SEROLOGICAL SCREENING OF ANTIBODIES TO TRYPANOSOMA CRUZI IN BLOOD BANKS IN BUENOS AIRES, ARGENTINA

Abstract
Blood transfusion is the second most common way of Chagas\' disease infection in affected countries. The WHO recommends the use of at least two tests in the serological screening of blood donations. The conventional tests, enzyme-immunoassay (EIA) and indirect hemagglutination (IHA) are not sufficiently sensitive and specific. The aim of this work was to study the prevalence of anti-Trypanosoma cruzi in our blood donor population and to compare the relative sensitivity and specificity of different tests. We evaluated 103 752 consecutive voluntary blood donors with IHA (Polychaco) and EIA (Biomerieux and Abbott). Repeatedly reactive samples were analysed using a third method. The seroprevalence was 2.26% and 1.34% were confirmed positive. All the EIAs used in our studies were more sensitive than the IHAs with different specificities. The recombinant EIA evidenced a greater relative specificity than the conventional one and a very good performance in sensitivity was observed. In blood banks screening it is very important to use tests with reliable and reproducible results instead of an association of tests that provide discordant results of difficult interpretation. In conclusion, it would be appropriate to consider the possibility of employing only one test, such as an improved EIA, which shows greater sensitivity and specificity.

Artículo completo
Introducción
La enfermedad de Chagas es endémica en América latina. Su agente, el Trypanosoma cruzi (T. cruzi), se transmite principalmente a través de las heces de los triatómidos infectados.¹
De acuerdo con datos de la Organización Mundial de la Salud, existen entre 16 y 18 millones de personas infectadas y 100 millones con riesgo de infectarse.² Se estima además, que se producen 700 000 casos nuevos anualmente, con un número de muertes que oscila entre 23 000 y 45 000 por año. Por otra parte, existe un número importante de personas que emigran a países no endémicos, lo que representa un riesgo de transmisión por vía transfusional.³
La vía transfusional es la segunda ruta más común de infección en regiones endémicas¹ y el riesgo de transmisión por unidad infectada transfundida es de 12% a 25%.⁴
En América latina, la prevalencia de donantes de sangre infectados con T. cruzi es variable, del 2% al 3% en grandes ciudades como Buenos Aires o Caracas al 62% en países como Bolivia.^5-6
Los métodos de diagnóstico para la infección por T. cruzi en bancos de sangre se basan en la detección de anticuerpos, ya que los métodos parasitológicos son dificultosos de realizar y tienen una sensibilidad del 30% al 50%.⁷ Las pruebas convencionales utilizadas con mayor frecuencia son la hemoaglutinación indirecta (HAI), la inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el enzimoinmunoensayo (EIA).⁸ Estos ensayos no son suficientemente específicos.^9,10 Esto sucede principalmente porque las preparaciones antigénicas derivan de extractos de parásitos o fracciones semipurificadas de epimastigotes (la forma no infectiva del parásito) y los procedimientos técnicos difieren entre los laboratorios, por lo tanto son frecuentes los resultados indeterminados. Por otra parte, algunos pacientes chagásicos pueden presentar resultados falsos negativos.¹¹
Más recientemente surgieron las pruebas denominadas no convencionales, que incluyen pruebas por inmunocromatografía, por inmunoflitración, por dot blot (DB) y por aglutinación de partículas de gelatina (AP).^12,13
Entre las pruebas convencionales, la de EIA es la más confiable en cuanto a sensibilidad, pero como ya hemos comentado se observan reacciones cruzadas que perjudican la especificidad. Para resolver este problema surgieron investigaciones que tuvieron como objetivo mejorar la calidad de los antígenos utilizados. Por utilización de técnicas de ADN recombinante y el secuenciamiento de genes de antígenos de T. cruzi se obtuvieron antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para uso diagnóstico.^14-20
En cuanto a la especificidad, la OPS sugiere el uso de al menos dos métodos para diagnosticar la enfermedad.⁹
Debido a los problemas en cuanto a la sensibilidad, la OMS¹⁴ recomienda el uso de al menos dos ensayos en el tamizaje serológico en bancos de sangre. Generalmente se utiliza una técnica de EIA y otra de HAI. En la Argentina esta práctica es obligatoria y en Brasil lo fue hasta diciembre de 2002. Esto se debe a que estudios recientes⁸ demostrarono que la técnica de HAI presenta muy baja sensibilidad y no es una prueba segura en donantes de sangre. Por lo tanto se recomienda utilizar un ensayo de EIA que emplee antígenos recombinantes o péptidos sintéticos y presente mejor sensibilidad y especificidad como única prueba en el tamizaje de donantes de sangre.
El objetivo de este trabajo fue estudiar la prevalencia de anticuerpos anti-T. cruzi en nuestra población de donantes de sangre, comparar la sensibilidad y la especificidad relativa de los dos ensayos que utilizamos rutinariamente y la de otros dos métodos: un EIA que utiliza proteínas recombinantes y otro método de HAI.
Materiales y métodos
Población estudiada
En el presente estudio se describen los resultados obtenidos desde mayo de 1995 hasta diciembre de 2003. En este período se estudiaron 103 752 donantes consecutivos de reposición.
Ensayos serológicos
Todas las donaciones recibieron tamizaje serológico con dos ensayos comerciales:
1. HAI (Polychaco, Buenos Aires, Argentina);
2. EIA (dividido en dos grupos). Grupo A: 79 087 donaciones, con Chagatek (Biomerieux, Buenos Aires, Argentina), Grupo B: 24 665, con Chagas EIA (Abbott, San Pablo, Brasil).
Toda muestra inicialmente reactiva fue estudiada nuevamente, las muestras repetidamente reactivas en uno o ambos ensayos se estudiaron por un tercer método:
3. DB (Bio Chagas, Gador, Buenos Aires, Argentina)¹³ o
4. AP (Serodia, Fujirebio, Tokio, Japón).
Los sueros que reaccionaron en al menos dos pruebas se consideraron positivos.
Otros ensayos evaluados
5. Otro ensayo de EIA que utiliza proteínas recombinantes (Chagatest, ELISA recombinante v.3.0, Wiener Lab., Argentina). Esta técnica utiliza seis antígenos recombinantes, los cuales pertenecen a los estadios de tripomastigote y epimastigote, y son sintetizados a partir de fragmentos sumamente conservados de diferentes cepas de T. cruzi. Ellos son: Ag 1, Ag 30, Ag 36, Ag 2, Ag 13 y Ag SAPA; y además,
6. otro ensayo de HAI (Chagatest HAI, Wiener Lab., Argentina).
Evaluación de la especificidad para el ensayo 5 (EIA recombinante)
Se emplearon 784 muestras aleatorizadas de donantes y se compararon con los resultados de los dos ensayos empleados como rutina (ensayo 1: HAI y ensayo 2: EIA Grupo A, Chagatek) y el tercero utilizado como prueba de confirmación (ensayo 4: AP).
Evaluación de la especificidad para el ensayo 6 (HAI, laboratorios Wiener)
Se estudiaron paralelamente 475 muestras de donantes de sangre consecutivos con esta técnica y las otras tres utilizadas en nuestro banco de sangre, como acabamos de detallar.
Evaluación de la sensibilidad para los ensayos 5 y 6 (EIA recombinante y HAI, laboratorios Wiener)La evaluación de la sensibilidad relativa de ambos ensayos se realizó paralelamente, utilizando muestras reactivas seleccionadas y en paneles de sueros estudiados previamente mediante las técnicas de rutina ya descritas.
Como se observa en la tabla 1, los criterios de positividad adoptados fueron los siguientes:
- Muestras positivas: a) reactivas con EIA RP > 2 y uno o dos de los otros ensayos reactivos, b) reactivas con EIA RP < 2 y otros dos ensayos reactivos.
- Muestras débiles positivas: a) reactivas con EIA < 2 y otro ensayo reactivo, b) con EIA no reactivo y los otros dos ensayos reactivos.
- Falsas positivas: reactivas en un solo ensayo.
Análisis estadísticos
Se calcularon la media, el error estándar y los intervalos de confianza con un nivel del 95%. Se consideraron significativos los valores de p < 0.05.

Tabla 1. Criterios de clasificación de las muestras de acuerdo con su reactividad con los tres ensayos serológicos convencionales.
Referencias. EIA: enzimoinmunoensayo; HAI: hemoaglutinación indirecta; AP aglutinación pasiva; RP: positividad relativa, densidad óptica (DO) de la muestra sobre el valor de corte.

Resultados
Seroprevalencia
La seroprevalencia fue 2.26 % (2 347/103 752 muestras fueron reactivas por uno o ambos métodos de tamizaje, ES: 0.146, IC: 1.974-2.556, p < 0.05) y 1.34% (1 396/103 752; ES: 0.113, CI: 1.123-1.576, p < 0.005) se confirmaron positivos.
En la tabla 2 se describen los porcentajes de sueros reactivos para 1, 2 y 3 ensayos. Mil sesenta y tres muestras (1.02%) fueron reactivas en las tres pruebas, 333 (0.31%) en dos y 951 (0.92%) sólo en una. Como podemos observar, del total de muestras reactivas en el tamizaje, el porcentaje de resultados falsos positivos (sólo reactivos en un ensayo) es elevado, 40.52%. El 45.29 % de las muestras son reactivas para tres pruebas y 14.19% para dos.

Tabla 2. Seroprevalencia para anti-T. cruzi en 103 752 donantes de reposición evaluada con diferentes ensayos.

En la tabla 3 se detalla la positividad relativa (RP) que es igual a la densidad óptica (DO) de la muestra sobre el valor de corte, y los porcentajes correspondientes a las distintas marcas de EIA utilizadas.

Seroprevalencia para anti-T. cruzi en 103 752 donantes de reposición evaluada con diferentes ensayos, discriminando por valor de relatividad positiva y por marca de EIA.
Referencias: RP: positividad relativa, densidad óptica (DO) de la muestra sobre el valor de corte.

En cuanto a los resultados falsos positivos de EIA, es interesante destacar que 94.5% (396 de 419 muestras) del Grupo A y 61.8% (233 de 377 muestras) del Grupo B, presentaron un valor de RP < 2.
Del mismo modo, las muestras reactivas para sólo dos técnicas presentan en su mayoría valores de EIA bajos, con RP < 2. En el patrón 3, donde observamos los falsos negativos del tercer ensayo, 35/49 (71.4%) del Grupo A y 10/16 del grupo B (62.5%) y en el patrón 4, los falsos negativos para el HAI, 154/210 (73.3%) del Grupo A y 37/54 del Grupo B (68.5%) presentaron valores bajos de DO.
Además, la mayoría de las muestras reactivas por las tres técnicas tienen un valor de RP para el EIA > 2 (931/1 063, el 87.6% en total).
Sensibilidad y especificidad relativa de las técnicas utilizadas en el tamizaje de rutina

Tabla 4. Sensibilidad y especificidad relativa de los tres ensayos utilizados en el tamizaje de donantes de sangre.

Como se observa en la tabla 4, ambos EIA presentaron mayor sensibilidad relativa (99.71% para cada uno de los ensayos), mientras que el HAI presentó 264 muestras falsas negativas (sensibilidad relativa 81.09%). Por otra parte, la especificidad relativa fue mayor para el HAI con respecto a los EIA (99.46%; 98.47% y 99.85% para EIA ensayo A, EIA ensayo B y HAI, respectivamente).
Notamos que la técnica de EIA correspondiente al Grupo B presenta menor especificidad relativa que el EIA utilizado en el Grupo A. En el ítem anterior, cuando detallamos la seroprevalencia, describimos en los resultados observados en la tabla 3 que el porcentaje de muestras con valores altos de DO es mayor para el ensayo con el grupo B; este hecho podría explicar la menor especificidad relativa registrada.
Especificidad relativa del EIA recombinante (Laboratorios Wiener)Los resultados se observan en la tabla 5.

Tabla 5. Especificidad relativa del EIA recombinante (Laboratorios Wiener) utilizando muestras de donantes consecutivos.
Referencias: EIA: enzimoinmunoensayo; HAI: hemoaglutinación indirecta; AP aglutinación pasiva.

De las 784 muestras, 775 fueron negativas para los cuatro ensayos estudiados. Siete muestras fueron reactivas para todos, una fue reactiva sólo para el EIA recombinante y otra para ambos EIA. La especificidad fue del 99.74%.
Especificidad relativa del HAI (Laboratorios Wiener)
Los resultados se describen en la tabla 6.

Tabla 6. Especificidad relativa del HAI (Laboratorios Wiener) utilizando muestras de donantes consecutivos.
Referencias: EIA: enzimoinmunoensayo; HAI: hemoaglutinación indirecta; AP aglutinación pasiva.

De las 475 muestras, 462 fueron negativas para los cuatro ensayos estudiados. Cuatro muestras fueron reactivas para todos, una fue falsa positiva para ambos HAI, una falsa negativa para el HAI de rutina, otra falsa positiva para el HAI de rutina y 5 falsas positivas para el HAI de Wiener, mientras que una fue falsa positiva para el EIA.
En el estudio con estas muestras, la especificidad relativa del HAI de Wiener fue 98.74 %, mientras que para el de rutina fue mayor, del 99.58% (en el estudio con las 103 752 muestras fue similar: 99.85%).
Estudios de sensibilidad relativa de EIA recombinante y HAI (Laboratorios Wiener) en paneles de muestras positivasLos resultados pueden ser observados en la tabla 7.

tabla 7. Sensibilidad relativa del EIA recombinante HAI Wiener empleando un panel de muestras positivas.
Referencias: EIA: enzimoinmunoensayo; HAI: hemoaglutinación indirecta.

Con respecto a la sensibilidad del EIA recombinante, las 60 muestras positivas (grupos 1, 2, 3 y 4) y las 18 muestras débiles positivas (grupos 5, 6 y 7), también fueron reactivas.
De las 60 muestras falsas positivas, reactivas sólo en un ensayo, únicamente 21 fueron reactivas con el EIA recombinante, las dos muestras de grupo 8 (EIA RP > 2) y 19 del grupo 9 (EIA < 2). Por otra parte, todas las muestras del grupo 10 (HAI reactivo) fueron negativas con el EIA recombinante.
Es interesante destacar que los valores de densidad óptica fueron mayores con el EIA recombinante, considerando las muestras positivas y positivas débiles. La diferencia entre la media de la densidad óptica del EIA recombinante y el convencional fue significativa (p < 0.01). EIA recombinante: 1.71, 95% IC: 1.57-1.84 y EIA convencional: 0.71, 95% IC: 0.63-0.78.
Con respecto a la sensibilidad del otro HAI ensayado, de las 60 muestras positivas, sólo 46 fueron reactivas; de las 18 débiles positivas, 7 resultaron reactivas y de las 60 falsas positivas, 9.
Es importante destacar que como las muestras de los distintos paneles fueron seleccionadas tomando como base los resultados obtenidos con las técnicas empleadas de rutina, existe un sesgo importante a favor de ellas.
Discusión
La prevalencia de donantes con anti-T.cruzi en nuestro banco de sangre fue 2.26% (2 347/103 752 muestras fueron reactivas por uno o ambos métodos de tamizaje), 1.02% fueron positivas en tres ensayos; 0.31% en dos, y 0.92% sólo en uno. Esto significa que la prevalencia confirmada fue de 1.34% (1 396/103 752). Es interesante hacer notar el alto grado de resultados falsos positivos, lo que lleva a un importante descarte de unidades.
Como ya comentamos, las técnicas serológicas para detección de anticuerpos son las recomendadas para identificar individuos infectados crónicamente con la enfermedad de Chagas. En general, las especificidades y sensibilidades de los ensayos comerciales son altas cuando se evalúan con sueros bien caracterizados, pero son muy comunes las discrepancias cuando se utilizan combinaciones de técnicas serológicas en estudios epidemiológicos o tamizaje en bancos de sangre en poblaciones que no son de riesgo.^6,9,21
Ninguno de los métodos de diagnóstico para la enfermedad de Chagas es 100% seguro en bancos de sangre, además, en poblaciones de baja prevalencia es de esperar que el valor predictivo positivo sea bajo, dando lugar a una importante cantidad de falsos positivos que deben ser confirmados por otros ensayos.²² La utilización de diferentes métodos ha dado lugar a resultados contradictorios, debido probablemente a la utilización de diferentes cepas de T. cruzi y a diferentes procedimientos de fraccionamiento antigénico, lo que causa variaciones en la sensibilidad y especificidad.²³
Lo que realmente interesa en el tamizaje serológico es que se utilicen pruebas cuyos resultados sean reproducibles y confiables y no la asociación de ensayos que proporcionen un gran número de resultados discordantes de difícil interpretación, que además de constituir un problema de costo económico y de pérdida de material biológico valioso, como es la sangre, causa ansiedad en los donantes de sangre a los cuales hay que informarles los resultados.
Todos los EIA utilizados en nuestros estudios fueron más sensibles que los HAI con diferente grado de especificidad. De los EIA, el recombinante presentó la mayor especificidad relativa y se observó un muy buen resultado en cuanto a la sensibilidad en los paneles estudiados.
Otros autores describieron resultados satisfactorios con respecto a la sensibilidad y la especificidad de diferentes EIA comerciales pero menor sensibilidad para HAI.^24-27
Sáez Alquézar y col.²⁸ evaluaron la eficacia en bancos de sangre en Brasil en cuanto al tamizaje de anti-T. cruzi y describen que 42% de los laboratorios informan errores, los que utilizaron sólo HAI fueron responsables de 49 de 64 falsos negativos, lo que implicaría que este ensayo tiene baja sensibilidad.
Otro estudio para evaluar el desempeño de 11 ensayos de HAI comercializados en Brasil mostró que solamente 4 de ellos presentaban sensibilidad aceptable para su uso en diagnóstico o en tamizaje serológico.²⁹
Podemos decir que aun si tenemos en cuenta la facilidad de procesamiento y el bajo costo del HAI no es una prueba segura para tamizaje en donantes de sangre.
Entre los ensayos convencionales, el de EIA es la más confiable debido a su mayor sensibilidad, pero hasta el momento la mayoría de los EIA comercializados utilizan antígenos crudos o semipurificados, lo que lleva frecuentemente a la aparición de reacciones cruzadas que perjudican la especificidad.
Para resolver estos problemas, la utilización de técnicas de ADN recombinante y secuenciamento de genes de antígenos dominantes de T. cruzi permitió la obtención de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para uso diagnóstico.
Existen muchos estudios con paneles de sueros procedentes de países de Latinoaméica que muestran mejor desempeño en cuanto a sensibilidad y especificidad de los EIA que utilizan antígenos recombinantes.^15-17 Los sueros individuales reaccionan con varios de los antígenos en formas diferentes, y se llegó a la conclusión de que deben utilizarse mezclas de antígenos recombinantes para obtener la mayor sensibilidad. Resultados similares se obtuvieron utilizando péptidos sintéticos.^18,19
Otro hecho interesante para destacar es el referido a los diferentes valores de DO en los distintos EIA. Por un lado, uno de los EIA convencionales (ensayo 2B) muestra valores de DO más elevados que el otro EIA convencional (ensayo 2A) pero con un mayor número de resultados falsos positivos y, consecuentemente, menor especificidad. Con respecto al EIA recombinante, al ser comparado con el EIA convencional (ensayo 2A), presenta valores de DO mayores sin afectar la especificidad.
En conclusión, se podría comenzar a pensar en la posibilidad de emplear como única prueba un método de EIA mejorado que utilice antígenos recombinantes o péptidos sintéticos, los cuales presentan mayor sensibilidad y especificidad para el tamizaje en bancos de sangre. De esta forma se podría conseguir mayor seguridad para evitar la transmisión de la enfermedad de Chagas por vía transfusional y un menor descarte de unidades. Por otra parte, el hecho de contar con técnicas que presenten valores de DO más elevados, facilita la interpretación, siempre que no afecte la especificidad, y en el caso de contar con equipos de sensibilidad y especificidad comparables, sería de utilidad la elección de dichos reactivos.
Los autores no manifiestan conflictos

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