NEW APPLICATIONS OF THE COLORIMETRIC ASSAY TO DETECT BACTERICIDAL ANTIBODIES AGAINST NEISSERIA MENINGITIDIS SEROGROUPS B AND C

Abstract
Colorimetric serum bactericidal assay (cSBA) expose live bacteria (Neisseria meningitidis) to the action of antibodies in the presence of complement producing bacterial lisis. Subsequent addition of a culture medium containing glucose and a pH indicator allows the titer detection either visual or spectrophotometrically. This assay previously standardized and validated is now applied to the screening of sera as complement sources allowing the evaluation of a large number of samples and an easy identification of candidates. Moreover, two ways to store complement (freezing at -70^o C and lyophilization) were compared. Ten samples were evaluated obtaining the titer (previously known) or ± 1 dilution for each one when were titrated with the complement either frozen or freeze-dried. Conclusions: cSBA showed to be very useful to identfy complement sources, allowing also the use of freeze-dried complement which is an important advantage for this kind of assay.

Key words
Bactericidal activity, Neisseria meningitidis, complement sources

Artículo completo
Introducción
La actividad bactericida del suero es considerada correlato de protección natural contra la enfermedad meningocócica según los estudios clásicos realizados en 1969 por Goldschneider y col.¹ Estos estudios demostraron que la presencia de anticuerpos bactericidas en el suero de humanos brinda protección contra esta enfermedad. Por ello, la actividad bactericida ha constituido un elemento de especial interés en el estudio de la respuesta inmune inducida por vacunas antimeningocócicas.²
El ensayo bactericida del suero (EBS) ofrece una medida de la capacidad funcional de los anticuerpos, en conjunto con el complemento, para lisar bacterias. Un EBS exitoso se basa en crear las condiciones en las que el anticuerpo reconozca los antígenos expuestos en la superficie bacteriana y una al complemento (activación clásica), resultando en bacteriólisis y muerte del organismo diana. Los resultados generados por un EBS dependen de la fuente, calidad y actividad del complemento y de las características de la cepa, particularmente de la expresión de los antígenos diana fundamentales.^2-4
Los ensayos usados actualmente para la detección de anticuerpos bactericidas son trabajosos y la mayoría no están estandarizados. Sus dificultades radican fundamentalmente en lo engorroso del plaqueo y conteo de viables para la titulación. Estos factores, además de limitar el número de muestras a evaluar en un ensayo, le aportan un alto nivel de subjetividad a los resultados, ya que éstos dependen completamente de la apreciación humana.
Con la intención de facilitar y optimizar la realización de este ensayo se han desarrollado nuevos protocolos. Por ejemplo, Kriz y col. describieron en 1999 una modificación del microensayo bactericida tradicional usando cloruro de trifeniltetrazolio en solución como indicador para visualizar los resultados.⁵ Más recientemente, Mountzouros y Howell, en 2000, describieron un EBS basado en fluorescencia para el serogrupo B de N. meningitidis.⁶ La introducción de un EBS que elimine las dificultades de los ensayos tradicionales y permita disminuir las diferencias entre laboratorios continúa siendo un problema a resolver para la investigación de vacunas contra N. meningitidis.
Un novedoso EBS colorimétrico (EBSc) (figura 1) basado en la capacidad de N. meningitidis para consumir glucosa y producir ácido es nuestra opción para evadir el engorroso procedimiento de contar colonias, característico de los EBS tradicionales.^7,8 En este trabajo comentamos la aplicación del EBSc a la selección rápida y masiva de nuevas fuentes de complemento así como el empleo de complemento liofilizado, lo cual permite obtener resultados más reproducibles al contar con un amplio lote de complemento que se puede conservar durante varios años.

Figura 1. Ensayo bactericida del suero colorimétrico (EBSc). Basado en la adición de glucosa y un indicador de pH en el medio de cultivo luego de la reacción bactericida. Los pozos azules significan actividad bactericida y los pozos verdes significan crecimiento bacteriano.

Materiales y métodos
Todos los pasos del EBSc fueron realizados en un gabinete de seguridad biológica.
Preparación del antígenoEn este ensayo se usó como antígeno la cepa N. meningitidis serogrupo B Cu 385-83 (B:4:P1.19.15;L3,7,9), conservadas en leche descremada (Oxoid Ltd, Basingstoke, Hampshire, Reino Unido) a -70^ºC en múltiples alícuotas. El día anterior a la realización del ensayo se tomó una alícuota congelada y sembró la cepa por agotamiento para obtener colonias aisladas en placas de ágar Mueller-Hinton (Oxoid) suplementado al 10% con suero bovino fetal (SBF) (Sigma) y el inhibidor vancomicina-colimicina-nistatina (VCN) (bioMerieux SA, Marcy I'Etoile, Francia) (MH-SBF-VCN); las placas se incubaron toda la noche a 37°C en 5% de CO₂. Una colonia aislada fue transferida a una placa del mismo medio previamente atemperada e incubada durante 4 horas a 37°C en 5% de CO₂.
Las células se recogieron con solución salina fisiológica de pH 7.2-7.4 y la suspensión celular se ajustó espectrofotométricamente a una DO en un rango entre 0.5-0.55 leído a una longitud de onda de 600 nm.
Diluciones del anticuerpo
Las muestras de suero a titular se diluyeron en placas de microtitulación (Costar, Inc., Cambridge, Mass. EE.UU.) desde 1/2 hasta 1/4 096 en solución salina de Hanks balanceada (Flow Laboratories, Irvine, Reino Unido) conteniendo 0.1% de seroalbúmina bovina (Sigma), pH 7.2 (SSHB-BSA). Se titularon diez muestras de sueros provenientes de adultos jóvenes vacunados con VA-MENGOC-BC^®, vacuna cubana antimeningocócica.
Preparación del complementoSe empleó suero humano, carente de actividad bactericida intrínseca como fuente de complemento para titular suero humano.
Procedimiento
Se añadieron 12.5 μl por pozo de la suspensión celular, aproximadamente 100 UFC/12.5 μl, en todos los pozos de la microplaca donde previamente se habían realizado las diluciones dobles seriadas del suero. Posteriormente se añadieron 12.5 μl del complemento. Las placas se incubaron a 37°C en atmósfera sin CO₂ durante 30 min. Luego se añadieron 150 μl por pozo de caldo Mueller-Hinton (Oxoid) conteniendo 2% de glucosa (BDH Laboratory Supplies Poole, Reino Unido), 0.002% del indicador de pH púrpura de bromocresol (Fluka Chemika, Suiza) y VCN (bioMerieux SA, Marcy I'Etoile, Francia) (MH-PB-G-VCN).
El indicador de pH se preparó previamente al 1.6% en etanol. El inhibidor VCN se empleó para asegurar la ausencia de contaminaciones que pudieran afectar el resultado de este ensayo. Las placas se incubaron 20 horas a 37°C en 5% de CO₂. El título bactericida de cada muestra de suero fue expresado como el recíproco de la dilución del suero en la que la muerte microbiana fue ≥ 90%, que significa inhibición total del crecimiento bacteriano detectada por la invariabilidad de color del indicador de pH.
Selección de nuevas fuentes de complementoSe evaluaron cuarenta muestras de suero de gazapos (conejos de 3 a 4 semanas de nacidos) puros, como posibles fuentes de complemento. Las mezclas de reacción, tres réplicas para cada suero, se prepararon en placas de microtitulación de 96-pozos (Costar, Inc., Cambridge, EE.UU.). Se adicionaron 100 UFC/12.5 μl de las células diana (N. meningitidis serogrupo C), 25 μl de HBSS-BSA y 12.5 μl del suero candidato a fuente de complemento. Además, en cada placa se incluyeron, tres réplicas de control de suspensión con 100 UFC/12.5 μl de las células diana y 87.5 μl de HBSS-BSA así como tres réplicas con el complemento comercial de gazapos como control positivo. Las placas se dejaron reaccionar a 37°C durante 60 min. Luego de la incubación, se adicionaron 150 μl de caldo MH-PB-G-VCN y se incubó 20 h a 37°C en 5% CO₂. Los sueros se consideraron candidatos a fuente de complemento si la DO en sus réplicas luego de 20 horas de incubación alcanzó niveles similares a la DO del control positivo. La potencia como complemento de cada suero se evaluó titulando un suero control positivo de título conocido. El criterio de aceptación de este ensayo fue que el suero control positivo mostrara su título o ± 1 dilución al ser evaluado con el suero candidato a fuente de complemento.
Resultados
Selección de nuevas fuentes de complemento
El complemento fue seleccionado basándonos en el criterio de que no poseyera ninguna actividad bactericida intrínseca capaz de matar la cepa diana. Diecinueve muestras fueron identificadas como posibles fuentes de complemento para el ensayo bactericida contra la cepa C11 ATCC. Luego de la incubación con MHB-G-BP-VCN la cepa diana en presencia de las 19 muestras seleccionadas alcanzó niveles de crecimiento, medidos en DO, similares a los alcanzados con el control de complemento comercial. Además, se obtuvo el título esperado o ± 1 dilución del suero control positivo cuando se evaluó empleando estos sueros como fuente de complemento. Finalmente, los 19 sueros seleccionados fueron unidos homogéneamente y usados como fuente de complemento para el EBSc contra el serogrupo C de N. menigitidis.
Comparación entre complemento congelado y liofilizado
Para determinar el efecto de emplear suero liofilizado como fuente de complemento para el EBSc se titularon 10 sueros con el complemento conservado por congelación o liofilización. Para cada suero se obtuvo el título esperado o ± 1 dilución al ser evaluado con el complemento conservado por ambas formas (tabla 1). La conservación del complemento por liofilización no afectó los resultados del EBSc.

Tabla I. Efecto de usar complemento liofilizado en el EBSc. El título o ± 1 dilución se obtuvo para los diez sueros cuando estos fueron titulados empleando el complemento conservado por congelación o por liofilización. Los resultados son representativos de tres experimentos separados que dieron resultados similares.

Discusion
La detección de actividad bactericida en un ensayo in vitro es muy importante para la determinación de anticuerpos funcionales antimeningocócicos. Existen múltiples evidencias de que los anticuerpos bactericidas del suero confieren protección contra la enfermedad meningocócica, lo cual permite el establecimiento de un criterio serológico de protección. Sin embargo, a pesar de haber transcurrido más de 25 años de investigaciones, aún existen controversias en la selección del método ideal para medir anticuerpos bactericidas.²
El EBSc empleado en este trabajo ha sido recientemente validado, estableciéndose por estudios de laboratorio que el método cumple con los requerimientos de precisión y reproducibilidad que permitirían su aplicación en estudios multilaboratorios.⁸
Un importante paso en la aplicación de un EBS es la identificación y conservación de la fuente de complemento. El EBSc puede ser empleado para tamizar un gran número de muestras de suero como fuente de complemento obteniéndose los resultados más rápida y fácilmente que por conteo de colonias. El formato en placas de 96 pozos permite leer los resultados en un lector de placas facilitando la titulación de forma similar al ELISA. Esto incrementa la certeza de la titulación y facilita la adquisición y análisis de los resultados en computadora.
En los estudios clásicos realizados por Goldschneider y col., el nivel de anticuerpos bactericidas fue medido empleando complemento humano (tanto complemento endógeno como exógeno proveniente de un adulto sano carente de actividad bactericida intrínseca).¹ Sin embargo, el suero de muchos adultos sanos contiene anticuerpos adquiridos naturalmente capaces de reconocer el polisacárido, el lipopolisacárido o las proteínas de membrana externa del meningococo. Esos anticuerpos pueden activar el complemento y evocar la bacteriólisis del meningococo interfiriendo con los resultados del ensayo, por lo que es necesario buscar una fuente de complemento alternativa. Algunos estudios han propuesto el uso de suero de pacientes agammaglobulinémicos no tratados (raros en la población) o la búsqueda de sueros de un gran número de adultos sanos hasta encontrar un donante apropiado carente de actividad bactericida intrínseca.² Otra opción es la sustitución del complemento humano por complemento de gazapos (conejos de 3 a 4 semanas de nacidos). El suero de gazapos carente de actividad bactericida intrínseca puede ser producido en el laboratorio o adquirido comercialmente. Por estas razones fue recomendado como fuente de complemento exógeno en los procedimientos de ensayos bactericidas desarrollados por el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de Atlanta y estandarizado en un estudio internacional multilaboratorios.⁹ Este fue además recomendado por la Organización Mundial de la Salud como fuente de complemento para evaluar respuesta bactericida en sueros de humanos inmunizados con vacunas contra el polisacárido meningocócico.^10-12 Es importante señalar que a pesar de su amplio uso como fuente de complemento existen algunos informes que plantean que el suero de gazapos produce un aumento de los títulos bactericidas obtenidos por EBS tradicionales, lo cual hace controversial actualmente el empleo de esta fuente de complemento.^2,13,14
La aplicación del EBSc a la búsqueda de nuevas fuentes de complemento facilita el proceso de identificación de sueros pudiendo tamizarse a la misma vez un gran número de muestras que pueden ser sueros de gazapos o sueros de humanos provenientes de un banco de sangre.
La conservación del complemento es otro aspecto fundamental en el éxito del EBS. El suero fuente de complemento es usualmente conservado a -70º C y no puede sufrir descongelaciones. La liofilización es un método que podría permitir la conservación del complemento a temperatura ambiente por un tiempo prolongado y su fácil transportación entre diferentes laboratorios. Un hecho interesante es que la liofilización del complemento no introdujo variaciones en los resultados del EBSc corroborado luego de evaluar diez sueros de título conocido con un complemento humano conservado por congelación o liofilización.
En conclusión, el EBSc puede ser usado para tamizar un gran número de muestras como posibles fuentes de complemento, permitiendo una rápida y fácil determinación de los resultados. Además, el empleo del complemento liofilizado confiere gran estabilidad al ensayo debido a la conservación y empleo de una misma fuente de complemento por un largo período de tiempo. Este aspecto, sumado a la previamente demostrada repetibilidad y reproducibilidad del EBSc lo convierten en un método muy conveniente para el establecimiento de estudios multilaboratorios exitosos.
Los autores no manifiestan conflictos.

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