ERYTHROCYTE DAMAGE AND LEUKOCYTE ACTIVATION AS POTENTIAL RISK MARKERS FOR CARDIOVASCULAR EVENTS

Abstract
The traditional lipid risk factors can only predict some of the cardiovascular events. Our recent work has focused on new potential biological markers of risk, namely erythrocyte damage and leukocyte activation. We have studied these potential markers in patients at risk for cardiovascular events, in myocardial infarction and ischemic stroke cases and in adolescents practising moderate and high competition physical exercise. Some in vitro studies were also performed to strengthen the value of the proposed markers. We found a rise in leukocytes which seem to be activated, as shown by the increase in their activation products, elastase and lactoferrin. This activation seems to impose erythrocyte damage and premature aging, as suggested by the increase in membrane bound hemoglobin and by a different band 3 profile. The in vitro studies showed that the modifications imposed to band 3 profile by increasing concentrations of activated neutrophils and elastase were correlated, and were similar to those presented by older erythrocytes. Our data suggest that plasma levels of elastase and lactoferrin, together with levels of erythrocyte membrane bound hemoglobin and band 3 profile, warrants further studies as potential new markers of risk for cardiovascular events.

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Aterogénese
Vários estudos epidemiológicos e laboratoriais têm evidenciado diferentes factores de risco de eventos cardiovasculares, nomeadamente um perfil lipídico alterado (hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, concentrações elevadas de colesterol das lipoproteínas de baixa densidade, de apolipoproteína B e de lipoproteína (a); baixas concentrações de colesterol das lipoproteínas de alta densidade e da apolipoproteína A), hábitos tabágicos, sedentarismo, hipertensão arterial, hiperfibrinogenemia, hiper-homocisteinemia, obesidade. Estes factores de risco podem ocorrer isoladamente ou em associação sinérgica, todavia, permitem prever apenas alguns dos eventos cardiovasculares. Considerando a importância das DCV, pela sua prevalência e complicações associadas (a primeira causa de mortalidade e de morbilidade em Portugal)¹ e que os factores de risco tradicionais prevêm apenas alguns dos eventos, torna-se importante o estudo de novos marcadores de risco.^2,3A importância dos lípidos e das lipoproteínas na aterogénese é inquestionável. Estão também envolvidas diversas células e processos metabólicos no processo aterogénico, o qual pode ter início ou não numa lesão do endotélio vascular. O processo aterogénico pode iniciar-se pela adesão de monócitos/macrófagos à célula endotelial morfologicamente ilesa, na sequência da infiltração de LDL no espaço subendotelial. Neste espaço, a LDL é modificada oxidativamente, sendo esta modificação determinada por metabolitos de oxigénio que podem ter origem nos monócitos/macrófagos, nas células musculares lisas ou nas células do endotélio vascular. A LDL oxidada constitui um factor quimiotáctico para os monócitos circulantes, tem capacidade para inibir a motilidade dos macrófagos, sendo fagocitada por estes mais avidamente do que a LDL nativa. Ou seja, da modificação oxidativa das LDL no espaço subendotelial resulta a mobilização de monócitos da circulação sanguínea, a acumulação de macrófagos e a formação de células "foam". Este processo adquire uma progressão "auto-catalítica" em que interactuam células activadas do espaço extra-vascular (macrófagos, linfócitos, células musculares lisas), da parede vascular e do espaço intra-vascular (plaquetas, monócitos, neutrófilos, linfócitos). No centro desta interacção celular está o macrófago que, para além de constituir uma fonte importante de metabolitos de oxigénio e proteases, é capaz de secretar citoquinas que induzem activação e proliferação de células musculares lisas, fibroblastos e células endoteliais, também elas capazes de produzir e secretar mediadores inflamatórios como o interferon, o TNF, a PAF.⁴ Algumas das citoquinas secretadas pelas células inflamatórias têm capacidade para activar células da circulação sanguínea, nomeadamente o monócito, o linfócito, o neutrófilo e as plaquetas.
É razoável que a activação celular decorrente do processo aterosclerótico, acompanhada por libertação de mediadores de activação leucocitária, de proteases e de metabolitos de oxigénio capazes de difusão através das membranas celulares, contribua para o desenvolvimento de um ambiente de stress oxidativo e proteolítico.
A localização típica das placas ateroscleróticas na rede vascular,⁵ em zonas de turbulência e estase, é sugestiva da importância de uma interacção próxima das células no processo aterosclerótico, por favorecer a interacção celular e dos seus produtos de activação e, ainda, por favorecer a lesão do endotélio vascular. A viscosidade sanguínea é também um factor importante, favorecendo a turbulência, estase e interacção celular.⁶ Esta, é determinada por condições físicas como a temperatura, por forças de atrito entre as células capazes de romper a agregação eritrocitária e induzir a deformação celular, e, ainda, pela composição sanguínea (hematócrito, capacidade de deformabilidade dos eritrócitos, número de leucócitos, concentração de lípidos plasmáticos, de fibrinogénio) e pela tensão arterial.^6,7
Importância dos neutrófilos
Os doentes cardiovasculares apresentam frequentemente uma leucocitose do tipo neutrofílico, sugestiva do envolvimento do neutrófilo na fisiopatologia da aterogénese.^8,9 Foi atribuída capacidade para activar o neutrófilo a algumas citoquinas secretadas pelo macrófago e por outras células inflamatórias, como a IL-1, IL-8 e TNF.
O neutrófilo é uma célula de recursos sofisticados e complexos, em comunicação contínua com o meio circundante. Possui no seu citoplasma quatro tipos de granulações,¹⁰ as granulações primárias ou azurófilas, as secundárias ou neutrófilas, as granulações terciárias e as vesículas secretórias, sendo estas duas últimas apenas visíveis à microscopia electrónica.
As granulações neutrófilas, específicas do neutrófilo, são ricas em fosfatase alcalina, lisozima, aminopeptidase e lactoferrina. As granulações azurófilas, também presentes no monócito, são ricas em mieloperoxidase, fosfatase ácida, β-lactosidase, β-glucuronidase, proteínas catiónicas, colagenase e elastase.
Em condições fisiológicas, os neutrófilos estabelecem ligações fracas com o endotélio vascular através de moléculas de adesão (selectinas), rolando ao longo da rede vascular. A adesão firme do neutrófilo ao endotélio vascular é mediada por outro tipo de moléculas de adesão, as integrinas, que permitem a transmigração do neutrófilo para o espaço extra-vascular, seguindo gradientes de factores quimiotácticos como os metabolitos de oxigénio, factores do complemento, substâncias hidrossolúveis de origem bacteriana, metabolitos do ácido araquidónico, produtos de activação plaquetária, citoquinas e interleuquinas produzidas pelas diversas células mediadoras da inflamação. A activação do neutrófilo é acompanhada de desgranulação e de activação metabólica, com produção de metabolitos de oxigénio, como o anião superóxido, peróxido de hidrogénio, radical hidroxilo e oxigénio singleto.
A produção de metabolitos de oxigénio e a libertação de proteases pelas células inflamatórias no espaço vascular ou próximo deste, como acontece nas placas ateroscleróticas, pode determinar modificações oxidativas e/ou proteolíticas nas células endoteliais ou do espaço subendotelial, nas células sanguíneas, nomeadamente nos eritrócitos e em diferentes constituintes plasmáticos, favorecendo a aterogénese e o risco de eventos cardiovasculares.
Importância dos eritrócitos
O eritrócito é uma célula particularmente sensível a agressões oxidativas e proteolíticas por ter uma capacidade sintética muito limitada, que o impede de substituir ou reparar as modificações ocorridas nas suas proteínas. Ao longo da sua vida o eritrócito sofre e acumula lesões físicas e químicas decorrentes de um processo de senescência normal ou de agressões físicas e químicas.^11-14
Considerando que a síntese de novo é limitada no eritrócito e que a remoção de eritrócitos senescentes ou lesados é mediada pelos macrófagos, o sinal tradutor de lesão ou envelhecimento deve resultar da modificação de um dos constituintes normais do eritrócito maduro e localizar-se na superfície exofacial da membrana, permitindo aos macrófagos identificar modificações bioquímicas intra-eritrocitárias traduzidas para a membrana. Vários estudos evidenciaram a presença de um neoantigénio de senescência na superfície da membrana de eritrócitos senescentes ou lesados, que se liga a auto-anticorpos específicos do tipo IgG. Estes, são anticorpos naturais específicos para a proteína banda 3 da membrana do eritrócito e em conjunto com o complemento medeiam o reconhecimento e remoção de eritrócitos senescentes ou lesados pelos macrófagos.^15-19
A proteína banda 3 de 90-100 Kd, é uma proteína transmembranar com diferentes funções na célula.²⁰ O domínio citoplasmático é portador dos locais de fixação de proteínas do citosqueleto (4.2, 4.1 e anquirina) e de ligação de alta afinidade para várias enzimas da glicólise (G3PD, PK, aldolase) e para a hemoglobina oxidada. O domínio transmembranar e extracelular é responsável pelo transporte de aniões. Esta proteína distribui-se uniformemente pela membrana e liga-se aos auto-anticorpos naturais anti-banda 3 através de ligações não covalentes. Em caso de proteólise, de agregação ou de exposição anormal dos epítopos de banda 3, esta ligação aos anticorpos anti-banda 3 torna-se forte, indissociável, promovendo a activação do complemento e, finalmente, a remoção do GV velho ou lesado pelos macrófagos.
Sendo oxidada, a hemoglobina poderá ser regenerada ao seu estado reduzido funcional, pelos sistemas NADPH/meta-hemoglobina redútase principal e NADH/meta-hemoglobina redútase acessória. No caso de falência destes sistemas, a hemoglobina oxidada liga-se preferencialmente ao domínio citoplasmático da proteína banda 3, promovendo a sua agregação.²¹
A desnaturação da hemoglobina e, por consequência, a agregação da banda 3, pode resultar do desenvolvimento de stress oxidativo na célula, por falência dos mecanismos de defesa antioxidante, decorrente de um processo de envelhecimento eritrocitário normal ou imposto por uma situação de stress oxidativo.^13,22
A activação leucocitária, com produção de metabolitos de oxigénio e proteases, pode determinar modificações nas proteínas da membrana do GV alterando a sua antigenicidade, determinar a oxidação de lípidos da membrana e a oxidação da hemoglobina e, finalmente, a remoção prematura dos eritrócitos lesados.^23-28
Potenciais marcadores de risco
Os estados inflamatórios de origem fisiológica ou patológica têm em comum o facto de poderem evoluir de uma forma súbita e muitas vezes imprevisível para um evento grave ou mesmo fatal.
Estes processos inflamatórios de origem fisiológica, como o exercício físico e a gravidez, ou de origem patológica, como as doenças cardiovasculares, cursam habitualmente com uma leucocitose do tipo neutrofílico e frequentemente com uma redução no número de eritrócitos. Esta associação sugere que a exposição de eritrócitos a metabolitos de oxigénio e a proteases, ambos produzidos por neutrófilos activados, pode determinar lesões oxidativas e/ou proteolíticas nos eritrócitos, cuja acumulação, pode ser determinante de uma remoção acelerada e prematura de eritrócitos. Ou seja, é provável que o GV sob stress oxidativo ou proteolítico seja marcado precocemente para a morte, por modificações na proteína banda 3.
Na procura de novos marcadores de risco temos avaliado em diferentes processos inflamatórios fisiológicos e patológicos, o eritrócito como um marcador cumulativo de stress oxidativo e proteolítico e os neutrófilos como uma fonte de metabolitos de oxigénio e de proteases.
Num primeiro estudo feito em doentes em risco de eventos cardiovasculares (hipertensos; sobreviventes de enfarte de miocárdio com mais de 3 meses; sobreviventes de enfarte de miocárdio com menos de 48 horas) e num grupo controlo,²⁹ verificámos que o valor de hemoglobina ligada à membrana (HbLM) era superior nos doentes e que o perfil da proteína banda 3 da membrana eritrocitária (% de monómero, agregados e fragmentos) era diferente, apresentando os doentes valores mais elevados de agregados de banda 3 e mais baixos de monómero e de fragmentos proteolíticos; os valores de agregação da banda 3 eram acompanhados de uma maior ligação de IgG à membrana. Observou-se ainda uma correlação negativa da concentração de neutrófilos, quer com a concentração de GV quer com a actividade da glucose-6-fosfato desidrogenase eritrocitária (um reconhecido índice de idade eritrocitária).
A fim de clarificar a aparente relação entre lesão e envelhecimento eritrocitário com a acção de produtos de activação do neutrófilo, observada no estudo anterior, procedemos a um estudo in vitro,³⁰ no qual avaliámos o valor de HbLM e o perfil da banda 3 em GV de idades diferentes (separados por centrifugação em gradiente de densidade), em GV incubados com neutrófilos activados, em concentrações crescentes, e em GV incubados com elastase do neutrófilo, também em concentrações crescentes. A relação usada, entre o número de neutrófilos e o número de GV, era igual ou superior à observada nos doentes que haviam sofrido um enfarte de miocárdio recente. Reforçando a hipótese do envolvimento de neutrófilos activados na lesão e envelhecimento eritrocitário, verificámos que as modificações impostas por concentrações crescentes de neutrófilos activados e de elastase sobre o perfil da banda 3 se correlacionavam positivamente. Verificou-se ainda que estas modificações eram semelhantes às observadas em GV mais densos e mais velhos.
É aceite que o exercício físico moderado constitui um protector cardiovascular,^31,32 embora o mecanismo subjacente não esteja bem definido.³³ Quanto ao exercício físico intenso, como o de alta competição, alguma controvérsia ainda existe quanto ao seu efeito protector.³⁴
O exercício físico é acompanhado de um aumento no metabolismo celular, no ritmo cardíaco e respiratório e na temperatura fisiológica. Observa-se ainda uma perda de líquidos e uma leucocitose neutrofílica. A perda de líquidos determina uma redução no volume plasmático com hemoconcentração e hiperviscosidade plasmática. Estas modificações, em conjunto com o número elevado de leucócitos, de capacidade de deformabilidade reduzida, podem contribuir para alterações hemorreológicas importantes. Durante o exercício físico, os GV devem transportar oxigénio aos tecidos sob um fluxo mais elevado e num meio mais viscoso. O aumento do metabolismo celular e do "turnover" da hemoglobina (oxigenação/desoxigenação) favorecem a produção de metabolitos de oxigénio no plasma e nos eritrócitos, a activação leucocitária e o desenvolvimento de stress oxidativo.^35-36
Considerando as modificações associadas ao exercício físico, é razoável questionar o benefício do exercício físico de alta competição, já que é provável o desenvolvimento de um stress oxidativo e proteolítico elevado e contínuo. Com o objectivo de estudar este efeito, avaliámos e comparámos o perfil lipídico e os valores de activação leucocitária, de lesão eritrocitária e de stress oxidativo em dois grupos de adolescentes de perfil lipídico normal.³⁷ Um dos grupos incluiu nadadores de alta competição e o outro adolescentes que praticavam exercício físico nas aulas de educação física das respectivas escolas. Verificámos que os adolescentes nadadores de alta competição apresentavam valores mais elevados de produtos de activação leucocitária (elastase e lactoferrina), valores mais elevados de HbLM e um perfil de banda 3 perfeitamente distinto do grupo controlo, com aumento dos agregados e redução dos fragmentos proteolíticos, à semelhança do que havíamos observado nos estudos anteriores sugestivos do envolvimento da activação leucocitária na lesão e envelhecimento de eritrócitos.
No perfil lipídico observámos modificações protectoras e modificações de risco. Observámos valores mais elevados de colesterol total, de colesterol das lipoproteínas de baixa densidade (LDLc) e de lipoproteína (a) (Lp(a), valores mais baixos de apolipoproteína AI (Apo AI), como modificações de risco. Como modificações protectoras, observámos valores mais baixos de apolipoproteína B (Apo B) e de triglicerídeos (TG), valores mais elevados de colesterol das liproteínas de alta densidade (HDLc). A associação de valores mais elevados de LDLc e de stress oxidativo observada nos nadadores, pode constituir um risco aterogénico acrescido, se considerarmos a regularidade e a intensidade do exercício físico praticada por estes adolescentes.
A adaptação ao exercício físico intenso parece associar-se a níveis elevados de produtos de activação leucocitária e a envelhecimento e remoção acelerada e prematura. É provável que o exercício físico de alta competição impondo níveis mais elevados de metabolitos de oxigénio e proteases, de colesterol e de LDL, possa favorecer a lesão de células endoteliais e o desenvolvimento prematuro de lesões ateroscleróticas. Além disso, no decorrer da prática de exercício físico intenso todas as modificações se acentuam devido à hemoconcentração por perda de líquidos, o que favorecerá a lesão endotelial e a infiltração lipídica, sobretudo em zonas de maior turbulência e estase na rede vascular.
Num trabalho mais recente,³⁸ o estudo destes potenciais marcadores de risco foi avaliado em doentes diagnosticados com acidente cerebrovascular isquémico por imagem tomográfica computorizada. Para além da concentração plasmática de elastase e de lactoferrina, como marcadores de activação leucocitária, do perfil da banda 3 e do valor de HbLM, como marcadores de lesão eritrociária, avaliou-se o perfil lipídico (colesterol, LDLc, HDLc, TG, Apo AI, Apo B, Lp(a)) e o hemograma (nº GV, concentração de hemoglobina, hematócrito, índices hematimétricos, nº leucócitos e respectiva contagem diferencial).
Verificou-se que os doentes apresentavam valores significativamente mais elevados de leucócitos, em particular de granulócitos, cujo valor quase duplicou relativamente ao grupo controlo. A concentração de elastase e de lactoferrina aumentou também de forma significativa nos doentes, para valores superiores ao dobro do valor apresentado pelo controlo.
O estudo eritrocitário revelou um franco aumento no valor de HbLM (quatro vezes superior ao valor do controlo) e um perfil de banda 3 distinto nos doentes. Estes apresentavam um aumento significativo de agregados de banda 3 e uma redução dos seus fragmentos proteolíticos.
Os resultados observados nestes doentes de acidente cerebrovascular isquémico, sugerem que esta patologia está associada a um aumento no número de neutrófilos e dos seus produtos de activação, os quais parecem estar relacionados com as lesões eritrocitárias observadas, nomeadamente com um aumento de HbLM e de agregação da banda 3.
Considerações finais
A aterogénese com um desenvolvimento progressivo, inicia-se na primeira ou na segunda década de vida, manifestando-se clinicamente algumas décadas mais tarde.
Os estudos epidemiológicos têm evidenciado que para além dos factores de risco tradicionais (lípidos e lipoproteínas), existem outros factores que também traduzem risco cardiovascular. É o caso da viscosidade sanguínea,^6,7 cujo valor é definido por condições físicas (temperatura, fluxo sanguíneo e forças de atrito) e pela composição sanguínea (concentração e capacidade de deformabilidade e de agregabilidade dos GV, número de leucócitos, concentração de lípidos).
A localização típica das lesões ateroscleróticas em zonas de turbulência e também de maior estase sanguínea, é sugestiva da importância de uma interacção próxima das células e dos seus produtos de activação no processo aterogénico.³⁹ A progressão da lesão aterosclerótica, com estreitamento do lúmen vascular acentuará a turbulência e estase nestas zonas, bem como a interacção de células e dos seus produtos de activação.
Sendo os neutrófilos células de reduzida capacidade de deformabilidade, um aumento do número de neutrófilos circulantes contribuirá para aumentar a turbulência e estase sanguínea a nível das lesões ateroscleróticas, sobretudo em caso de redução do lúmen vascular. A presença de eritrócitos senescentes ou lesados, com uma maior rigidez de membrana e menor capacidade de deformabilidade, terão um impacto hemorreológico semelhante. Acresce que ao processo de senescência eritrocitária é também atribuído uma redução do ácido siálico e a exposição de fosfolípidos acídicos no folheto lipídico exterior da membrana do GV,⁴⁰ que determinam uma maior adesividade da célula ao endotélio vascular e maior agregabilidade dos eritrócitos.
Em conclusão, o neutrófilo e seus produtos de activação, com um papel activo e reconhecido no processo aterogénico, parece constituir um agente de lesão eritrocitária, determinando modificações cumulativas a nível da membrana do GV, que marcam prematuramente a célula para a morte, e que se traduzem numa redução da capacidade de deformabilidade da célula. As modificações hemodinâmicas decorrentes de um aumento de leucócitos e de GV menos deformáveis, de maior adesividade e mais agregáveis, devem favorecer o processo aterogénico por facilitar a interacção dos diversos intervenientes neste processo.
Propõe-se o estudo do eritrócito como um potencial marcador cumulativo de risco, nomeadamente a avaliação do valor de hemoglobina ligada à membrana e o perfil da proteína banda 3. Propomos ainda como potenciais marcadores de risco o valor de neutrófilos circulantes e dos seus produtos de activação – elastase e lactoferrina.
Los autores no manifiestan conflictos.

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