SIMULTANEOUS DETECTION OF THE MECA AND ILES-2 GENES IN COAGULASE-NEGATIVE STAPHYLOCOCCI ISOLATED FROM BRAZILIAN HOSPITALS BY MULTIPLEX PCR

Abstract
Susceptibility to oxacillin and mupirocin was analyzed by different testing methods in clinical CNS isolates. Among 112 CNS strains, 69 (61.6%) were OxaR by the disk diffusion test (DD) and 72 (64.2%) grew on the oxacillin agar screen plate. S. epidermidis and S. haemolyticus presented high rates of oxacillin resistance (75.4 % and 96.1 %, respectively). Twenty four (21.4%) strains were MupR by the DD. The detection of the mecA and ileS-2 genes, determined by multiplex-PCR, showed that 72 (64.2%) CNS strains possessed the mecA gene and 16 (14.3%) possessed the ileS-2. Fifteen of these strains presented the two resistance genes simultaneously. The isolates containing the ileS-2 presented a MIC > 1 024 μg/mL in the E-test, while low-level mupirocin resistance (MICs of 12–16 μg/mL) was observed in strains without ileS-2. The resistances to high and low levels of mupirocin could not be distinguished by DD. The analysis of the MupR S. epidermidis strains by PFGE showed a prevalent profile (80.9%) in hospitals in Rio de Janeiro. This report showed that the multiplex-PCR is necessary to determine accurate rates of resistance to oxacillin and mupirocin in CNS, and will can help in the staphylococcal infections prevention and control policies in Brazil.

Key words
Coagulase-negative staphylococci; mupirocin r

Artículo completo
Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são os patógenos mais freqüentemente isolados em bacteremias hospitalares principalmente naquelas relacionadas ao uso de cateteres ou próteses.¹ A importância dessas infecções está relacionada com a aquisição de multirresistência pelo patógeno, existindo hoje, mais de 70% de amostras clínicas resistentes à meticilina.² A mupirocina (acido pseudomônico A), é um antimicrobiano tópico e tem sido usado na erradicação da colonização nasal por MRSA³ e na prevenção da colonização de cateteres por estafilococos.⁴ Entretanto, amostras de estafilococos resistentes a mupirocina têm sido isoladas após o tratamento com esta droga.⁵ Essas amostras resistentes a mupirocina podem ser divididas em dois grupos: resistentes a baixos níveis (MuL), com CMIs variando de ≥ 8 μg/ml a ≤ 256 μg/ml e amostras resistentes a altos níveis (MuH) com CMIs ≥ 512 μg/ml.⁶ Amostras MuH apresentam o gene ileS-2⁷ e não podem ser eliminadas pela mupirocina.⁸
Nosso grupo recentemente demonstrou a presença dos genes mecA (resistência a oxacilina) e ileS-2 pela técnica de PCR em amostras clínicas de MRSA.⁹ Entretanto, a resistência a ambos antimicrobianos em amostras brasileiras de SCN não foi analisada. A proposta deste estudo foi avaliar a susceptibilidade a oxacilina e a mupirocina em amostras clínicas de SCN por PCR-multiplex e comparar a eficiência dos métodos de susceptibilidade fenotípicos com esta técnica molecular.
Cento e doze (112) amostras de SCN de diferentes espécimes clínicos foram obtidos de pacientes em 10 hospitais brasileiros que utilizavam a mupirocina na descolonização nasal, no período de 1996 a 1999. Foi analisada apenas uma amostra por paciente. A identificação das amostras foi realizada por coloração de Gram, testes da catalase e coagulase e mais 15 testes bioquímicos.¹⁰ O perfil de susceptibilidade a 17 antimicrobianos, incluindo a oxacilina e a mupirocina, foi determinado pelo teste de difusão do disco (DD) de acordo com o NCCLS.^11,12 O resultado do DD para mupirocina foi interpretado conforme.¹³ O método de ágar triagem foi realizado para todas as amostras em ágar Mueller-Hinton (Difco) suplementado com 4% de NaCl e 6 μg/mL de oxacilina (Bristol-Myers Squibb, São Paulo, Brasil) conforme o NCCLS 2000. A resistência a oxacilina foi confirmada pelo crescimento bacteriano na superfície do ágar após incubação por 24 ou 48 h, a 35°C. A CMI para mupirocina foi determinada pelo teste-E (AB Biodisk, Dalvägen, Solna, Sweden) para todas as amostras de acordo com as instruções do fabricante, após incubação a 35°C por 24 h. O método de PCR-multiplex foi realizado para detectar os genes mecA e ileS-2, de resistência a oxacilina e a mupirocina, respectivamente. O DNA foi extraído por lise térmica e a reação foi realizada como descrito previamente.⁹ A relação clonal entre as amostras de S. epidermidis resistentes a mupirocina foi obtida através da técnica de PFGE com a enzima de restrição SmaI conforme descrito por Jorgensen e colaboradores (1993), com modificações.¹⁴ A classificação dos perfis de PFGE foi realizada de acordo com os critérios de Tenover e colaboradores (1995).¹⁵ Na tabela 1 são apresentados os resultados de identificação das espécies de SCN e a comparação da susceptibilidade para oxacilina e mupirocina obtidas pelos testes fenotípicos e PCR.
Tabela 1Entre as 112 amostras de SCN analisadas, 69 (61.6%) foram OxaR pelo DD. Setenta e duas (64.2%) amostras foram resistentes pela placa de triagem com oxacilina e apresentaram o gene mecA pelo método de PCR. Entre as 57 amostras da espécie S. epidermidis, 39 (68.4%) foram OxaR pelo DD. Entretanto, 43 (75.4%) amostras desta espécie apresentaram o gene mecA. Entre as 26 amostras de S. haemolyticus, 25 (96.1%) foram OxaR pelo DD e apresentaram o gene mecA, simultaneamente. Uma amostra de S. hominis, uma de S. saprophyticus e três de S. sciuri foram OxaR pelo DD, mas apenas a amostra de S. saprophyticus não apresentou o gene mecA. Entre as 112 amostras de SCN, 24 (21.4%) foram MupR pelo DD. Pelo teste-E, 16 (14.3%) amostras apresentaram CMIs > 1024 μg/mL, enquanto 8 (7.1%) e 88 (78.6%) das amostras apresentaram CMIs variando de 12 a 16 μg/ml e < 0.064 a 0.38 μg/ml, respectivamente.
Tabela 2A tabela 2 mostra a sensibilidade e a especificidade dos métodos usados na detecção das resistências a oxacilina e a altos níveis de mupirocina. O DD para oxacilina mostrou 4 resultados falso-negativos (sensibilidade = 94.4%) e um resultado falso-positivo (especificidade = 97.5%), enquanto o teste de ágar triagem com oxacilina mostrou um resultado falso-negativo e um falso-positivo (sensibilidade/especificidade = 98.6%/97.5%). Oito amostras não tiveram o gene ileS-2 amplificado pelo método de PCR, mas foram MuR pelo DD (especificidade = 91.6%). Por outro lado, o resultado do teste-E para mupirocina mostrou 100% de sensibilidade e especificidade.
Tabela 3A tabela 3 mostra as características das 24 amostras de SCN que foram MuR pelo DD, com 21 (87.5%) amostras identificadas como S. epidermidis, duas como S. haemolyticus e uma como S. warneri. Essas amostras foram isoladas entre setembro de 1996 e novembro de 1999 de sete hospitais no Rio de Janeiro, tendo como principal fonte de isolamento o sangue (62.5%). Um perfil de multirresistência a pelo menos sete antimicrobianos foi verificado em 90% dessas amostras, tendo sido 21 dessas amostras OxaR pelo DD. Contudo, 23 dessas amostras possuíam o gene mecA. Os resultados do PCR-multiplex (figura 1) mostraram a presença dos dois genes mecA e ileS-2 em 15 amostras.

Figura 1. Gel dos fragmentos de DNA gerados por PCR-multiplex, mostrando os perfis de resistência a oxacilina (gene mecA 154bp) e mupirocina (gene ileS-2 237bp) entre amostras de SCN, linha 1: marcador de peso molecular (100pb ladder); linha 2: amostra controle OxaS e MupS (ATCC 25923); linha 3: amostra controle OxaR e MupS (ATCC 33591); linhas 4-8: amostras clinicas OxaR e MuH (números 56, 62, 63, 68 e 72); linha 9: amostra clínica OxaR e MuL (no 16); linha 10: amostra clínica OxaS e MuH (no 88).

Entre as 24 amostras MupR, 16 (66.6%) foram MuH, com CMIs > 1024 μg/ml, enquanto as outras amostras apresentaram CMIs variando de 12 a 16 μg/ml (MuL). Todas as amostras MuH apresentaram o gene ileS-2, mas este gene não foi detectado nas amostras MuL. Entre as 21 amostras de S. epidermidis MupR, seis perfis de PFGE foram observados (A, B, C, D, E e F) (tabela 3; figura 2). Dezessete (80.9%) amostras pertenciam a dois perfis de PFGE mais freqüentes: 10 amostras pertenciam ao clone A (subtipos A1, A2, A3, A4 e A5) e sete amostras pertenciam ao perfil B (subtipos B1, B2, B3, B4 e B5).

Figura 2. Perfil de PFGE de amostras de S. epidermidis resistentes a mupirocina. M: marcador de peso molecular (48,5 kb - 1.018,5 kb); perfil A (amostras 16, 29, 117, 62, 63, subtipo A1; amostras 27, 25, 127, 119 e 172; subtipos A2, A3, A4, A5 e A6, respectivamente); perfil B (amostra 106, subtipo B1; amostras 55, 72, 86, subtipo B2; amostras 53, 54 e 200; subtipos B3, B4 e B5, respectivamente); perfil C (amostra 28); perfil D (amostra 56); perfil E (amostra 148); perfil F (amostra 68).

As amostras do perfil A foram isoladas em cinco dos sete hospitais na cidade do Rio de Janeiro. Entre as amostras MuH, o perfil B foi o mais freqüente, enquanto que o perfil A foi prevalente entre as amostras de S. epidermidis MuL. A importância médica dos SCN vem aumentando devido a aquisição de resistência a oxacilina, sendo S. epidermidis e S. haemolyticus as espécies mais freqüentemente associadas a essas infecções, apresentando alta freqüência de resistência a oxacilina.^16,17 Neste estudo, 50.8% das amostras foram identificadas como S. epidermidis e 23.2% como S. haemolyticus, mostrando taxas de resistência a oxacilina de 75.4% e 96.1%, respectivamente, confirmando esses relatos. Um aumento substancial na freqüência de resistência a oxacilina entre amostras de SCN tem ocorrido na última década. Mais de 70% das amostras de SCN tem mostrado resistência a esta droga, requerendo assim agentes terapêuticos potencialmente mais tóxicos e mais caros para o tratamento.² Além disso, o perfil de multirresistencia apresentado pelas espécies de SCN confirma o papel desses microrganismos como reservatórios de genes de resistência nos ambientes hospitalares.
Neste estudo nós usamos uma combinação de métodos fenotípicos e molecular pra detectar resistência a oxacilina e a mupirocina entre amostras hospitalares de SCN. A amplificação dos genes mecA and ileS-2 por PCR foi usado como "gold standard" para OxaR e MuH. Entre as 112 amostras clínicas de SCN, 64.2% possuíam o mecA, enquanto que 61.6% foram OxaR pelo DD e 64.2% cresceram sobre o ágar triagem com oxacilina. O DD para oxacilina foi o método que mostrou menor sensibilidade (94.4%) em relação aos demais testes, quatro amostras de S. epidermidis mecA-positivas foram susceptíveis a oxacilina por este método. Este fato já vem sendo relatado e pode estar relacionado com um fenótipo de heterorresistência a oxacilina ou a ausência da expressão do gene mecA nessas amostras.¹⁸
Embora o NCCLS, 2000 (5th ed; M7-A5) não recomende mais o uso do ágar triagem com oxacilina para SCN, alguns autores têm comparado este teste com outros métodos fenotípicos, mostrando que este método é sensível e que pode ser usado como um teste confirmatório da resistência a oxacilina em laboratórios de rotina, após incubação por 48 h. Nossos resultados mostram que o agar triagem com oxacilina foi rápido, barato e mais sensível do que o DD para detecção de amostras de SCN OxaR. Os SCN são membros da microbiota normal da pele humana, mas também são freqüentes em infecções associadas com cateteres e próteses.¹⁹ Com isso, o controle desses infecções com mupirocina tópica tem sido indicada.²⁰ Entretanto, vários estudos têm mostrado que o uso contínuo de mupirocina está associado com aumento da taxa de resistencia.^5,21
Alguns trabalhos têm mostrado que o nível total de resistência a mupirocina varia de 3.9% to 38% (1.6% a 23.6% MuH) entre S. aureus 5,8 e de 12.8% a 19.5% (6.6% a 32.7% MuH) entre amostras de SCN.^21,8 Nossos resultados mostram que 21.4% das 112 amostras de SCN foram MupR pelo DD, enquanto 66.6% delas possuíam o gene ileS-2 (MuH). A prevalência de resistência a mupirocina entre amostras de SCN e a alta proporção de amostras MuH confirmam este grupo de microrganismos como importantes reservatórios de genes de resistencia.⁷ A determinação do tipo de resistência a mupirocina se alta (MuH) ou baixa (MuL) é importante para garantir uma descolonização eficiente, já que as amostras MuH não podem ser erradicadas pela droga.²² Porém, amostras MuL podem ser mortas por mupirocina tópica, evitando assim a disseminação de estafilococos multirresistentes no ambiente hospitalar.
Neste estudo, o DD não foi capaz de diferenciar as amostras MuH daquelas MuL, já que todas as amostras MupR, com exceção de uma, mostraram um crescimento confluente ao redor do disco de mupirocina. Alguns estudos têm determinado a CMI pelo teste-E ou por métodos convencionais para diferenciar estas amostras.^5,21 Nossos resultados mostraram que as amostras que foram MuH pelo teste-E apresentaram o gene ileS-2, enquanto todas as amostras que apresentaram CMIs entre 12–16 μg/ml (MuL) não apresentaram este gene pelo PCR, confirmando os dados de Nunes et al. (1999).⁹ Amostras MuH parecem ser menos freqüentes em comparação com amostras MuL.^5,21 Entretanto, neste estudo, 66.6% das amostras MupR foram MuH. Este fato reforça as recomendações acerca do uso da mupirocina, que deve ser cauteloso na prevenção de infecções por estafilococos resistentes a oxacilina. Com a emergência contínua de ambos os tipos de resistência a mupirocina, a identificação acurada da amostra se torna importante para a epidemiologia hospitalar.²³
Nossa análise por PFGE, focalizando a população de 21 amostras de S. epidermidis MupR (8 amostras MuL e 13 MuH) mostrou que 80.9% pertenciam a dois perfis de PFGE, A e B. Além disso, 76.9% das amostras que apresentaram resistência a altos níveis de mupirocina pertenciam a um dos perfis de PFGE que parece ser prevalente em hospitais do Rio de Janeiro²⁴ e que foram relacionados à resistência a oxacilina. Este fato merece atenção, já que a disseminação hospitalar de um ou poucos genótipos apresentando resistência a altos níveis de mupirocina pode impedir o uso tópico da droga como meio de controlar estafilococos OxaR em um hospital.³
Concluindo, o PCR-multiplex apresentado aqui permite a detecção genotípica das resistências a oxacilina e a mupirocina em SCN, assim como em S. aureus, como descrito previamente.⁹ A identificação rápida destas resistências pelo PCR pode ajudar a controlar o uso desnecessário destes antimicrobianos nos hospitais. Além disso, este método é confiável e pouco oneroso, sendo de extrema importância para a detecção destas resistências em amostras estafilocócicas.
Los autores no manifiestan conflictos.

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