analizar la actividad antiviral presente en suero se inyectaron 2 animales por la vena caudal con 0.1 ml de 1C3 (10 mg/ml). En distintos tiempos (10, 20, 60, 120 y 180 minutos) se procedió a tomar muestras de sangre de la vena caudal, se la dejó coagular y se separó el suero por centrifugación. Se hizo un pool con las muestras de suero de los dos animales a partir de las cuales se realizaron diluciones seriadas al medio en PBS, se ensayó la actividad antiviral in vitro contra HSV-1 mediante un ensayo de reducción en el número de placas.⁶
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos in vitro con los carragenanos 1C3 y 1T1 sentaron las bases para encarar los estudios de actividad antiviral de dichos compuestos en modelos in vivo. En el caso de 1C3 se utilizó un modelo de infección experimental del ratón adulto OF-1 inoculado por vía intraperitoneal (i.p.) con 5 x 10⁵ UFP de HSV-1. La actividad inhibitoria del compuesto se ensayó por tratamiento de los animales con dosis de 30 mg/kg de peso del animal, ya sea por la misma vía, es decir i.p., o por vía intravenosa (i.v.). Como puede observarse en la tabla 1, cuando los animales se inocularon con el virus y la droga simultáneamente y por la misma vía, los animales tratados mostraron una supervivencia del 87.5%, mientras que de los no tratados ninguno sobrevivivió a la infección (p ± 0.005). Los animales tratados y no protegidos mostraron una tendencia a un retraso en el día promedio de muerte respecto de los controles no tratados, aunque estas diferencias no resultaron estadísticamente significativas (tabla 1). La aplicación de 1C3 luego de la infección, además de la dosis aplicada al momento de infectar, no aumentó significativamente la proporción de ratones sobrevivientes (80%), mientras que la aplicación del compuesto luego de establecida la infección no confirió protección alguna (tabla 1). Cuando el compuesto se administró por vía endovenosa sólo el 40% de los ratones sobrevivieron; aunque menor respecto de la supervivencia obtenida cuando el tratamiento se realizó por vía i.p., este porcentaje de sobrevivientes resultó significativo frente al 100% de mortalidad de los controles no tratados (p ± 0.05) (tabla 1).



La actividad antiviral de 1C3 parece estar dada por una disminución en los niveles de multiplicación viral ejercida desde el mismo momento de la infección. Esta conclusión surge del análisis de las propiedades farmacocinéticas del compuesto. Cuando se monitoreó la presencia de 1C3 en ratones inyectados con la droga por la vena caudal, ya sea por seguimiento del compuesto marcado radiactivamente, así como por ensayo de su actividad biológica, se comprobó una rápida desaparición (vida media ± 30 minutos) de 1C3 de la sangre de los animales, sin que se lograra detectar acumulación de 1C3 en hígado o riñón (datos no mostrados). Estos resultados concuerdan con estudios previos realizados con dextrán sulfato, un polisacárido sulfatado típico, en los que se determinó una vida media del compuesto de 30 minutos tanto en ratones¹³ como en conejos.¹⁴ Asimismo, esta observación puede explicarse sobre la base del mecanismo de acción de 1C3 sobre HSV-1. Se postuló que la droga podría ser capaz de interactuar con sitios de las glucoproteínas de la envoltura viral cargados positivamente, e impedir de esa manera la adsorción de la partícula viral a la superficie celular.⁹ Por este motivo, los porcentajes más altos de protección de los animales fueron obtenidos cuando el compuesto se utilizó al mismo tiempo de la infección y por la misma vía, y no así cuando la infección ya se había establecido.
En lo que respecta a 1T1, su potente actividad virucida irreversible sobre HSV-2,⁹ impulsó los estudios de este compuesto in vivo en un modelo de infección animal que permitiera un tratamiento tópico y no sistémico, pudiendo valorar de esta manera sus perspectivas como microbicida en la prevención de la trasmisión de la infección herpética. Para ello se desarrolló un modelo de infección experimental del ratón por vía vaginal (v.), más acorde con la transmisión natural del virus. Ratones BALB/c se inocularon intravaginalmente con 1 x 10⁵ UFP de HSV-2 y fueron tratados con dosis de 50 mg/kg de peso c/u de 1T1 colocadas por la misma vía. El tratamiento con una sola dosis de 1T1, al mismo tiempo de realizar la infección, protegió al 90% de los animales infectados, mientras que aquellos animales tratados con una segunda dosis de 1T1 a la hora de realizada la infección mostraron un 100% de supervivencia en contraposición a los controles sin tratar, que presentaron un 90% de mortalidad (p ± 0.005) (tabla 1). Este tratamiento, además de disminuir marcadamente la mortalidad, bloquea la multiplicación viral detectada a nivel de las secreciones vaginales (datos no mostrados). Del mismo modo que ocurrió con 1C3, el tratamiento con 1T1 no resulta efectivo si se realiza luego de iniciar la infección (tabla 1).
Por otra parte, 1T1 es capaz de proteger los animales; los niveles de mortalidad fueron similares a los obtenidos cuando se lo aplicó simultáneamente con la infección, cuando es colocado hasta una hora antes de realizar la inoculación con el virus (datos no mostrados). Esta observación estaría justificada por la marcada actividad virucida de 1T1 y su gran viscosidad, propiedades ventajosas del compuesto en su utilización como agente microbicida de aplicación profiláctica.
Los resultados obtenidos con 1T1 coinciden con informes de otros autores sobre la eficacia y seguridad de carragenanos y polisacáridos comerciales como microbicidas vaginales^15-19 y avalan las excelentes perspectivas de 1T1 para el tratamiento tópico preventivo de las infecciones herpéticas.
Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo

1. Valenta C, Schultz K: Influence of carrageenan on the rheology and skin permeation of microemulsion formulations. J Control Release 2004, 95 (2): 257-265.
2. Witvrouw M, Desmyter J, De Clercq E: Sulfated polysaccharides extracted from sea algae as potential antivirals. Gen Pharmacol 1997, 29: 497-511.
3. Spieler Trager R: Raising new barriers against HIV infection. Science 2003, 299: 39.
4. Whitley RJ, Roizman B: Herpes simplex virus infections. The Lancet 2001, 357: 1513-1518.
5. Brady RC, Bernstein DI: Treatment of herpes simplex virus infections. Antiviral Res 2004, 61 (2): 73-81.
6. Carlucci MJ, Pujol CA, Ciancia M, y col.: Antiherpetic and anticoagulant properties of carrageenans from the red seaweed Gigartina skottsbergii and their cyclized derivatives: correlation between structure and biological activity. Int J Biol Macromol 1997, 20: 97-105.
7. Kolender AA, Pujol CA, Damonte EB, y col.: Sulfation of kappa-carrageenan and antiviral activity. Anales Asoc Quím Argent 1998, 3(6): 304-311.
8. Cáceres PJ, Carlucci MJ, Damonte EB, y col.: Carrageenans from Chilean samples of Stenogramme interrupta (Phyllophoraceae): structural analysis and biological activity. Phytochemistry 2000, 53: 81-86.
9. Carlucci MJ, Ciancia M, Matulewicz MC, y col.: Antiherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types. Antiviral Res 1999, 43: 93-102.
10. Spear PG, Eisenberg RJ, Cohen GH: Three classes of cell surface receptors for alphaherpesvirus entry. Virology 2000, 275: 1-8.
11. Carlucci MJ, Scolaro LA, Damonte EB: Herpes simplex virus type 1 variants arising after selection with an antiviral carrageenan: lack of correlation between drug susceptibility and syn phenotype. J Med Virol 2002, 68: 92-98.
12. Matulewicz MC, Ciancia M, Noseda MD, y col.: Carrageenan systems from tetrasporic and cystocarpic stages of Gigartina skottsbergii. Phytochemistry 1989 28:2937-2941.
13. Hayashi K, Hayashi T, Kojima I: A natural sulfated polysaccharide, calcium spirulan, isolated from Spirulina platensis: in vitro and ex vivo evaluation of anti-herpes simplex virus and anti-human immunodeficiency virus activities. AIDS Res Hum Retroviruses 1996, 12:1463-1471.
14. Hartman NR, Johns DG, Mitsuya II: Pharmacokinetic analysis of dextransulphate in rats as pertains to its clinical usefulness for therapy of HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses 1990, 6:805-812.
15. Zeitlin L, Whaley KJ, Hegarty TA, y col.: Tests of vaginal microbicides in the mouse genital herpes model. Contraception 1997, 56: 329-335.
16. Coggins C, Blanchard K, Alvarez B, y col.: Preliminary safety and acceptability of a carrageenan gel for possible use as a vaginal microbicide. Sex Transm Infect 2000, 76: 480-483.
17. Piret J, Lamontagne J, Bestman-Smith J, y col.: In vitro and in vivo evaluation of sodium lauryl sulfate and dextran sulfate as microbicides against herpes simplex and human immunodeficiency viruses. J Clin Microbiol 2000, 38: 110-119.
18. Maguire RA, Bergman N, Phillips DM: Comparison of microbicides for efficacy in protecting mice against vaginal challenge with herpes simplex virus type 2, cytotoxicity, antibacterial properties, and sperm immobilization. Sex Transm Dis 2001, 28: 259-265.
19. Keller MJ, Klotman ME, Herold BC: Development of topical microbicides for prevention of human immunodeficiency virus and herpes simplex virus. Am J Reprod Immunol 2003, 49(5): 279-284.